Abstract

A obesidade confere um risco aumentado de desenvolver formas de câncer específicos. Embora os mecanismos não são claros, aumento da secreção de células de gordura de proteínas específicas (adipocitoquinas) pode promover /facilitar o desenvolvimento de tumores malignos em obesidade através de conversa cruzada entre o tecido adiposo (s) e os tecidos propensas a desenvolver cancro entre obesos. Foram pesquisados ​​para novos adipocitoquinas que foram sobre-expressos no tecido adiposo de indivíduos obesos, assim como nas células tumorais derivadas de cancros comumente associados com a obesidade. Para esta finalidade os dados de expressão a partir de tecido adiposo humano de células e tecidos primários obesos e não obesos, assim como a partir de um grande painel de linhas celulares de cancro humano e os correspondentes foram exploradas. Encontramos expressão de ceruloplasmina a ser o mais enriquecida em células cancerosas associadas à obesidade. Este gene também foi significativamente regulada para cima no tecido adiposo de sujeitos obesos. Ceruloplasmina é o principal transportador de cobre do corpo e está envolvida na angiogénese. Nós demonstramos que ceruloplasmina é um adipocina romance, que é produzida e secretada em taxas aumentadas na obesidade. No estado obeso, tecido adiposo contribuiu significativamente (até 22%) para o nível de proteína total em circulação. Em resumo, temos identificado através de um rastreio de bioinformática ceruloplasmina como novo adipocina com expressão aumentada no tecido adiposo de indivíduos obesos, bem como em células de cancros associados com a obesidade. Se existe uma relação causal entre a superexpressão adiposo de ceruloplasmina e câncer desenvolvimento da obesidade não pode ser respondida por estas comparações transversais

Citation:. Arner E, Forrest ARR, Ehrlund A, Mejhert N, Itoh M, Kawaji H, et ai. (2014) ceruloplasmina é um adipocina romance que é abundante no tecido adiposo de obesos e em células Obesity-Associated câncer. PLoS ONE 9 (3): e80274. doi: 10.1371 /journal.pone.0080274

editor: Qiong Wu, Harbin Institute of Technology, China

Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 11 de outubro de 2013; Publicação: 27 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Arner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. FANTOM5 foi tornada possível por uma concessão de pesquisa para RIKEN omics Centro de Ciência de MEXT para Yoshihide Hayashizaki e uma subvenção do Programa de Pesquisa de Biologia celular inovador por Innovative Technology (Programa de Inovação celular) do MEXT, Japão para Yoshihide Hayashizaki. Este estudo também foi apoiada por doações do Conselho de Pesquisa sueco e da Fundação do Câncer sueco. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Há um aumento mundial na prevalência de obesidade e obesidade e suas co-morbidades tornaram-se um grande problema de saúde na maioria dos países [1]. câncer associado à obesidade recentemente ganhou muita atenção. O World Cancer Research Fund concluiu em 2007 que a obesidade é convincente associado com aumento do risco de pâncreas, (pós-menopausa) de mama, endométrio e câncer renal [2]. Estas conclusões foram posteriormente confirmado e ampliado em uma recente meta-análise de estudos prospectivos avaliando os riscos de câncer associados com ≥ 5 kg /m

2 aumentos no índice de massa corporal (IMC) [3]. Observou-se o risco mais forte (odds ratio ≥1.30) para o câncer renal e adenocarcinoma esofágico em ambos os sexos, de câncer de tireóide em homens e para o câncer endometrial e da vesícula biliar em mulheres.

Os mecanismos que ligam a obesidade ao câncer estão mal entendida, embora várias teorias têm sido propostas [4], [5], [6], [7], [8]. Dado que o tecido adiposo consiste na maior órgão endócrino do corpo, que segregam centenas de sinais peptídicos colectivamente denominado adipocitoquinas, e que a secreção adipocina é significativamente perturbados na obesidade, uma hipótese atractiva é que os sinais derivadas de tecido adiposo a outros tecidos podem estar envolvidos no desenvolvimento do cancro. As duas adipocinas mais estudadas, adiponectina e leptina, foram efectivamente ligado ao desenvolvimento de tumores malignos através da sua acção sobre os receptores cognatos que afetam a sensibilidade à insulina e /ou activação de sinalização associado a um cancro [4]. Além disso, várias adipocinas são factores de crescimento que poderiam servir como sinais diretos de tumores [9]. Estes, bem como outros, não adipocinas ainda descobertos, podem, portanto, ter câncer de promoção de propriedades.

