Abstract

Apesar das recentes melhorias nos resultados de pacientes, utilizando inibidores da via mais recentes receptor de andrógeno (AR), resistência ao tratamento no câncer de próstata resistente à castração (CRPC) continua a ser um problema clínico. -Direccionamento Co vias de resistência alternativas são de interesse significativo para tratar CRPC e retardar o aparecimento de resistência. Tanto a AKT e vias de sinalização MEK se tornar ativado como o câncer de próstata se desenvolve resistência a terapias alvo-AR. Este estudo pré-clínico explora co-alvo dessas vias em modelos de câncer de próstata AR-positivo. Usando vários

in vitro

modelos de estados de doença do câncer de próstata, incluindo câncer de andrógeno-dependentes (LNCaP), CRPC (V16D e 22RV1) e resistentes a ENZ próstata (MR49C e MR49F), avaliamos a relevância da segmentação tanto AKT e vias de MEK. Os dados revelam que a inibição de AKT induz apoptose e inibe o crescimento celular em linhas celulares de PTEN nulo independentemente da sua sensibilidade à terapia hormonal; No entanto, a inibição de AKT não teve qualquer efeito na linha celular positiva 22RV1 PTEN. Curiosamente, descobrimos que a inibição de MEK teve maior efeito sobre 22RV1 células em comparação com LNCaP, V16D ou resistentes ENZ células MR49C e células MR49F.

In vitro

, AKT combinação e bloqueio MEK tinham evidência de sinergia observada em algumas linhas celulares e ensaios, mas isso não foi consistente em todos os resultados.

In vivo

, a combinação de inibição de AKT e MEK resultou na inibição do crescimento do tumor mais consistente de xenoenxertos MR49F e sobrevivência mais específico da doença em comparação com a monoterapia inibidor de AKT. Como no nosso

in vitro

estudo, 22RV1 xenoenxertos foram mais resistentes à inibição AKT enquanto eles eram mais sensíveis à inibição de MEK. Os nossos resultados sugerem que a segmentação AKT e MEK em combinação pode ser uma estratégia terapêutica valiosa no cancro da próstata, quando ambas as vias são activados e suportam ainda mais a importância de se caracterizar a via dominante oncogénica em tumor de cada doente, a fim de seleccionar a terapia óptima.

Citação: Toren P, Kim S, Johnson F, Zoubeidi a (2016) Combinada AKT e MEK Pathway Blockade em modelos pré-clínicos de cancro da próstata enzalutamida-resistente. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10.1371 /journal.pone.0152861

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 07 de outubro de 2015; Aceito: 20 de março de 2016; Publicação: 05 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Toren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o financiamento foi fornecido pelo Discovery Grant, Prostate Cancer Canadá e AstraZeneca para A. Zoubeidi. PT foi apoiado pelo Canadian Foundation Urological Association Scholarship. AstraZeneca estava envolvido em discussões sobre o desenho do estudo e revisão do manuscrito, mas a recolha de dados e análise e decisão de publicar foi feito pelos autores. Os outros financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. AZ divulga que recebem financiamento da investigação da AstraZeneca e Gilead Sciences. PT divulga a receber financiamento para pesquisa da Innocrin Pharma. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Médico ou castração cirúrgica continua a ser a primeira linha de terapia sistêmica para o câncer de próstata metastático (APC), uma vez sua descoberta mais de 70 anos [1]. Infelizmente, a cura permanece castração seguinte evasivo e pacientes inevitavelmente evoluir para desenvolver câncer de próstata resistente à castração (CRPC). potentes inibidores da via do receptor de androgénio (AR), como enzalutamida (ENZ) e abiraterona são agora vulgarmente utilizados no tratamento de pacientes com CRPC. Embora a sobrevivência é melhorada, a resistência, no entanto, inevitavelmente, se desenvolve a esses agentes [2]. Prevê-se que com o aumento da utilização clínica destes via AR mais inibidores potentes do que as abordagens direccionados contra vias de resistência não-AR accionados vai ganhar importância crescente [3]. Portanto, a compreensão e as vias de segmentação implicada na resistência tem importante relevância clínica.

