Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte no mundo. métodos de tela sensíveis, não-invasivos de diagnóstico são urgentemente necessárias para melhorar suas taxas de sobrevivência. Estável microRNA circulando oferece oportunidades únicas para o diagnóstico precoce de várias doenças, incluindo câncer. O nosso objectivo tem sido o de encontrar novos miRNAs de plasma que podem ser usados ​​como biomarcadores para a detecção de CRC.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

De acordo com os resultados de miRNA Profiling realizada na partilha amostras de plasma formar 10 pacientes CRC ou 10 controles saudáveis, um painel de miRNAs (HSA-miR-10a, -19a, -22 *, -24, -92a, 125a-5p, -141, -150, -188-3p, -192, -210, -221, -224 *, -376a, -425 *, -495, -572, -601, -720, -760 e HSA-let-7a, -7e) foram desregulados na CRC de plasma com mudanças vezes 5. Após a validação em larga escala por qRT-PCR realizado em mais de 191 indivíduos independentes (90 CRC, 43 adenoma avançado e 58 participantes saudáveis), descobrimos que os níveis de plasma miR-601 e miR-760 foram significativamente menores na neoplasia colorretal (carcinomas e adenomas avançados), em comparação com controles saudáveis. análise da curva ROC mostrou que o plasma miR-601 e miR-760 eram de valor de diagnóstico significativo para neoplasia avançada. Estes dois miARNs juntos produzir uma AUC de 0,792 com sensibilidade de 83,3% e 69,1% de especificidade para a separação de CRC dos controlos normais, e produzir uma AUC de 0,683 com sensibilidade de 72,1% e 62,1% de especificidade em adenomas avançados discriminadores de controles normais.

Conclusões /Significado

Plasma miR-601 e miR-760 pode potencialmente servir biomarcadores não invasivos como promissoras para a detecção precoce do CRC

Citation:. Wang Q, Huang Z, Ni S, Xiao X, Xu Q, Wang L, et ai. (2012) Plasma miR-601 e miR-760 são Biomarkers inovadores para a detecção precoce do câncer colorretal. PLoS ONE 7 (9): e44398. doi: 10.1371 /journal.pone.0044398

editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 06 de agosto de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (Grant Nos. 81000867 e 81071791), Ciência e TechnologyCommission de Xangai Município (Grant No. 09JC1403700 e 10XD1401300) e, a partir Mérieux bolsas de investigação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução contas

CRC em todo o mundo por 600 mil mortes por ano. Na China, CRC continua a ser a quarta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer até à data [1], [2]. O estágio do tumor no momento do diagnóstico é o fator prognóstico mais importante no CRC, tornando a detecção precoce de uma importância crucial na redução da mortalidade e melhorar as taxas de conformidade. biomarcadores novos para a detecção precoce são urgentemente necessários. adenomas avançados são tipicamente definidos como adenomas de 1 cm ou mais, e com os componentes das vilosidades (tubuloviloso ou vilosidades) ou displasia de alto grau de [3], [4]. adenomas avançados vincular claramente acima da cadeia de adenoma benigno para CRC avançado. Assim, a maioria das estratégias de triagem CRC concentrar-se na taxa de detecção de ambos CRC e adenomas avançados.

MiRNAs são pequenos RNAs não codificantes (18-22 nt de comprimento) que regulam a expressão de genes alvo no pós- nível de transcrição por ligação a sequências alvo de ARNm. Desde a sua descoberta em 1993, expressões alterados de miARNs têm sido associados a muitos tipos de tumores, incluindo CRC [5], [6]. Sua associação com a génese do tumor indica seu potencial como marcadores diagnósticos e alvos terapêuticos [7], [8].

miRNAs circulantes são detectados de forma estável no plasma /soro e servir como biomarcadores para várias doenças [9], [10 ], [11], [12], [13], [14], tornando-os marcadores não invasivos potencialmente úteis para o diagnóstico precoce ou na progressão do cancro monitorização. Nós já descobriram que os níveis elevados de miR-29a e miR-92a no plasma têm valor de diagnóstico significativo para CRC [15]. Para reforçar a eficiência diagnóstica de circulação de miRNA, é necessário identificar novos alvos. Neste estudo, verificou-se que o plasma miR-601 e miR-760 concentrações poderia contribuir para a detecção precoce do CRC de acordo com o perfil de chip e validação em larga escala subsequente utilizando qRT-PCR.