Neste estudo, com vista a encontrar novos adipocinas humanos que podem estar associados com cânceres associados com a obesidade. Para este fim, os dados extraídos do romance FANTOM5 atlas de expressão, o que proporciona uma cobertura sem precedentes de tecidos humanos, pilhas e linhas celulares de cancro [10]. Estamos focados em linhas celulares de cancro derivadas de tumores malignos com a associação mais forte com (≥1.3 odds ratio em ambos os sexos) obesidade de acordo com Renehan et al [3]. Putativos novos adipocitoquinas de potencial relevância para os cancros associados com a obesidade foram identificados por comparação do transcriptoma enriquecido em ambas as células cancerosas e tecido adiposo obesos. Isso foi feito através da combinação dos atlas de expressão de dados FANTOM5 com um estudo recentemente publicado da expressão genética no tecido adiposo a partir de um grande grupo de mulheres obesas e não obesas [11].

Este trabalho é parte do projeto FANTOM5 . downloads de dados, ferramentas genômicas e manuscritos co-publicado são resumidas aqui https://fantom.gsc.riken.jp/5/.

Métodos

Sujeitos e tecido adiposo

Todos os indivíduos foram informados em detalhe sobre o estudo e foi obtido consentimento informado por escrito. Os estudos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Instituto Karolinska, de Estocolmo, Suécia. Três grupos diferentes de pacientes foram utilizados no estudo. No primeiro grupo, descrito anteriormente [11], de tecido adiposo subcutâneo foi obtido a partir de 26 de não-obesos e 30 mulheres obesas. A obesidade foi definida como IMC de 30 kg /m

2 ou superior. O ARN foi extraído e submetido a micro-arranjo expressão global como descrito [11]. Os dados de expressão gênica foram depositados no Centro Nacional de Biotecnologia Gene Expression Omnibus (número de acesso GSE25402). O número de protocolo do Comitê de Ética é 592/03 (aprovado 1

st de Dezembro de 2003).

Na segunda coorte, tecido adiposo subcutâneo foi obtido por lipoaspiração e usado para identificar experimentalmente novos adipocinas . Nove mulheres foram investigados. Todos eram não-obesos e saudável de acordo com a auto-relatório. Valores (média ± SD) para idade e IMC foram 45 ± 13 anos e 27,4 ± 1,2 kg /m

2. O tecido foi submetido a digestão com colagenase e a porção de estroma-vascular foi diferenciadas em adipócitos em cultura, como descrito [11]. Para a determinação de proteína no meio condicionado, as alíquotas foram removidas 4, 8 e 12 dias após o início da diferenciação. O número de protocolo do Comitê de Ética é 2009 /1881-1831 /1 (aprovado 14

de janeiro de 2010).

No terceiro grupo, foram determinados a secreção de tecido adiposo de proteínas e seus níveis plasmáticos . Vinte obesos (idade 46 ± 6 anos, média ± SD) e 19 mulheres saudáveis ​​não-obesas (idade 47 ± 9 anos) foram investigados pela manhã, após uma noite de jejum. Os obesos foram agendados para cirurgia bariátrica. Sete eram saudáveis, 10 tinham hipertensão e três tinham diabetes tipo 2 tratados com agentes orais. gordura corporal total foi determinada por absortometria radiológica de dupla (62 ± 10 kg em obesos e 24 ± 8 kg em não-obesos). Em seguida, uma amostra de plasma venoso foi obtida para a determinação de níveis circulantes de proteínas. Finalmente, o tecido adiposo foi obtido por biópsia abdominal subcutâneo como descrito [11], [12]. Parte da amostra de tecido adiposo foi submetido a

In vitro

incubação durante 2 h e o meio condicionado foi utilizado para a determinação da proteína, como descrito [12]. A outra parte foi submetida a colagenase de células de tratamento e isolado de gordura foram obtidas por determinação do tamanho das células de gordura e de volume, como descrito [13]. a secreção de proteínas foi relacionado com o número de células de gordura na amostra de tecido e incubou-se à quantidade total de gordura corporal. Neste último caso, a secreção de proteínas foi relacionada com a quantidade de lípidos no tecido e incubou-se este valor foi multiplicado pelo peso total de gordura corporal, como descrito [12]. O número de protocolo do Comitê de Ética é 2005 /1441-1432 (aprovado 1

st de fevereiro 2006).