O PI3K /AKT /mTOR e RAF /MEK /ERK vias de sinalização desempenham um papel importante na sobrevivência das células, resistência ao tratamento, e cooperar para facilitar CaP progressão para CRPC [4-8]. Ambos AKT [9, 10] e ERK [11, 12] vias de sinalização são regulados positivamente com CRPC e estão associados com mau prognóstico [13, 14]. Existe extensa conversa cruzada entre estas duas vias, bem como com outras vias oncogénicos [15, 16]. Temos anteriormente mostraram que tanto AKT e ERK são activadas a seguir ao tratamento com ENZ em células CaP [17]. Segmentação AKT por si só não é suficiente para induzir letalidade condicional devido o feedback sinalização levando a ativação de AR e, portanto, alvo AKT por si só não é uma boa estratégia para combater a resistência ENZ [18]. Curiosamente, a inibição dual da PI3K /AKT e vias MEK /ERK tem se mostrado promissora em modelos pré-clínicos de outros tipos de câncer [19-22]. Os resultados da combinação de um inibidor de mTOR com um inibidor da MEK na transgénico

NKx3

.

1-PTEN

modelo de cancro da próstata de murideo apoia ainda mais a razão para uma abordagem combinada no cancro da próstata [14] terapia.

Portanto, partimos para investigar AKT combinação além de terapia com inibidor MEK em modelos de câncer de próstata humanos, em particular modelos de câncer de próstata resistentes ENZ. Nós seleccionado um painel de linhas celulares, incluindo linhas celulares derivadas de LNCaP-ENZ resistentes, bem como a linha de células 22RV1. A linha celular de cancro da próstata 22RV1 possui a activação da via de MEK /ERK [23], enquanto que o MR49C resistentes-ENZ e MR49F são reconhecidos para ser mais dependente da Akt [24]. Nós demonstramos que a combinação de bloqueio da AKT e MEK não melhorar as respostas em comparação com monoterapia em alguns dos ourin

in vitro Comprar e

In vivo

experimentos câncer de próstata. Notavelmente, os resultados variam consideravelmente entre os sistemas de modelo com a ausência de benefício adicional em alguns casos, destacando a necessidade de identificar adequadamente quais pacientes irão beneficiar mais de uma abordagem combinada.

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro da próstata

O câncer de próstata humano LNCaP e 22RV1 linhas de células utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pelo Dr. Leland WK Chung [25] (1992, MDACC, Houston TX). V16D (castrar resistentes), e células MR49F MR49C (enzalutamida resistentes) foram derivadas através de série passagem de xenoenxerto de células LNCaP como previamente descrito [26] (Figura S1). Resumidamente, as células LNCaP foram injectados a ratinhos e quando o PSA do soro atingiu 50 ng /ml ratinhos foram castrados. Quando o PSA atingiu novamente 50 ng /ml 5-6 semanas mais tarde, os tumores foram chamados resistentes castração. V16D células foram derivadas a partir de um xenoenxerto de LNCaP resistente à castração. Os tumores foram excisados ​​e as linhas celulares foram geradas em meios isentos de androgénio. Para MR49C e linhas celulares MR49F, quando xenoenxertos de LNCaP atingiu o estado de resistência à castração, eles foram tratados com 10 mg /kg de ENZ com um declínio de PSA subsequente para valores baixos no soro. Quando o soro PSA voltou para níveis de castração resistentes ou superior, os tumores foram chamados resistentes ENZ. Estes tumores foram então passada 3 vezes em ratos castrados tratados com ENZ e linhas celulares foram geradas. As células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C em 5% de atmosfera de CO2, com 10 uM ENZ adicionado a todos os meios e as células para MR49C MR49F.

Reagentes

O AZD5363 inibidor AKT foi fornecido pela AstraZeneca (Macclesfield, Reino Unido). ENZ foi adquirido a partir de Xangai Haoyuan Chemexpress (Xangai, China), PD0235901 de Selleck Chem (Houston, TX) e LY294002 e UO126 a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). LY294002 é um inibidor de PI3K reversível; AZD5363 é um inibidor da pan-AKT competitivo [27]. PD0325901 é um inibidor competitivo MEK1 /2, enquanto UO126 inibe MEK1 /2 in, de forma seletiva não-competitivo [28]. Foram preparadas soluções de reserva de AZD5363, PD0235091, UO126 e LY294002 em sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma-Aldrich); ENZ foi preparado em H

2O.

ensaios de proliferação celular

A viabilidade celular foi avaliada em placas de cultura de 96 poços utilizando o reagente WST-1 e /ou um ensaio de violeta cristal, tal como descrito anteriormente [26].