Materiais e Métodos

Estudo da População

Um grupo de 10 CRCs (incluindo 5 estágios II e III 5 estágio pacientes) e 10 controles normais foram primeiro preparados para miRNA profiling (Tabela S1). 191 idade independente e indivíduos pareados por sexo foram recrutados em para validação qRT-PCR em grande escala, incluindo 90 pacientes com CCR (Fase I-IV), 43 pacientes adenoma avançados e 58 participantes saudáveis ​​(Tabela S2, S3). amostras de tecidos emparelhados utilizados para a análise de expressão seleccionado miARNs foram fornecidos por outros 19 pacientes de CRC (Tabela S4). Pacientes com história prévia de tumores malignos, hereditária CRC não-polipose ou polipose adenomatosa familiar foram excluídos deste estudo. Amostras de sangue foram coletadas antes amostras de operação e de tecidos foram coletadas após a cirurgia. Tumor foi encenado acordo com a União Internacional contra o Câncer (UICC) orientações. O Comité das Fudan Hospital do Câncer da Universidade de Ética em Pesquisa Clínica aprovou os protocolos de pesquisa e consentimentos informados por escrito foram obtidas dos participantes.

RNA Isolation

Foram obtidos um montante de 5 a 10 mililitros de sangue total a partir de cada participante. O plasma foi obtido por centrifugação a 1200 g durante 10 min a 4 ° C. Para completar a remoção dos componentes celulares residuais, as amostras de plasma foram re-centrifugado a 12.000 g durante mais 10 min a 4 ° C. O plasma sobrenadante foi congelado em aliquotas separadas a -80 ° C até à sua utilização. Este procedimento foi levado a cabo dentro de 2 horas após a punção venosa. Um volume de 600 mL de plasma descongelado foi aquecida a 65 ° C durante 10 min e, em seguida, incubadas a 42 ° C durante 1 h, para desnaturar a proteína. O ARN total foi extraído a partir do plasma de pré-aquecimento utilizando o kit miRvana PARIS (Ambion, EUA), eluindo-o em 60 uL (95 ° C) água isenta de RNase. Em seguida, os ARN de plasma foram concentradas num volume final de 20 ul usando um Concentrador de Eppendorf Além disso 5301 (Eppendorf, Alemanha). Para a normalização de variação de amostra-a-amostra durante o isolamento do RNA e controle como interno, mesmo montante (25 fmol) do sintética C. elegans miRNA-39 (-miR-39 cel) foi adicionado em cada amostra desnaturado. O ARN total de tecidos de CRC foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA), de acordo com o protocolo fornecido. A concentração das amostras de ARN foi quantificada pela NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, EUA).

miARN Profiling

perfis miARN foi feito com um sistema miRCURY LNA ™ Universal PCR RT microARN (Exiqon, Demark ) em 2 de pool amostras de plasma de 10 CRCs (incluindo 5 estágios II e III 5 estágio pacientes) e 10 controles normais. O método baseia-se na transcrição reversa universal (RT), seguido por quantitativo em tempo real a amplificação por PCR com iniciadores de LNA ™ reforçados, com SYBR Green. Pré-iniciadores aliquotadas LNA ™ PCR foram estabelecidas em 384 poços placas de PCR de cada reacção por poço [16]. Um volume de 600 uL de cada amostra de plasma foi retirado para fora e misturados uniformemente. O ARN total foi preparado como descrito acima e uma quantidade de 500 ng foi usada para o próximo perfil. Um total de 742 miRNAs alvo foi detectado e dobre mudanças de cada expressão de miRNA foram calculados.

