Abstract

As antraciclinas (tais como doxorrubicina ou daunorrubicina) estão entre os medicamentos anticâncer mais eficazes, mas a sua utilidade é dificultada pelo risco de cardiotoxicidade irreversível. Dexrazoxano (ICRF-187) é o agente cardioprotetor única clinicamente aprovado contra a cardiotoxicidade da antraciclina. A sua actividade tem sido tradicionalmente atribuída aos efeitos quelantes de ferro do seu metabolito com proteção posterior do stress oxidativo. No entanto, o dexrazoxano é também um inibidor catalítico da topoisomerase II (TOP2). Portanto, nós examinamos se dexrazoxano e outros dois inibidores catalíticos TOP2, nomeadamente sobuzoxano (MST-16) e merbarona, proteger os cardiomiócitos de toxicidade antraciclina e avaliados os seus efeitos sobre a eficácia antineoplásica antraciclina. Dexrazoxane e outros dois inibidores TOP2 protegida cardiomiócitos de ratos neonatos isolados de encontro a toxicidade induzida por ambos doxorrubicina e daunorrubicina. No entanto, nenhum dos inibidores TOP2 cardiomiócitos significativamente protegidos num modelo de lesão oxidativa induzida por peróxido de hidrogénio. Em contraste, os inibidores catalíticos não comprometer os efeitos anti-proliferativos das antraciclinas na linha de células leucémicas HL-60; Em vez disso, as interacções sinergísticas foram observados na maior parte. Além disso, a ativação caspase induzida por antraciclina foi diferencialmente modulados pelos inibidores TOP2 em células cardíacas e câncer. Considerando dexrazoxane foi após hidrólise capaz de íons de ferro lábil intracelulares significativamente quelato, esse efeito não foi observado tanto para sobuzoxano ou merbarona. Em conclusão, nossos dados indicam que dexrazoxano pode proteger cardiomiócitos

via

sua actividade inibidora TOP2 catalítico em vez de atividade quelante de ferro. A expressão diferencial e /ou regulação de isoformas TOP2 em células cardíacas e do cancro por inibidores catalíticos podem ser responsáveis ​​para a modulação selectiva de acção observado antraciclina

citação:. Vavrova A, Jansova H, Macková E, Machacek M, Haskova P, Tichotova L, et ai. (2013) Inibidores catalíticos da topoisomerase II Diferentemente modulam a toxicidade das antraciclinas em cardíacos e células cancerosas. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10.1371 /journal.pone.0076676

editor: Rajesh Mohanraj, Universidade dos Emirados Árabes Unidos, Faculdade de Medicina Ciências da Saúde, Emirados Árabes Unidos

Recebido: 23 de maio de 2013; Aceito: 25 de agosto de 2013; Publicação: 07 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Vavrova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação científica checa (projeto 13-15008S; www.gacr.cz), da Universidade Charles, em Praga (SVV projeto 267 004; www.cuni.cz) e co-financiado pelo Fundo social Europeu e do orçamento do estado de República Checa (projeto sem CZ.1.07 /2.3.00 /30,0022;. www.msmt.cz). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

antraciclina (ANT) antibióticos, tais como doxorrubicina (DOX, Figura 1), daunorubicina (DAU, Figura 1) ou epirubicina, estão entre os componentes indispensáveis ​​mais eficazes e frequentemente utilizados agentes antineoplásicos e permanecem de protocolos de quimioterapia modernos para numerosas doenças malignas hematológicas, bem como tumores sólidos. No entanto, o risco de toxicidade irreversível e potencialmente fatal para o tecido cardíaco é a principal desvantagem do uso ANT na prática clínica [1].

As antraciclinas doxorrubicina (DOX) e daunorubicina (DAU) e topoisomerase II catalítica inibidores dexrazoxane ( DEX), sobuzoxano (SOB) e merbarona (MER) foram utilizados neste estudo.

Várias hipóteses têm sido propostas sobre os mecanismos subjacentes tanto os efeitos antineoplásicos e cardiotóxicos de formigas [2]. Atualmente, topoisomerase II (TOP2) é geralmente reconhecido como o alvo molecular principal de ação antitumoral ANT. Formigas pertencem ao grupo dos venenos TOP2 “”, que consistem de agentes citotóxicos que estabilizam o “complexo clivável” [3]. Em termos de cardiotoxicidade, o ferro (Fe) -catalysed produção intramiocárdico de espécies reactivas de oxigénio (ROS) tradicionalmente tem sido implicados. O anel C de aglicona ANT sofre rapidamente redox-ciclismo, e íons Fe podem formar complexos redox-ativo com formigas, resultando na formação de superóxido, peróxido e radicais hidroxila, eventualmente altamente reativos e tóxicos [4], [5].