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular, com coloração com iodeto de propídio foi efectuada como previamente descrito [29]. conteúdo de DNA Relativa foi analisada pelo fluxo FACS Canto II citômetro usando o software cyflogic v1.2.1 (www.cyflogic.com) para análise.

Caspase-3 atividade ensaio

Caspase-3 atividade foi avaliada utilizando o estojo de Ensaio de Caspase 3, com a acetil-Asp-Glu-Val-Asp 7-amido-4-metilcoumarina (Ac-DEVD-AMC) substrato fluorimétrico (Enzo Scientific). Trinta microgramas de lisado de células inteiras foi incubada com substrato de caspase-3 AC-DEVD-AMC a 37,5 ° C durante 2,5 h e a actividade da caspase-3 foi quantificada com um fluorómetro com excitação fixado em 365 nm e 460 nm de emissão. Dobre diferenças de mudança de controle foram calculadas de acordo com a subtração de leituras de poços em branco, sem lisado.

análise de Western blot

As proteínas totais foram extraídas em tampão RIPA, como descrito anteriormente [29]. 30-50 ^ g de lisado de proteína foi separada por SDS-PAGE e Western blot foi realizada usando anticorpos primários PSA, AR (Santa Cruz Biotechnology), vinculina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PARP, p-AKT Ser473 , AKT, p-ERK, ERK total, o S6 total e p-S6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Detecção de anticorpos secundários foi realizada utilizando o sistema de imagiologia IR Odyssey (LI-COR Biosciences) ou ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA).

quantitativa de transcrição reversa (RT) -PCR

extracção de ARN e RT-PCR foram realizados como previamente descrito [30]. monitoramento em tempo real de amplificação por PCR de cDNA foi realizada utilizando os seguintes pares de primers e sondas:

AR

(Hs00171172_m1),

PSA

(Hs00426859_g1), e

GAPDH

(Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) sobre o Sistema de Detecção ABI PRISM 7900 HT Sequence (Applied Biosystems) utilizando Gene Expression TaqMan Mestre Mix (Applied Biosystems). expressão do gene alvo foi normalizado para

níveis de GAPDH

nas respectivas amostras como um controlo interno.

tratamento animal

de seis semanas de idade macho castrado ratos atímicos (Harlan Sprague-Dawley, Inc.) foram injectados subcutaneamente com 2×10

6 (MR49F células em suspensão em 0,1 ml de Matrigel; BD Biosciences) em ambos os flancos. Nove ratos por braço foram randomizados para veículo (0,1% de metilcelulose), AZD5363 100 mg /kg BID, PD0325901 5mg /kg OD ou a combinação. ENZ 10 mg /kg foi administrada antes da inoculação e continuaram até os tumores atingiram 200 milímetros

3. As medições do tumor foram medidos quinzenalmente e volume tumoral calculado utilizando a fórmula L x W x d x 0,5236. As drogas foram administradas como uma sonda oral no dia 5, 2 fora. Os níveis de PSA foram medidos semanalmente usando imunoensaio enzimático automatizado (Cobas, Montreal, Quebec, Canadá). Os ratinhos foram sacrificados, se a carga total do tumor era 2,000 milímetros

3 ou tinha 20% de perda de peso corporal. Para os xenoenxertos 22RV1, 2×10

6 células foram inoculados no flanco esquerdo de ratinhos nus de castração. Oito ratos por braço foram randomizados para veículo, AZD5363 100mg /kg BID, selumitinib (AZD6244; ARRY-142886) 25 mg /kg BID, ea combinação. Os 22RV1 xenoenxertos foram sacrificados quando o volume do tumor foi 1500 milímetros

3. Todos os ratos foram monitorados regularmente para sua condição clínica sob a supervisão de um veterinário da Universidade de British Columbia. No momento do sacrifício, todos os ratos foram profundamente anestesiados com isoflurano antes de serem sacrificados com CO2. Os tumores colhidos na altura do sacrifício foram divididos em partes e congeladas rapidamente em azoto líquido ou fixadas em formalina. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes Canadian Council on Animal Care e com a aprovação do Comité de Cuidados com Animais da Universidade de British Columbia (protocolo nº A12-0210).