Quantificação dos miRNAs por qRT-PCR

Cerca de 30 ng enriquecidos RNA foi transcrito de forma inversa com um TaqMan microRNA reverso Kit de transcrição (Applied Biosystems, USA) em um volume de reacção de 10 uL. Os produtos de RT foram usadas como moldes para o próximo processo de PCR depois de uma diluição de 1:10. Os níveis de expressão de miARN foram quantificados em triplicado por qRT-PCR utilizando TaqMan humano MicroRNA Kits de Ensaio (Applied Biosystems, EUA) com um instrumento HT qRT-PCR ABI 7900 (Applied Biosystems, EUA). Ambos cravado em cel-miR-39 e endógena miR-16 foram utilizados como normalizadores para quantificação miRNA plasma, enquanto RNU6B de amostras de tecido.

Mirna Estabilidade em Plasma

A mesma amostra de plasma, divididos em várias aliquotas, foi submetido a uma série de tratamentos, tais como a incubação à temperatura ambiente para diferentes tempos (1, 2, 4, 8, 16, 24 h) ou submetendo-as a diferentes números de ciclos de congelamento /descongelamento a partir da temperatura de armazenamento ( -80 ° C) até à temperatura ambiente (22 ° C). Para avaliar a estabilidade do plasma miR-601 e miR-760, os valores Ct detectados por qRT-PCR que reflecte as concentrações das amostras experimentais foram comparados com aqueles submetidos os protocolos padrão.

Análise estatística

A expressão relativa de miARNs foi analisada pelo 2

– método △△ Ct. O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar a expressão de miARN no plasma entre os diferentes grupos. curvas (ROC) característicos receptor-operacional e a área sob a curva ROC (AUC) avaliou a viabilidade da utilização de plasma miRNA como uma ferramenta de diagnóstico para CRC. O índice Younden determinou o limite para as concentrações de miRNA de plasma. A correlação entre as características clinicopatológicas e níveis de miARN plasma foi determinada pelo teste de Mann-Whitney, o teste t-teste de Student ou Χ2. Todos os testes foram de 2 lados e um nível de significância de P 0,05 (IC 95%) foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística baseou-se em SPSS 16.0 (SPSS Ltd., UK) e gráficos foram gerados com Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, EUA).

Resultados

Mirna Profiling

Após a exclusão de vários alvos miRNA com valores Ct 35 em amostras de câncer para a sua extremamente baixa expressão, 86 miRNAs foram diferencialmente expressos entre CRC e controle com as mudanças dobra 2 (Tabela S5). Tanto miR-29a e miR-92a foram incluídos na lista up-regulamentados como já relatado anteriormente [15]. Alguns outros alvos desregulados, como tem-miR-95, -181b, -200C, -220 e -221, foram previamente relatados em CRC [13], [17]. Os dados brutos de miRNA perfil foi carregado no banco de dados GEO (GSE38716). A fim de restringir o escopo de estudo, um painel de 9-regulada miRNAs (HSA-miR-19a, -22 *, -24, -92a, -125a-5p, -210, -221, -376a e hsa- deixe-7e) e um painel de 13 miRNAs regulados negativamente (HSA-miR-10a, -141, -150, -188-3p, -192, -224 *, * -425, -495, -572, -601 , -720, -760 e HSA-let-7-a) foram selecionados com as mudanças dobra 5. Ao considerar o nosso objectivo de encontrar novos biomarcadores de plasma, 5 anterior relatado alvos (HSA-miR-92a, -141, -210, -221 e HSA-let-7-A) foram removidos [13], [17], [18], [19], [20], [21], [22], e os restantes 17 miRNAs foram selecionados para posterior validação qRT-PCR em larga escala.