Esta hipótese tradicional “ROS e Fe” de cardiotoxicidade induzida por ANT tem sido reforçada pela eficiência de proteção do dexrazoxano (DEX, ICRF-187, Figura 1), que é a única cardioprotector clinicamente aprovado. Os efeitos cardioprotetores da DEX foram atribuídas a seu produto de hidrólise ADR-925, muito semelhante à do conhecido EDTA quelante de metais. Seguindo o metabolismo da DEX no ADR-925, este produto pode quelar intracelular livre e redox-activo Fe e /ou substituição de Fe em ANT Fe-complexos, evitando assim hidroxilo formação e dano oxidativo radical local específico para o tecido cardíaco [6].

no entanto, DEX é também um inibidor catalítico estabelecido de TOP2 [7], e, portanto, não pode ser descartado que DEX podem exercer efeitos protetores através da interferência com intoxicação TOP2 induzida por ANT no coração [8], [9]. De fato, um estudo recente relatou que a eliminação da isoforma TOP2 beta (

Top2b

gene) cardiomiócitos protegidas de DNA quebras de cadeia dupla e mudanças transcriptoma induzidas pela aguda em tratamento DOX vivo, com a prevenção subsequente de biogênese mitocondrial defeituoso e formação de ROS. Além disso, a eliminação específicos de cardiomiócitos do

Top2b

protegida gene ratinhos desde o desenvolvimento de insuficiência cardíaca progressiva induzida pelo tratamento DOX repetiu, sugerindo que a cardiotoxicidade induzida pela DOX é mediado principalmente pela cardiomiócitos TOP2B [10].

Perguntas decorrentes desses estudos anteriores nos encorajou a investigar o envolvimento de TOP2 na cardiotoxicidade ANT e avaliar outros inibidores catalíticos TOP2 como potenciais cardioprotectores. Neste estudo, utilizando culturas primárias de isolados de ratos cardiomiócitos ventriculares neonatais (NVCMs), foram examinados os efeitos protetores do DEX e dois outros inibidores catalíticos de TOP2, sobuzoxano (SOB, MST-16, Figura 1) e merbarona (MER, Figura 1 ), contra a cardiotoxicidade induzida por DAU e DOX. Para efeito de comparação, nós também investigou os efeitos destes agentes em um modelo de H

2O

2 induzida oxidativo lesão de cardiomiócitos. Além disso, a linha de células leucémicas HL-60 foi usado para avaliar se os inibidores catalíticos TOP2 pode afetar cardiotoxicidade ANT sem comprometer a sua eficácia antiproliferativa contra células cancerosas de leucemia.

Materiais e Métodos

1. Materiais

meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DMEM com mistura de nutrientes F-12 (DMEM /F12), soro de cavalo (HS), soro fetal de bovino (FBS), penicilina solução /estreptomicina (5000 U /ml ; P /S) e solução de piruvato de sódio (100 mM; Pir) foram adquiridos a partir de Lonza (Bélgica). Os soros foram inactivados pelo calor antes da utilização. DEX foi obtido a partir Huaren Chemicals (Chang-Zhou, China). meio RPMI-1640 com L-glutamina e NaHCO

3, o ácido láctico, a nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD

+), MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio brometo, SOB, MER, sulfóxido de dimetilo e cloreto de 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazineethanesulphonic (HEPES) foram adquiridos a Sigma (República Checa) e outros produtos químicos (por exemplo, constituintes de vários buffers) de penta (República Checa) e foram da mais elevada disponível farmacêutica ou de grau analítico. dimetil sulfóxido foi utilizado para dissolver DEX, FDP e MER. plástico para a cultura de células foi obtido a partir de TPP (Suiça).

2. o isolamento dos cardiomiócitos e as avaliações de toxicidade

Todos os procedimentos com animais e a preparação de NVCMs foram aprovados e supervisionados pela Comissão de Cuidados Charles University animal. as culturas primárias de NVCMs foram preparados a partir de ratos Wistar 2 dias de idade. os animais foram anestesiados com CO

2, e decapitado. as caixas foram abertos e os corações foram coletadas em um Ca gelada