Imunohistoquímica

Um tecido micromatriz de todos os tumores de xenoenxerto MR49F foi construído usando um tecido microarrayer manual (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). coloração imuno-histoquímica foi realizada como previamente relatada [31]. Todas as comparações das intensidades de coloração foram realizados com ampliação de 20x em amostras em triplicado por um patologista cego para atribuição do tratamento.

A análise estatística

Todos os resultados são expressos como a média ± SEM, com ANOVA one-way usada para detectar diferenças significativas entre os vários tratamentos. Quando a ANOVA mostrou diferenças significativas (p 0,05), teste de post-hoc HSD de Tukey foi utilizado para comparar as médias. a velocidade de crescimento do tumor foi calculada utilizando regressão linear. análise de sobrevivência Kaplan Meier sobrevivência de câncer em comparação específica (CSS) e sobrevida global, com o teste de log-rank utilizado para comparar os grupos. CSS foi definido como o tempo do início do tratamento até que o volume total do tumor excedeu 2.000 milímetros

3 e sobrevida global como o tempo desde o início do tratamento até o sacrifício. O índice de combinação (Cl) foi calculada utilizando o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). A CI 1 indica sinergia, a CI 1 indica interações antagônicas

Resultados

Efeito da segmentação MEK e AKT percursos na AR via de sinalização

Para investigar a. relevância da AKT e as vias de MEK em APC, nós alvo respectivos percursos usando AZD5363 (inibidor AKT) e PD0325901 (MEK inibidor). Foram avaliados os seus efeitos por si só e em combinação, em modelos de diferentes fases do cancro da próstata, incluindo células sensíveis de androgénio (LNCaP), castrar células resistentes (V16D, 22RV1) e resistentes-ENZ (MR49C e MR49F) (Figura 1). Bloqueio AKT com AZD5363 foi avaliado pelo seu efeito sobre a jusante AKT efectora p6SK e não sobre a fosforilação de AKT-se por causa da natureza de AZD5363. Basicamente, AZD5363 induz a fosforilação aumentada de AKT que é inactivo, um fenómeno ocorre com muitas ATP inibidores competitivos, catalíticas de AKT, e é devido à proteína que está sendo realizada em uma forma hiperfosforilada mas cataliticamente inactivo como uma consequência da ligação composto tal como foi estabelecido anteriormente . AZD5363 foi encontrada para induzir uma diminuição na fosforilação S6K em todas as linhas celulares; este efeito foi mais pronunciado na PTEN células nulas MR49C, MR49F, LNCaP e células V16D em comparação com as células positivas 22RV1 PTEN (Fig 1). Efeitos semelhantes foram observados utilizando outro inibidor de MEK (UO126) e inibidor de AKT (LY294006) ou em combinação com Ay (Figura 1, Fig S2). Em 22RV1 células, PD325901 anula completamente a fosforilação de ERK, enquanto AZD5363 não teve efeito sobre a fosforilação de AKT jusante efectora S6K que foi apenas com a combinação de AZD5363 e PD0325901 (Fig 1). No entanto, nenhum decréscimo adicional nos níveis de vantagem foi observada com a combinação em comparação com monoterapia com inibidores da MEK. Além disso, observou-se que a inibição de AKT aumentou tanto AR e PSA em níveis de RNA e proteína em células LNCaP e seus derivados (Fig 1). Embora AZD5363 AR aumentada e os níveis de PSA em todas as linhas de células, o efeito da PD0325901 em Ar e PSA níveis isoladamente ou em combinação com AZD5363 variou entre as linhas celulares (Fig 1). Em contraste com as linhas celulares com base em LNCaP, PSA foi ainda aumentada pela combinação de AZD5363 e PD0325901 em 22RV1 células. Notavelmente, estes resultados dados espelhados semelhantes com a combinação anteriormente testados com êxito de AZD5363 e ENZ onde as alterações na expressão de AR também diferiam entre 22RV1 e linhas de células à base de LNCaP (Fig S2) [32]. Tomados em conjunto, podemos concluir que AKT e MEK cooperar para regular a via AR.