valor diagnóstico de miR-601 e miR-760 para CRCs

para identificar os 17 miRNAs plasma diferencialmente expressos identificados pelo perfil de expressão, os seus níveis foram medidos por qRT-PCR em 90 CRCs e 58 controles normais normalizado para cravado em cel-miR-39. Tanto o miR-601 e miR-760 foram significativamente menores no CRC plasma em comparação com os controlos (P 0,0001, Figura 1). análise da curva ROC indicou seu valor potencial de diagnóstico e as AUC para miR-601 e miR-760 foram 0,747 (IC 95%: 0,666-0,828) e 0,788 (IC 95%: 0,714-0,862), respectivamente. Em um limiar de -11,50 para miR-601, a sensibilidade e a especificidade óptima foram 69,2% e 72,4% na separação de CRC dos controles normais. Em um limiar de -8,09 para miR-760, a sensibilidade e a especificidade foram de 80,0% e 72,4%, respectivamente. análise simultânea de miR-601 e miR-760 mostrou uma AUC semelhante de 0,792 (IC 95%: 0,719-0,865) como o miR-760, com 83,3% de sensibilidade e especificidade de 69,1%, indicando um efeito aditivo pobre dos miARNs 2 (Figura 2). Nós previamente identificado que o plasma miR-29a e miR-92a têm valor de diagnóstico significativo para CRC [15]. Para a maioria dos casos em que o estudo foi a mesma que no presente documento, estes dois alvos foram adicionados para análise da curva ROC combinado com miR-760. A AUC resultante aumentada para (IC 95%: 0,908-0,979) 0,943 com sensibilidade de 83,3% e 93,1% de especificidade em discriminar CRC do controlo, sugerindo o efeito aditivo no valor diagnóstico destas 3 miARNs (Figura S1, S2). A adição de miR-601 para estes três miARNs não melhorar o seu poder de diferenciação entre os pacientes de CRC e os controlos normais e resultou num mesmo AUC de (IC 95%: 0,907-0,978) 0,943. Além disso, não houve diferença significativa entre pacientes e controles CRC nos restantes 15 miRNAs (

P Art 0,05, dados não mostrados). Quando os dados qRT-PCR foi normalizado para miR-16 [15], plasma miR-601 e miR-760 ainda estavam significativamente regulada no CRC quando comparados com controles normais (

P

= 0,002 para miR- 601 e

P

. 0,0001 para miR-760, Figura S3)

validação em larga escala de miR-601 e miR-760 em amostras de plasma (n = 191). gráficos de dispersão dos níveis plasmáticos de miR-601 (A) e miR-760 (B) em indivíduos saudáveis ​​(n = 58), adenomas avançados (n = 43) e pacientes de CRC (n = 90). Os níveis de expressão das miARNs foram normalizados para CEL-miR-39. A linha representa o valor mediano. teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística.

Valor Diagnóstico de miR-601 e miR-760 para avançado adenomas

Para continuar a nossa investigação o valor diagnóstico da miR -601 e miR-760 no desenvolvimento de CRC, medimos sua expressão plasma em 43 adenomas avançados, que foram definidos como lesões pré-cancerosas do CRC. Os níveis plasmáticos de miR-601 e miR-760 foram notavelmente reduzidos em adenomas avançados em comparação com controles normais (

P

= 0,018 tanto para miR-601 e miR-760, Figura 1). Ambos os 2 miRNAs poderia fracamente diferenciar adenomas avançados de controles normais, como mostrado pela análise da curva ROC; ea AUC foi (IC 95%: 0,530-0,747) 0,638 para miR-601 e 0,682 (IC 95%: 0,576-0,789) para miR-760. A sensibilidade e especificidade óptima de miR-601 foram 72,1% e 51,7%, com um valor de corte de -10,73; estes valores para miR-760 foram 69,8% e 62,1%, com um valor de corte de -7,63. A análise combinada de miR-601 e miR-760 não conseguiu melhorar a eficácia de diagnóstico de miR-760 e mostrou uma AUC semelhante de 0,683 (Cl 95%: 0,576-0,789), com sensibilidade de 72,1% e especificidade de 62,1% (Figura 2). Além disso, a expressão de plasma miR-601 e miR-760 em adenomas avançados aumentou significativamente em comparação com CRCs (

P

= 0,0174 para miR-601,

P

= 0,0214 para miR-760, Figura 1). Quando normalizada para a miR-16, plasma miR-601 e miR-760 manteve-se regulada na adenomas avançados em comparação com controles normais (

P

= 0,0198 para miR-601 e

P

= 0,0184 . para miR-760, Figura S3)