2 + tampão -livre, contendo NaCl 116 mM, KCl 5,3 mM, MgSO 1,2 mM

4, NaH 1,13 mM

2 PO?

glicose mM de 4, 5 e 20 mM de HEPES (pH 7,40). Os ventrículos foram cuidadosamente picado e em série digerido com uma mistura de colagenase (0,25 mg /ml; Invitrogen, EUA) e a pancreatina (0,4 mg /ml; Sigma) solução a 37 ° C. A suspensão de células foi colocada em um grande (15 cm) de uma placa de Petri (aprox. 20 corações por prato) e deixou durante 2 h a 37 ° C para separar os miócitos (flutuantes no meio) a partir de fibroblastos (ligado ao prato). A suspensão rica em miócitos foi recolhido e as células viáveis ​​foram contadas utilizando exclusão com azul de tripano. O processo de isolamento resultou em uma monocamada celular confluente com ~ 90% de cardiomiócitos batendo sincronicamente. Para avaliar a citotoxicidade, a morfologia celular e a actividade da caspase, as células foram plaqueadas em placas de 12 poços pré-revestidas com 1% de gelatina a uma densidade de 0,8 milhões de células por poço. Para medir o teor de glutationa, as células foram plaqueadas em placas de Petri de 60 mm a uma densidade de 4,8 milhões de células por placa. NVCMs foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 em DMEM /F12 suplementado com 10% HS, FBS a 5%, 4% PYR e 1% de P /S. NVCMs recentemente isoladas foram deixados durante 40 h, em seguida, o meio foi mudado para DMEM /F12 suplementado com FBS a 5%, 4% PYR e 1% de P /S. O meio foi substituído mais uma vez após mais 24 h. Todas as experiências foram iniciadas no quarto dia após o isolamento. Utilizando ambos soro e meio PYR-livre, NVCMs foram incubadas a 37 ° C, com os agentes testados, quer sozinhos ou em combinação. A actividade de lactato desidrogenase (LDH) libertada a partir de cardiomiócitos foi determinada em meios de cultura de células como um marcador padrão de citotoxicidade e colapso celular que utiliza um método espectrofotométrico bem estabelecida; nos nossos estudos anteriores, este método bem correlacionada com a liberação de troponinas específica cardio-T e I [11]. A actividade de LDH libertada a partir de cardiomiócitos foi expressa como a percentagem de LDH celular total conforme medido após a lise celular durante 15 min (fosfato de potássio 0,1 M, 1% de Triton X-100, DTT 1 mM de [(-) -1,4-ditio -L-treitol], EDTA 2 mM, pH 7,8) à temperatura ambiente. Todas as amostras foram congeladas imediatamente e mantida em -80 ° C antes da medição. Actividade da LDH foi ensaiada em tampão de Tris-HCl (100 mM, pH 8,9) contendo 35 mM de ácido láctico e 5 mM de NAD

+. A taxa de NAD

+ redução foi monitorizada espectrofotometricamente a 340 nm durante 2 min. A inclinação da região linear e coeficiente de absorção molar e = 6,22 * 10

3 m /cm foi utilizado para o cálculo da atividade da LDH e os dados foram expressos como a percentagem do montante total LDH.

Mudanças na morfologia celular foram documentadas usando um Eclipse TS100 invertido microscópio de epifluorescência (Nikon, Japão), eo software NIS-Elements AR 2,20 (Laboratory Imaging, República Checa). Para visualizar mitocôndria activa, as células foram carregadas com 0,5 uM JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, E.U.A.) durante 30 min a 37 ° C. Em baixas concentrações, JC-1 existe no interior das células em uma forma monomérica verde-fluorescente e acumula nas mitocôndrias respiram activamente. Há JC-1 agregam monómeros impulsionado pela diferença de potencial de membrana (ΔΨ

m) entre a membrana mitocondrial interna e externa existente. Este ΔΨ

formação dependente da m de “J-agregados” é representado por um acidente vascular cerebral-shift de verde para fluorescência vermelha.

3. estudos de proliferação

A linha de células HL-60, derivado de um paciente com leucemia promielocítica aguda [12], foi adquirido a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, E.U.A.). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de P /S em 75 cm

2 frascos de cultura de tecidos), a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Para ensaios de proliferação, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço. Os estudos de associação foram concebidos de acordo com Chou – método Talalay [13]. Resumidamente, foram determinados pela primeira vez as concentrações de quelantes induzindo diminuição de 50% a proliferação (IC

50) de todas as substâncias individuais. Então, tanto as substâncias individuais e misturas combinadas foram testadas em concentrações correspondentes a várias frações e múltiplos. (1/8; 1/4; 1/2; 1; 2; 4) de seus individuais

50 valores IC

a proliferação celular foi avaliada utilizando um ensaio de viabilidade com base na capacidade das mitocôndrias activas para mudar de amarelo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-brometo difenyltetrazolium tetrazole (MTT, Sigma) para roxo formazano de acordo com as instruções do fabricante Resumidamente, 25 uL de 3 mg /mL de MTT solução em solução salina de fosfato tamponada foram adicionadas ao meio de cultura (100 ul) e após 2 horas de incubação em 37 ° C, as células foram lisadas com tampão de lise (isopropanol , HCl 0,1 M, 10% de Triton X-100) durante 30 min em temperatura ambiente. Após dissolução, a densidade óptica de MTT solúvel foi medida utilizando um leitor Tecan Infinito 200 H placa a λ = 570 nm, subtraindo-se o λ = 690 nm fundo. As taxas de proliferação dos grupos experimentais foram expressos como percentagens dos controles não tratados (100%).