(A) Efeito da AKT e MEK inibição de vias de sinalização a jusante. Andrógeno linha celular dependente de CaP de LNCaP, CRPC (V16D e 22RV) e linhas de células resistentes ENZ MR49C, as linhas celulares foram tratadas com MR49F AZD5363 1 uM, 20 uM PD0325901 sozinho ou em combinação, durante 48 horas. As proteínas totais foram extraídas e transferências de Western foram realizadas utilizando AR, PSA e PI3K /AKT via de sinalização de proteínas, tal como indicado. borrões representativas dos experimentos duplicados são mostrados. (B-C) Efeito de inibição de AKT e MEK na via de AR. MR49C, linhas celulares MR49F 22RV e foram tratados com AZD5363 1 uM, 20 uM PD0325901 sozinho ou em combinação, durante 48 horas. O ARN foi extraído a partir de diferentes linhas celulares e quantitativo em tempo real foram realizados utilizando sondas Taqman para AR (B) e AR PSA gene alvo (C). Os resultados representativos de cópias biológico com triplicados técnicas são mostrados.

Efeito da combinação de MEK e bloqueio de AKT na apoptose celular e proliferação

Para determinar a actividade biológica de direccionamento sinalização AKT e MEK vias de apoptose de células, foram tratados nosso painel de linhas celulares com AZD5363, PD0325901 ou a combinação. Nossos dados mostraram que a combinação de segmentação AKT e MEK induz a apoptose como mostrado pela população ciclo celular aumentou sub G0 /G1. Este efeito foi maior do que AZD5363 monoterapia em células CRPC V16D (17% versus 10%, P = 0,009) e MR49C resistente ENZ (29% vs 12%, p = 0,005) e MR49F (12% vs 3%, p = 0,006 ) células. Nenhum dos tratamentos apresentaram quaisquer alterações significativas na fração sub G1 /G0 em 22RV1 células (Figura 2). Em contraste, em células LNCaP sensíveis-andrógenos, a terapia de combinação de tratamento não mostraram mais indução de sub G1 /G0 comparado com monoterapia com AZD5363 (17% vs 16%, p = 0,76). Fase S e G2 /M frações pareceu diminuir a um montante semelhante em MR49C, as células MR49F e V16D com AZD5363 ou a combinação, com diferenças significativas para ambos os tratamentos de controle (P 0,001). Além disso, AZD5363 e combinação PD325901 tratamento induziu PARP clivada em linhas de células à base de LNCaP em comparação com as células positivas PTEN 22RV1 células (Figura 2). Embora não seja estatisticamente diferente, tendências semelhantes foram observados com caspase 3 ensaios de actividade (Fig 2).

(AE) Prop�io fluxo de iodeto de citometria de análise do ciclo celular de linhas celulares indicadas mostra fração aumentou ciclo celular por apoptose (SubG1 /G0) (painéis da esquerda). Meios de experiências em triplicado são traçados +/- SEM. Os resultados representativos de todas as populações do ciclo celular estão apresentados em painéis à direita. (F) as células indicadas foram tratadas com 1 uM AZD5363, PD0325901 20 �, ou a combinação durante 48 horas. As proteínas foram extraídas e Western blot foi efectuada utilizando anticorpo de PARP, vinculina foi utilizado como um controlo de carga. blots representativos de duas ou mais experiências são mostrados. (L) a actividade da caspase-3 em MR49C, linhas celulares MR49F, 22RV1, LNCaP e V16D tratada com AZD5363 e /ou PD0325901 durante 24 horas. A alteração média +/- SEM de dobra valores reunidos a partir de pelo menos dois duplicados biológicas são mostrados.

A seguir foi investigado se o efeito observado na apoptose celular pode ser traduzido para a viabilidade celular. Os nossos dados mostram que a segmentação AKT utilizando AZD5363 afecta a viabilidade celular em todas as linhas celulares testadas (Figura 3), enquanto que a segmentação MEK usando PD0325901 (Figura 3) ou UO126 (S3 fig) tiveram maior actividade em 22RV1 células em comparação com as outras linhas celulares confirmando ainda mais nossos dados relativos à população do ciclo celular e clivagem PARP. Embora tenhamos observado tendências para uma redução da viabilidade e sinergia com a combinação em comparação com monoterapia em células LNCaP e células V16D, em MR49C e células MR49F a combinação não aparecem sinérgica (Fig 3). Este foi ainda confirmada usando a combinação de inibidor de MEK U0126 com o inibidor de AKT LY294006 em MR49C, células MR49F (S3 FIG). Synergy foi observada em 22RV1 células com um índice de combinação. 1 (Fig 3, S3 Fig)

linhas celulares (AE) MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP e V16D foram tratados com AZD5363 e /ou PD0325901 como indicada durante 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de WST-1. resultados agrupados de triplicados biológicos com triplicatas técnicos são mostrados. índices de combinação são mostrados inserir, com valores . 1 indicando sinergia