(a, B, C) de miR-601 deu uma AUC de CI 0,747 (95%: ,666-,828) com sensibilidade de 69,2% e especificidade de 72,4% (corte- off value = -11,50) e miR-760 deu uma AUC de CI 0,788 (95%: 0,714-0,862), com 80,0% de sensibilidade e especificidade% 72,4 (valor de corte = -8,09) para discriminar CRC dos controles normais. A análise combinada de miR-601 e miR-760 revelou uma AUC de 0,792 (IC 95%: ,719-,865), com sensibilidade de 83,3% e 69,1% de especificidade. (D, E, F) de miR-601 produziu uma AUC de 0,638 (IC 95%: 0,530-0,747) com 72,1% de sensibilidade e especificidade de 51,7% (valor de cut-off = -10,73), e miR-760 revelou uma AUC de (IC 95%: 0,576-0,789) 0,682 com sensibilidade de 69,8% e 62,1% de especificidade (valor de corte = -7,63) para discriminar adenomas avançados de controles. análise combinada de miR-601 e miR-760 não melhorou a eficiência do diagnóstico, e deu uma AUC semelhante de 0,683 (IC 95%: 0,576-0,789). com sensibilidade de 72,1% e 62,1% de especificidade como miR-760

associação com características clínicas

Para demonstrar a tendência de diminuição de plasma miR-601 e miR-760 expressão em desenvolvimento CRC, casos de CRC foi estratificado por sua plataforma TNM. Os pacientes foram divididos em 5 grupos, de adenoma avançado (a lesão menos avançado) para o estágio IV CRC (a lesão mais avançada). Em comparação com controlos normais, os níveis de plasma de miR-601 e miR-760 foram reduzidas em todos os 5 grupos. Mais importante, esta ficou em linha com a tendência de diminuição da regulação dos níveis dos 2 miRNAs sendo menor no estágio IV pacientes e mais elevada na fase de pacientes que eu. Ambos os níveis plasmáticos de miR-601 e miR-760 foram reduzidos durante a progressão de CRC do normal através adenoma avançado para CRC (Figura 3). Não houve associação significativa entre estas 2 miRNAs e sexo, idade, estado nodal, localização do tumor, o tamanho do tumor ou histologia. (

P Art 0,05, dados não mostrados) parcelas

caixa de Os níveis plasmáticos de miR-601 (A) e miR-760 (B) em indivíduos normais (n = 58), adenomas avançados (n = 43) e pacientes com CCR (n = 90) com diferentes fases TNM (26 com I, 25 com II, 29 com III e 10 com IV). Os níveis de expressão das miARNs são normalizados para CEL-miR-39. As linhas dentro das caixas representam as medianas. teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística.

O antígeno carcinoembrionário (CEA) é um biomarcador utilizado para monitorizar CRC recorrência e não é um biomarcador de diagnóstico válida do ponto de vista clínico para a sua baixa sensibilidade e especificidade. No entanto, não há biomarcadores potenciais ideais para triagem CRC até à data e CEA ainda é servido como um indicador de tumor preliminar no exame de saúde. Para avaliar a possível complementação de plasma miRNA e CEA para a detecção precoce de CRCs, os dados CEA foram comparados com miR-601 e miR-760 níveis em 51 estágios I e II, os doentes. Os valores de corte de miR-601 e miR-760 a partir de análise da curva ROC foram -11,50 e -8,09, respectivamente. O valor de corte para a CEA foi de 5,0 ng /mL (ln 5 = 1.609). MiR-601 ou miR-760 identificou um adicional de 26 ou 29 casos perdidas pelo CEA sozinho, mostrando maior poder na diferenciação CRCs em fase inicial. uso combinado de miR-601 e miR-760 poderia detectados 30 casos CEA-atendidas no total. análise da curva ROC mostrou que a combinação de miR-601 e miR-760 pode melhorar a sensibilidade diagnóstica da CEA de 29,4% para 80,4%, com uma AUC de 0,805 (IC 95%: ,457-,683). (Figura S4)

miR-601 e miR-760 expressão em tecidos CRC

Para efeitos de cavar o relacionamento interior de expressão miARN entre o plasma e correspondente amostras de tecido de tumor, de miR-601 e miR-760 foram medidos em tumoral tecidos de outros 19 casos de CRC. Não foram encontradas diferenças significativas para ambos os 2 miRNAs entre o câncer e os tecidos não cancerosos (

P

= 0,32 para miR-601 e

P

= 0,43 para miR-760, Figura 4). A libertação dos miARNs pelas células de tumor para a circulação a ser afectado por vários parâmetros podem explicar a inconsistência. Além disso, não se sabe se as células tumorais podiam alterar os miARNs de libertação em sangue por outros órgãos ou células. validação de amostras maior foi necessária para confirmar miR-601 e miR-760 expressão em tecidos CRC.