medidas de proteína

ceruloplasmina e osteopontina foram medidas por kits ELISA comerciais ( . Abcam, Cambridge, UK)

contribuição adiposo ao total de

produção ceruloplasmina

a fim de estimar a contribuição de ceruloplasmina derivadas de tecido adiposo para a circulação, foram feitas as seguintes premissas: (a) secreção de ceruloplasmina de incuba tecido adiposo

in vitro

é semelhante em diferentes regiões adiposas e reflete

in vivo

secreção. (B) ceruloplasmina é distribuído uniformemente no espaço água, que é 0.530 l /kg de peso corporal em não-obesos e 0,465 l /kg de peso corporal em indivíduos obesos [14]. (C) o nível no plasma de ceruloplasmina de manhã reflete os níveis globais de 24 horas e a meia-vida da proteína é de 5,5 dias [15]. Com base nessas premissas, a produção total ceruloplasmina por hora foi estimada como: (nível plasmático medidos x 5,5 x água corporal total) dividido por 24. secreção adiposo total por hora é medido como a secreção por peso de lipídios do tecido adiposo por vezes horas de gordura corporal total . A partir destes valores a percentagem de tecido adiposo contribuição para a produção de ceruloplasmina pode ser calculada.

amostras de cancro e de controlo

Com base Renehan et ai [3], identificaram-se as seguintes linhas de células de cancro no FANTOM 5 conjunto de dados como sendo derivado de tipos de tumores associados à obesidade e que têm uma razão de chances ≥1.30 em homens, mulheres ou ambos. Útero: linha de células de sarcoma estromal endometrial (-9 OMC), a linha de células de carcinoma endometrial (-2 MAC), linha de células de adenocarcinoma endometrioid (-1 JHUEM), linha clara de células de carcinoma de células (TEN); Rim: linha de células de carcinoma de células renais (-2 OS-RC), linha de carcinoma de células renais (TUHR10TKB); Vesícula biliar: linha de células de carcinoma da vesícula biliar (TGBC2TKB), linha de células de carcinoma da vesícula biliar (TGBC14TKB); Tiróide: linha de células de carcinoma da tiróide (TCO-1), a linha de células de carcinoma da tiróide (KHM-5 M), linha de células de adenocarcinoma papilar (8505c). Como amostras de controlo foram utilizados os seguintes tecidos e amostras de células primárias. Útero: adulto e tecido fetal; Rim: adulto e tecido fetal, células renais Cortical epitelial (dois doadores), células renais epiteliais (três doadores), células renais glomerular endoteliais (três doadores), células mesangiais renais (três doadores), renal proximal Tubular células epiteliais (três doadores) ; vesícula biliar: tecido adulto; Tiróide:. Adulto e tecido fetal

A identificação de novos candidatos adipocitoquinas relacionadas ao câncer

A expressão genética no banco de dados FANTOM5 foi calculada como a contagem tag normalizada (tags por milhão, TPM) em um 1 janela kb torno RefSeq [16] locais de início da transcrição. Os genes foram identificados como candidatos se eles foram expressas a um nível funcionalmente significativo (aqui definido como 10 TPM ou superior) e enriquecido pelo menos, de duas vezes nas linhas celulares de cancro listados acima, em relação a todas as linhas celulares disponíveis na FANTOM5, embora não sendo enriquecida entre os tecidos ou células primárias correspondentes. O enriquecimento foi calculado como descrito em [17] com p-valores corrigidos para múltiplos ensaios utilizando o método de Hochberg-Benjamini [18]. genes candidatos foram retidos se fossem significativamente up-regulada a 5% FDR no tecido adiposo de obesos de acordo com um estudo anterior [11]. Usando o banco de dados de expressão FANTOM5, o que é necessário, pelo menos, 10 TPM expressão do gene CAGE através de um locus do receptor em uma ou mais linhas celulares de cancro de obesidade associada, a fim de retê-lo para posterior investigação.

A análise estatística

Os valores são ± erro padrão da média. Eles foram comparados por análise de variância (medida repetida), teste t não pareado e análise de regressão linear.