Segmentação AKT e as vias de MEK em combinação inibem o crescimento de tumores e sobrevivência específica melhorada câncer

Uma vez que a atividade de terapia de combinação mostraram diferenças relacionadas com a expressão de PTEN, investigamos

in vivo

como alvo AKT e MEK irá influenciar o crescimento do tumor em duas situações clínicas possíveis (tumores PTEN positivos e negativos). Nós usamos células MR49F resistentes-ENZ e CRPC 22RV1 células para avaliar a

in vivo

eficácia da combinação de segmentação AKT e MEK vias.

Os xenotransplantes MR49F foram sensíveis a AZD5363, tornando a avaliação de benefício adicional ao bloqueio MEK desafiando. tratamento de monoterapia com PD0325901, mostraram inibição de crescimento do tumor e demonstrou uma tendência não significativa para a inferior PSA do soro em comparação com veículo (Figura 4). O tratamento de combinação com AZD5363 e PD0325901 nos xenoenxertos MR49F não resultou na maior diminuição no volume do tumor em comparação com AZD5363 monoterapia, mas a combinação tinha a sobrevivência significativamente melhorada cancro específico (CSS) (P 0,001) em comparação com com veículo e de tratamento PD0325901- braços (Fig 4). CSS mediana foi de 17 dias para ratinhos tratados com veículo, 25 dias para ratinhos tratados com PD0325901, e não foi atingido para, quer isoladamente ou em combinação com PD0325901 AZD5363. Nenhuma ratinhos no grupo de combinação foram sacrificados devido ao tamanho do tumor após 35 dias de tratamento. PSA no soro foi significativamente reduzida em tanto o AZD5363 e os braços de tratamento de combinação em comparação com o veículo (Figura 4).

Após estabelecimento de tumores (200mm3) de injecção subcutânea de células resistentes MR49F ENZ em ratos castrados sob a pressão de 10 mg /kg por dia de ENZ, os ratinhos foram tratados com 100 mg /kg, AZD5363 100 mg /kg BID, PD0325901 5 mg /kg QD ou AZD5363 100 mg /kg bid + PD0325901 5mg /kg QD. (A) Os dados representativos de MR49F significa o volume do tumor ao longo de 4 semanas é mostrado. (B) a velocidade de crescimento tumoral médio MR49F para cada grupo de tratamento +/- SEM estimativa calculada utilizando regressão linear da velocidade de crescimento do tumor para cada ratinho. (C) Média MR49F PSA semanal plotados como a mudança vezes a partir de linha de base para cada grupo de tratamento +/- SEM. (D) enredo Cachoeira de medições de PSA individuais após 3 semanas de tratamento para todos os xenotransplantes MR49F no estudo. sobrevida específica do câncer (E-F) de Kaplan-Meier e as curvas de sobrevida global para os braços de tratamento de xenoenxertos MR49F. volume de xenoenxerto (L) Média 22RV1 após tratamento com veículo, AZD5363 100 mg /kg BID, selumetinib 25 mg /kg QD ou AZD5363 100 mg /kg bid + selumetinib QD 25 mg /kg. A alteração média vezes no tamanho do tumor +/- SEM é traçada. (H) Cachoeira lote de volumes tumorais 22RV1 xenoenxerto após 6 semanas de tratamento.