Não foram encontradas diferenças significativas sobre a concentrações (B) miR-760 miR-601 (A) e entre os tecidos CRC e emparelhados tecidos não cancerosos (CTR) (n = 19). Os níveis de expressão das miARNs foram normalizados para RNU6B. A linha representa o valor mediano. teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística.

miR-601 e miR-760 Estabilidade em Plasma

Os níveis plasmáticos de miR-601 e miR-760 foram encontrados para ser estável depois de ser submetida aos tempos de incubação prolongada à temperatura ambiente, e os valores de Ct não mostraram variações significativas. Os resultados similares foram encontrados na experiência seguinte ciclos de congelação-descongelação (Figura 5). Portanto, considerou-se que eles eram bastante estável em amostras de plasma e dificilmente degradado durante configurações de protocolo e de armazenamento. Com base nestes resultados, concluímos que miR-601 e miR-760, basicamente, cumprido os requisitos para a aplicação clínica.

Os níveis plasmáticos de miR-601 e miR-760 mantiveram-se estáveis ​​após sala prolongada temperatura de incubação 1-24 horas (a) ou, pelo menos, 4 ciclos de congelamento e descongelamento (B).

Discussão

miRNAs desempenhar um papel importante na carcinogênese. Desregulação da expressão de miRNA ocorre em vários cancros, nomeadamente miR-143 e miR-145 em CRC [23]. MiRNAs pode contribuir para estratégias terapêuticas como biomarcadores de diagnóstico e fatores prognósticos em cancros [5], [6]. No entanto, os métodos de detecção baseados em biópsias permanecem invasivo e demorado para o rastreio e acompanhamento de pacientes com câncer. miARNs derivado de tumor primeiro descrito por Mitchell et ai. mostram claramente que miARNs estáveis ​​estão presentes no plasma humano e soro, o que abre um campo extremamente grande para a aplicação clínica [9], [24], [25], [26], [27].

Publicado relatos de miRNAs que circula no CRC são limitadas. No entanto, Ng et ai. encontrado que o miR-17-3p e miR-92 estavam significativamente elevados no soro de pacientes de CRC com redução significativa após a cirurgia. Além disso validação com um conjunto independente de 180 amostras indicaram que o miR-92 níveis no plasma podem distinguir entre cancros colorrectal e gástrica, doença inflamatória do intestino ou indivíduos normais [13]. E nós relatado anteriormente que o plasma miR-29a e miR-92a foram significativamente up-regulamentada em pacientes com CCR com bons valores de diagnóstico para rastreio CRC [15].

miR-601 e miR-760 foram 2 miRNAs de menos preocupação em malignidades. MiR-601, localizado dentro

gene DENND1A

que up-regulada no cancro do colo do útero, pode afetar as vias do fator kappa B sinalização nucleares em células de câncer de pulmão humano A549 [28], [29]. MiR-760, localizado dentro intron-1 de

gene BCAR3

, é regulada por estrógenos e tem uma menor expressão em tecidos CRC [30]. Não há estudos funcionais, desde então, a ser realizado nos 2 miRNAs. As informações sobre as suas relações com a carcinogênese permanece limitada, mas as nossas novas descobertas sugerem que o plasma miR-601 e miR-760 pode atuar marcadores de diagnóstico precoce como adequados para CRC.