Resultados

A análise inicial da base FANTOM 5 de dados [10] e do tecido adiposo publicada matriz [11] identificaram 700 genes que foram expressos de forma significativa (≥10 TPM) e, pelo menos, duas vezes enriquecidas em uma linha celular de cancro de interesse, mas não enriquecidas nas células do tecido ou primárias correspondentes, e sobre-reguladas no tecido adiposo de obeso. Não foi possível realizar uma análise detalhada de todos os genes identificados ou para determinar qual deles que foram, na verdade, segregado a partir de células de gordura. Portanto, ainda mais reduzido a lista restringindo a expressão na linha celular de cancro relevante para ≥100 TPM (um nível de expressão elevado), o enriquecimento de pelo menos de cinco vezes na linha celular de cancro, em comparação com os correspondentes tecidos /células saudáveis, e, pelo menos, dois fold-regulação no tecido adiposo na obesidade. Apenas dois genes conheceu estes critérios mais rigorosos, nomeadamente ceruloplasmina (geneID:

CP

) e osteopontina (geneID:

SPP1

). Surpreendentemente, ambos proteínas presentes na circulação codificado e, portanto, foram considerados potenciais adipocitoquinas. Nós investigamos se ceruloplasmina e osteopontina estavam ativamente secretadas a partir de células de gordura por determinar se houve uma libertação dependente do tempo para os meios de comunicação. Enquanto osteopontina não era detectável no meio de incubação (gráfico não mostrado), ceruloplasmina foi efectivamente libertada de um modo dependente do tempo na diferenciação de adipócitos (Fig. 1a). Assim, apesar de ARNm osteopontina é expressa no tecido adiposo de acordo com a micromatriz e é regulada positivamente em obesidade [11], a proteína codificada não parece ser segregado a partir de células de gordura o que implica que não é a osteopontina um adipocina. A influência da obesidade sobre os níveis plasmáticos de ceruloplasmina e secreção a partir do tecido adiposo subcutâneo foi também investigado (Fig 1b-d). Os níveis plasmáticos e secreção adiposo foram significativamente aumentados em amostras de indivíduos obesos. Houve uma forte relação positiva entre circulante e ceruloplasmina secretado-adiposo. Na verdade, este último explicou 45% da variação inter-individual na ceruloplasmina do plasma (r ajustado

2), que era independente do IMC (r parcial = 0,36; p = 0,026) ou de gordura corporal (r parcial = 0,44; p = 0,007). A contribuição de tecido adiposo a produção total de ceruloplasmina foi determinada como descrito em Métodos e foi estimada em 13 ± 5% em não-obesos e 22 ± 6%, em obesos (p 0,0001).

. A secreção durante a diferenciação de células progenitoras para as células de gordura. Os dados são analisados ​​por análise de variância, medidas repetidas. Influência B e C da obesidade sobre os níveis plasmáticos e a secreção a partir do tecido adiposo como analisado com o teste-t não emparelhado. D. Relação entre ceruloplasmina secretado e seus níveis plasmáticos como analisados ​​pela regressão linear.

Nós investigamos ainda mais o padrão de

CP

expressão em células cancerosas humanas. A Figura 2 mostra a localização genómica do

CP

(Figura 2a, b), a distribuição de actividade do promotor tal como medida pela expressão do gene análise tampa (CAGE, Figura 2c) e

CP expressão através de uma

grande painel de tipos de células cancerígenas classificadas por nível de expressão (Fig 2d). Notavelmente, a linha de células de câncer com a maior expressão de

CP

é um carcinoma de células claras do endométrio (Fig 2d, superior seta sólida). Outros tipos de câncer associado à obesidade (renais, endométrio) também exibem relativamente alto

CP

expressão (, setas sólidas fig 2d). câncer hepático não foi incluído neste estudo porque não atender o nosso critério de obesidade /câncer de probabilidades de associação proporção de 1,30 ou mais; no entanto, é interessante notar que ele é associado com a obesidade em homens quando se usa um pouco menos rigorosa critérios (odds ratio = 1,24, em referência [3]) e que as linhas de células de câncer vários fígado estão entre aqueles com o mais alto

CP

expressão (, setas quebradas fig 2d). Entre as nove linhas celulares de cancro com maior

CP

expressão, sete estavam associados com a obesidade.

A. CP está localizado na no negativo fio (roxo) do cromossomo 3 na posição 3q23-q25, ladeado por HPS3 na (verde) de cadeia positiva e CPHL1 na cadeia negativa. modelos B. mRNA RefSeq do locus. distribuição de sinal de atividade de C. Promotor conforme medido pelo CAGE no locus. A maioria de expressão vem a partir da extremidade 5 ‘da CP. D. Expressão (tags por milhões, TPM) em todo o locus para as linhas de células presentes no FANTOM5. linhagens de células com expressão acima de 10 TPM são mostrados aqui; um total de 269 linhas de células foram perfilado. linhas celulares associados a obesidade são indicadas pelo preto (OR = 1,30) e cinza (OR = 1,20). setas