A seguir, avaliou a combinação de AKT e MEK inibição da via usando 22RV1 xenoenxertos em ratos castrados. AZD5363 foi novamente utilizado como um inibidor de AKT enquanto Selumetinib foi escolhido como um inibidor de MEK, que pode ser mais relevante clinicamente, uma vez que é actualmente em avaliação clínica e foi recentemente aprovado para o tratamento do melanoma. Em contraste com o modelo MR49F, 22RV1 tumores foram relativamente insensíveis ao AZD5363, mas fez demonstrar a inibição do crescimento do tumor de ambos Selumetinib e a combinação de Selumetinib mais AZD5363. Com todas 22RV1 tumores em crescimento relativamente robusto, apesar do tratamento, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos de tratamento, embora a maior inibição do crescimento do tumor foi visto com o tratamento combinado (Fig 4)

.

A análise dos volumes de tumor ratos individuais no modelo MR49F sugere que o bloqueio combinado podem beneficiar de um subconjunto de ratos (Fig 5). No braço de AZD5363 monoterapia, enquanto a maioria dos tumores respondeu bem, em alguns casos, a inibição do crescimento do tumor foi mínima. No entanto, no grupo de terapia de combinação, não há valores extremos foram observados (Figura 5). Notavelmente, a coloração imuno-histoquímica dos tumores MR49F demonstraram coloração pERK em ratinhos demonstraram que a resistência à AZD5363 (Fig 5). Nenhuma coloração pERK significativa foi observada nos ratos que responderam ao tratamento (Fig 5), nem eram as diferenças de coloração PS6 ou coloração Ki67 detectada entre o tratamento combinado eo braço AZD5363 monoterapia (Fig 5).

(A) as curvas de crescimento de tumor para todos os ratos individuais no estudo agrupados por tratamento. (B) imunohistoquímica do pERK demonstra níveis detectáveis ​​em 3 camundongos com resistência precoce ao tratamento AZD5363 (superior); 3 outros ratinhos tratados com AZD5363 estão apresentados para comparação (parte inferior). (C) A coloração das amostras de microarray demonstra que pERK coloração positiva foi evidente apenas nestes ratinhos. (D) A proporção de PS6 é diminuída com AZD5363 e em maior extensão com a combinação de AZD5363 + PD0325901. coloração (E) Ki67 como marcador de proliferação. Uma micromatriz de tecido foi construído usando amostras de tumor em cada grupo (7-9 por grupo). escores médios de intensidade da coloração graduada por um patologista cegado são mostrados +/- SEM.

Discussão

Apesar do sucesso da castração e inibidores da via mais recentes potente AR tais como enzalutamida, resistência ao tratamento ocorre em todos os casos. sinalização AR persistente é clinicamente evidente por um aumento do PSA. A persistência de AR-sinalização pode ser conduzido através de vários mecanismos de resistência incluindo variantes de splicing Ar, produção intra-tumoral de androgénios e a activação de vias alternativas que suportam AR sinalização, incluindo a AKT e vias MEK [33]. A terapia de combinação em ACP tem potencial para aumentar a sobrevida do paciente através do bloqueio destas vias de resistência.

experiência clínica precoce em pacientes CaP sugere que a segmentação AKT por si só não é uma estratégia eficaz. Os ensaios clínicos de monoterapia inibidor AKT em CRPC demonstraram um sucesso limitado com esta abordagem [34, 35]. Antes

trabalho in vitro

sugere que a inibição de PI3K /AKT pode resultar no aumento da regulação da /via Raf MEK /ERK [36], e os nossos resultados no modelo de xenoenxerto de MR49F também sugere que este pode ocorrer em alguns casos . A diafonia bem reconhecido entre estas vias proporciona uma base racional para a combinação de ambos estes inibidores [19-22, 37-39]. A experiência clínica com duplo direcionamento de MEK e as vias AKT é limitada; primeiros resultados em doenças malignas avançadas sugere que duplo direcionamento de ambas as vias melhora a eficácia oncológica à custa de maior toxicidade [40].

Nosso estudo destaca as diferenças que podem ocorrer entre os modelos CaP positivos AR e, especialmente, a relevância da PTEN status quando segmentação AKT e MEK vias. Curiosamente, a segmentação da Akt aumento da transcrição de PSA nas células sobreviventes e este efeito, observou anteriormente por outros [41], pode ser importante ter em conta na concepção de ensaios clínicos futuros com estes agentes direcionados desde PSA é comumente utilizado como um marcador de progressão. Nos modelos ENZ-resistente derivado de LNCaP, a inibição de MEK adicionado um benefício modesto em comparação com a inibição de AKT; Curiosamente a sinergia apareceu maior

in vivo

que

in vitro

. Em 22RV1 células, a inibição de MEK só teve impacto significativo sobre a proliferação celular e sinalização, mas a combinação de MEK e inibição AKT demonstrado mínima benefício adicional

in vitro

. Assim, enquanto melhorias na atividade anticancerígena foram anotados por algumas métricas, com a combinação em cada modelo, cada modelo apareceu relativa viciado em AKT e MEK, respectivamente, limitando assim o benefício da terapia de combinação.