Neste estudo, nós em primeiro lugar encontrados miR-601 e miR-760 foram regulados negativamente no CRC plasma por miRNA perfil e validado-los por qRT-PCR a partir de um total de 17 miRNAs selecionados. Demonstrou-se que os níveis plasmáticos de miR-601 e miR-760 foram reduzidos na neoplasia colorectal avançado em comparação com controlos saudáveis, e que o miR-760 foi mais proeminente do que o miR-601 como um biomarcador CRC. De acordo com a nossa experiência e estudos anteriores, 11% de concordância entre a triagem chip e validação foi baixa, mas aceitável. análise da curva ROC mostrou fraca expressão destas 2 miRNAs poderia contribuir para a detecção precoce do CRC com sensibilidade de 69,2% e 72,4% de especificidade para miR-601 (AUC = 0,747) ea sensibilidade de 80,0% e 72,4% de especificidade para miR-760 (AUC = 0,788). A combinação destes biomarcadores complementado CEA na detecção CRCs fase inicial (estágios I e II) tem um AUC de 0,805, com sensibilidade de 80,4% e 65,5% de especificidade. Além disso, combinado miR-601 e miR-760 também pode discriminar adenomas avançados de controlos saudáveis ​​dando uma AUC de 0,683 com sensibilidade de 72,1% e especificidade de 62,1%. Mais notavelmente, os níveis de ambos miR-601 e miR-760 caiu nos estágios I e II CRC, que elevou fortemente o seu valor potencial para a detecção precoce do CRC. Embora o valor diagnóstico de miR-601 e miR-760 pode ficar aquém de ser ideal, um painel de três plasma miRNA (miR-760, -29 e -92a) marcadores revelou boa eficiência de diagnóstico.

Não há consenso controles internos que sejam crucialmente importante na quantificação precisa dos níveis de RNA com qRT-PCR foram estabelecidas até à data. Confirmou-se que existe uma correlação linear foi existiu entre a quantidade de miARN sintéticos inseridos e os valores de Ct de qRT-PCR [31]. Neste estudo, CEL-miR-39 foi adicionado a cada amostra desnaturada durante os procedimentos de isolamento de ARN para a normalização [32]. Além disso, também usamos miR-16, um controle interno sugerido pelo nosso trabalho anterior, para normalizar os nossos dados qRT-PCR e obtiveram resultados semelhantes (Figura S3) [15]. No entanto, parecia que podemos obter uma melhor AUC quando normalizar com cel-miR-39, de modo cel-miR-39 foi selecionado para normalizar os dados qRT-PCR neste estudo (Figura S5).

Plasma As amostras podem ser recolhidas de forma não invasiva e não são por tempo limitado. Nós estabelecemos que miARNs extraídos a partir de uma amostra de plasma circulante mínima fosse bem adequado para fins de quantificação. Em comparação com outras moléculas contendo nucleótidos, tais como ADN e ARNm, miARNs são mais resistentes a ADNase e actividade de ARNase, tornando-os relativamente estável na circulação. Provamos que miR-601 e miR-760 foram bastante estável em amostras de plasma e sofreu pouca degradação após prolongada incubação à temperatura ambiente ou vários ciclos de congelamento e descongelamento.

Uma limitação do estudo foi que percepções moleculares para o causa da desregulamentação não foram próximas. níveis de circulação de miARN parecem reflectir a expressão tecido que tem sido demonstrado em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata e cancro da mama [9], [24]. Enquanto o miR-601 e miR-760 diminuiu os níveis não foram em tecidos de CRC, que não parecia consistir com que no plasma. Outra limitação do estudo é que os valores semelhantes, mas não complementares, diagnósticos foram encontrados entre estes dois miRNAs. A adição de miR-601 não melhorou o poder diferencial de miR-760 em discriminar neoplasia colorrectal avançado a partir de controlos normais. No entanto, a identificação de plasma miR-601 e miR-760 como biomarcadores deve agora detectar com mais precisão CRC em sua fase inicial. Ainda mais, a adição de miR-760 para os outros dois miRNA identificada anteriormente por nós revelou um valor de diagnóstico melhorada significativa, sugerindo que um painel de marcadores de miRNA de plasma pode melhorar a sensibilidade e especificidade deste ensaio para triagem CRC.

em conclusão, o plasma de miR-601 e miR-760 níveis de CRC e adenomas avançados são significativamente diminuído, o que sugere a possibilidade de que o plasma de miR-601 e miR-760 são novos biomarcadores para o diagnóstico clínico de CRC, mas mecanismos subjacentes da sua diminuição requerem uma investigação mais aprofundada.

Informações de Apoio

Figura S1.