4. Avaliação da actividade da caspase

As actividades das caspases 3/7, 8 e 9 foram determinadas usando um kit disponível comercialmente (Caspase Ensaios Glo, Promega, EUA) com base na capacidade de caspases para clivar sequências de aminoácidos específicas presente em um substrato para a luciferase. atividades dos caspases foram determinadas em relação ao teor de proteína, que foi avaliada usando o método do ácido bicincon�ico de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma). Os lisados ​​foram diluídos para concentrações iguais de proteína.

5. Determinação de total e glutationa oxidada

NVCMs foram lavadas com PBS (2 x 2,5 ml, 4 ° C), recolhidas com um raspador de células, e centrifugada (10 min a 700 x g, 4 ° C), e o sedimento foi ressuspenso em 250 ul de 4 ° C ácido sulphosalicylic frio (Sigma) e, em seguida sonicada em gelo durante 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Alemanha). As amostras foram então centrifugadas durante 15 min a 18.000 x g e os sobrenadantes foram utilizados para determinar a quantidade de glutationa reduzida e oxidada (GSH /GSSG) de acordo com Tietze [14] utilizando o método de reciclagem enzimática com 5,5′-ditio bis (2-nitrobenzóico) (Sigma) e redutase de GSH (Sigma) em um formato de microplacas. A taxa de formação de ácido 2-nitro-5-mercaptobenzóico foi registada a 405 nm durante 2 min e o declive foi comparada com a da curva padrão de glutationa oxidada (GSSG). A concentração de glutationa total (GSH a GSSG +) foi calculada usando o método de regressão linear, os resultados foram corrigidos para o teor de proteína e expressa como uma percentagem do total de glutationa numa amostra de controlo (100%). teor de GSSG na amostra foi determinado após derivatização de GSH com 2-vinilpiridina (Sigma). Os resultados foram corrigidos para o teor de proteína foi determinada espectrofotometricamente utilizando o método de ácido bicinconínico de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma).

6. A citometria de fluxo de análise do ciclo celular

Após a incubação, as células HL60 foram centrifugadas a 300 x g, lavadas em PBS com 5% de FBS (PBS + FBS) e suspendeu-se numa pequena quantidade de PBS + FBS. Em seguida, arrefecida com gelo de 70% de etanol foi adicionada, gota a gota, e as células foram fixadas durante 3 h a – 20 ° C. Após a fixação, o etanol foi removido por centrifugação; As células foram lavadas em PBS + FBS e suspensas em citrato de sódio 4 mM em PBS + FBS. Finalmente, as células foram incubadas com 200 ug /ml de ARNase A (Sigma) e 30 ug /mL de iodeto de propídio (PI) durante 20 min a 37 ° C. As células foram analisadas usando um citómetro de fluxo Accuri C6 (Accuri Citómetros Europe Ltd., U.K.) tal como descrito anteriormente [15]. PI foi excitado a 488 nm e a fluorescência foi analisada a 585 nm (FL-2). Por análise, 10000 eventos foram recolhidas. análise do ciclo celular foi avaliada utilizando multicycle Software AV (Sistemas de Fluxo de Phoenix, EUA). figuras do ciclo celular foram criados com software Cyflogic (CyFlo Ltd, Finlândia).

7. ensaio de Calceina-AM para determinações de intracelular Fe-quelante propriedades

As experiências de análise das eficiências intracelulares Fe-quelantes dos agentes examinados foram realizados de acordo com Glickstein et ai. [16] com pequenas modificações. A linha de células H9c2 derivada de tecido de coração de rato embrionário [17] foi adquirido a partir da American Type Culture Collection (U.S. A.). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de P /S e HEPES a 10 mM em 75 cm

2 frascos de cultura de tecidos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. As células subconfluentes foram subcultivadas a cada 3-4 dias. H9c2 células foram semeadas em placas de 96 poços (10.000 células por poço) e foram deixados repousar durante 24 h para anexar. Posteriormente, o meio de cultura foi substituído com DMEM sérica e livre de piruvato. Após 24 horas de privação de soro, as células foram essencialmente não-proliferativa, e foram usadas para experiências. As células foram carregadas com 100