Discussão

Neste estudo, teve uma abordagem sistemática para identificar novos adipocitoquinas que foram associados com a obesidade e cancros relacionados com a obesidade, comparando a expressão de todos os genes induzida por obesidade no tecido adiposo com genes enriquecidas em todo o cancro linhas celulares incluídos no estudo FANTOM5. Utilizando os critérios de selecção bastante rigorosas, apenas dois genes teve muito elevado nesta comparação. Em teoria, estes genes podem ter secretado codificado, bem como proteínas não secretadas com qualquer tipo de função. No entanto, descobriu-se que ambos os genes codificados proteínas circulatórios, ou seja, osteopontina e ceruloplasmina. A osteopontina não pode ser definida como uma adipocina (proteína secretada a partir de células de gordura) de acordo com as nossas descobertas. Em contraste, ceruloplasmina preenchiam os critérios para um verdadeiro adipocina, isto é, é segregada de uma forma dependente do tempo. Além disso, uma vez que não está incluída no secretome publicada por células de gordura humanos, consideramos que é um romance adipocina [9]. No entanto, nosso estudo não pode determinar se existe uma relação causal entre ceruloplasmina e cânceres associados com a obesidade, e mais estudos são necessários para determinar em que medida, se for o caso, ceruloplasmina derivada de adipócitos ou células tumorais desempenha um papel funcional no crescimento do câncer tecido. No entanto, podemos afirmar que

CP

é sobre-expressa no tecido adiposo obesos e em células de cancro associados com a obesidade.

Ceruloplasmina na circulação se acredita ser produzida principalmente pelo fígado [15], [19]. No entanto, os dados sugerem um papel de contribuição até então desconhecida de tecido adiposo. Em linha com os resultados anteriores [20], [21], os níveis circulantes foram aumentados na obesidade. Além disso, a secreção adiposo foi significativamente aumentada em obesos versus indivíduos não-obesos. As estimativas sugerem que o tecido adiposo na obesidade contribui com um máximo de 22% para os níveis circulantes de ceruloplasmina e esta secreção explicado tanto quanto 45% da variação inter-individual na ceruloplasmina do plasma em indivíduos não obesos e obesos. A relação entre circulante e ceruloplasmina secretado-adiposo era independente do IMC ou massa de gordura corporal. Deve-se ressaltar que o estimado

in vivo

valores são calculados com base no

in vitro

resultados que podem ser diferentes das

in vivo

. Além disso, os resultados podem ser de gênero tendenciosa uma vez que os dados de microarranjos de tecido adiposo usados ​​aqui era de mulheres, enquanto suposições sobre a distribuição de ceruloplasmina foram parcialmente com base em um estudo anterior em homens [14]. Na verdade, embora nós medimos a secreção de ceruloplasmina no tecido adiposo de mulheres, foram utilizados dados do sexo masculino para a água corporal total [14] uma vez que os últimos valores foram obtidos usando uma técnica state-of-the-art. No entanto, o total de valores de água do corpo para as mulheres medidos com o método biompedance menos precisas são comparáveis ​​com as utilizadas nos nossos cálculos atuais, ou seja, 0,527 ± 0,04, 0,472 ± 0,03 e 0,426 ± 0,028 l /kg de peso corporal em magra, sobrepeso e obesidade fêmeas, respectivamente [22].

Finalmente, o nosso estudo examinou apenas tecido adiposo subcutâneo. Desde expressão e secreção de alguns adipocinas são diferencialmente regulados em diferentes depósitos de gordura [23], nós não sabemos se ceruloplasmina expressa e lançado a partir de outros depósitos podem exibir outras correlações com a obesidade. Por outro lado, o tecido adiposo subcutâneo é de longe o maior depósito de gordura do corpo e, portanto, quantitativamente o determinante mais importante de níveis circulantes de adipocitoquinas

.

Em resumo, através da realização de bioinformatically um rastreio sistemático de genes sobre-expressos em cancros obesidade associada , este estudo identificou ceruloplasmina como um romance adipocina humano. Sua secreção e expressão são o aumento na obesidade e ceruloplasmina adiposo é um dos principais contribuintes para o nível ceruloplasmina circulação.

Informações de Apoio

Tabela S1. : Lista dos membros do consórcio FANTOM5

doi:. 10.1371 /journal.pone.0080274.s001

(DOCX)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a todos os membros da o consórcio FANTOM5 por contribuir para a geração de amostras e análise dos genas e agradecer conjunto de dados para a produção de dados

Nota:. RIKEN omics Science Center deixou de existir a partir de 1 de abril de 2013, devido à RIKEN reorganização.