Plasma miR-29a e expressão de miR-92a. Plasma miR-29a (A) e miR-92a (B) foram significativamente up-regulamentada em CRCs em comparação com controles normais (

P Art 0,0001,

P

= 0,0005). Adenomas foram simultaneamente diferenciado de controles normais (

P

= 0,0015,

P

= 0,0003). A linha representa o valor mediano. teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s001

(TIF)

Figura S2.

Combinada ROC análise da curva de miR-29a, miR-92a e miR-760. Combinado ROC análise da curva dos 3 miARNs (miR-29a, 92a-miR-760 e miR) produziu uma AUC de 0,943 (Cl 95%: 0,908-0,979) com sensibilidade de 83,3% e 93,1% de especificidade em discriminar CRC dos controles normais.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s002

(JPG)

Figura S3. expressão

plasma miR-601 e miR-760 normalizado pelo miR-16. Ambos CEL-miR-39 e miR-16 podia ser utilizado para normalização. MiR-601 e miR-760 foram ainda significativamente abaixo regulamentada no CRC e adenomas avançados em comparação com controles normais quando os dados qRT-PCR foi normalizado para miR-16. A linha representa o valor mediano. teste de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s003

(TIF)

Figura S4.

sensibilidades de diagnóstico de miR-601 e miR-760 em comparação com o CEA para a fase I e II CRCs. Os valores de corte de miR-601 e miR-760 a partir de análise da curva ROC foram -11,50 e -8,09, respectivamente. O valor de corte para a CEA foi de 5,0 ng /mL (ln 5 = 1.609). (A, B) classificações dois parâmetros mostrou que 26 e 29 casos (fase I e II) perdeu por CEA foram detectados complementar de miR-601 e miR-760, respectivamente. (C) miR-601 e miR-760 foram mais potentes do que o CEA em diferenciar a fase I e II CRCs de controles saudáveis ​​e uso combinado de miR-601 e miR-760 poderia detectados 30 casos CEA-atendidas no total. (D) A utilização combinada dos 3 marcadores produziu uma AUC de 0,805 (IC 95%: 0,457-0,683). Com uma sensibilidade elevada de 86,3%

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s004

(TIF )

Figura S5.

ROC análise da curva de plasma miR-601 e miR-760 normalizado para CEL-miR-39 ou miR-16. (A, B, C) normalizados para CEL-miR-39, plasma miR-601 deu uma AUC de 0,713 (IC 95%: 0,634-0,792), com 72,4% de sensibilidade e especificidade% 62,4 (valor de corte = -11,50) e miR-760 deu uma AUC de 0,754 (IC 95%: 0,682-0,826), com 72,4% de sensibilidade e especificidade% 72,2 (cut-off value = -8,08) para discriminar neoplasia avançada colorectal (CRC e adenomas avançados) dos controles normais . A análise combinada de miR-601 e miR-760 revelou uma AUC de 0,824 (IC 95%: 0,680-0824), com sensibilidade de 74,4% e 70,0% de especificidade. (D, E, F) Normalizado para miR-16, de plasma de miR-601 produziu uma AUC de 0,668 (Cl 95%: 0,588-0,748) com 74,1% de sensibilidade e especificidade de 53,4% (valor de cut-off = -7,63), e miR-760 revelou uma AUC de 0,724 (IC 95%: 0,651-0,798), com 87,9% de sensibilidade e especificidade% 48,9 (valor de corte = -4,81) para discriminar avançada neoplasia colorretal dos controles normais. análise combinada de miR-601 e miR-760 revelou uma AUC de 0,732 (IC 95%: ,661-,803), com sensibilidade de 43,6% e 94,8% de especificidade

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s005

(JPG)

Tabela S1.

informações do Paciente para miRNA perfil.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s006

(DOCX)

Tabela S2.

informações do Paciente para validação em larga escala.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s007

(DOC)

Tabela S3.

As características patológicas de adenomas avançados.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s008

(DOCX)

Tabela S4.

informações do Paciente para validação de tecidos CRC emparelhados.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s009

(DOCX)

Tabela S5.

miRNAs desregulamentado no CRC plasma com FC 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s010

(DOCX)