Combinado segmentação do MEK e Akt foi investigado em vários outros cancros em modelos pré-clínicos, com resultados de apoio à utilização da combinação [19-22, 37-39]. Em um cancro da próstata pré-clínica

In vivo

estudo, PD0325901 foi avaliado em combinação com o inibidor de mTOR rapamicina [14]. Enquanto não observamos um decréscimo significativo da Ki67 com a combinação, isto pode estar relacionado com a recolha todos os nossos tumores no final do estudo em que ponto os tumores de xenoenxerto eram resistentes ao tratamento. Recentemente, Park et ai, mostraram a combinação de selumitinib e a inibição do crescimento do tumor inibidor da pan-PI3K GSK2126458 melhorada em comparação com a monoterapia, quer em AR-negativo DU145 e PC3 xenoenxertos [42]. No geral, os resultados em modelos AR-negativos são comparáveis ​​com os resultados. Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que a eficácia de direccionamento de AKT e MEK é independente do estado de doença do cancro da próstata e que a eficácia se correlaciona com a activação destes percursos no tumor.

O nosso estudo é limitada por vários aspectos de nossos modelos de câncer de próstata. células LNCaP parecem ser altamente dependente da via de AKT. No entanto, como, linhas de células AR positivas produtoras de PSA com uma via PI3K /AKT activada, eles se parecem com um fenótipo CPRC comum encontrado [43]. Além disso, os nossos modelos ENZ-resistente demonstram vários fenótipos consistentes com doença resistente ENZ clínico, tais como a localização nuclear persistente AR, AR mutação F876L, e supra-regulação de enzimas steroiodogenic [26, 32, 44]. 22RV1 células abrigar variantes de processamento de andrógenos, que prevêem uma pior resposta aos inibidores da AR-pathway [45]. A presença da mutação F876L enzalutamida-agonística e à presença de splicing AR dominante variantes limitado a capacidade para testar a eficácia de inibição de AKT combinadas e MEK em conjunto com inibição da AR em modelos de cancro da próstata avançado. Além disso, enquanto os nossos estudos in vitro não foram realizadas em meios deficientes de androgênio, não está claro se isso resultaria em resultados significativamente diferentes, nomeadamente no que tumores CRPC podem produzir seus próprios andrógenos através de

de novo

síntese caminhos [46] . Assim, nossos resultados em condições de castração

in vivo

não eram substancialmente diferentes.

Em conclusão, os nossos resultados em modelos celulares CRPC resistentes-ENZ sugerem que o tratamento combinado com AKT e inibição de MEK pode ser um combinação racional em um subconjunto de casos de câncer de próstata resistente que necessitam de uma investigação mais aprofundada. Os nossos resultados também sugerem a importância de inibidores de direccionamento para as vias de tumor que são conhecidas por ser activadas; em monoterapia pacientes bem seleccionada pode ser tão eficaz como a terapia de combinação. No geral, este sublinha a necessidade de a selecção racional, orientada para o biomarcador de pacientes como terapêutica alvo são avaliados em ensaios clínicos.

Informações de Apoio

S1 Fig. MR49C células são resistentes à ENZ.

5X10

4cells foram semeadas em placas de 12 poços, em seguida, tratado com diferentes concentrações de ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 uM). Após 72 horas de exposição, meio de cultura mudou meio fresco sozinho (Recuperar) ou com ENZ (continuar). 48 horas depois, a viabilidade celular foi analisada por ensaio de cristal violeta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152861.s001

(TIF)

S2 Fig. Efeito da combinação de AKT mais inibição de MEK com inibidores alternativos sobre a sinalização celular.

(A) e linhas de células MR49C MR49F foram tratados com LY294006 20 �, UO126 10 uM, ou a combinação durante 48 horas.