Abstract

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) regular a RNA mensageiro (mRNA) e, como tal, têm sido implicados em uma variedade de doenças, incluindo câncer. Os miRNAs regulam mRNAs através da ligação de “sequência de sementes (~ 7-8 nucleotídeos) para os mRNA 3 ‘do miRNA 5 UTRs; polimorfismos nessas regiões têm o potencial de alterar associações-miARN alvo de ARNm. SNPs nos genes de miRNA, bem como genes miRNA-alvo têm sido propostos para influenciar o risco de câncer através de níveis de expressão de miRNA alterados.

Métodos

miRNA-SNPs e miRNA-alvo gene-SNPs foram identificados através a literatura. Usamos SNPs a partir de dados Genome-Wide Study Association (GWAS), que foram pareados com indivíduos com dados de expressão de miRNA gerados a partir de uma plataforma Agilent para tumores de cólon e não tumorais tecidos emparelhados. Estas amostras foram utilizados para avaliar 327 miRNA-SNP pares para associações entre SNPs e os níveis de expressão de miRNA, bem como para as associações de SNP com câncer de cólon.

Resultados

Vinte e dois miRNAs expressos em não- tecido tumoral foram significativamente diferentes pelo genótipo e 21 SNPs foram associados com diferencial de tumor alterada /não tumor expressão miRNA através genótipos. Dois miARNs foram associados com o genótipo SNP para ambos os não-tumoral e de expressão diferencial do tumor /não tumor. Dos 41 miRNAs significativamente associados com SNPs todos, mas sete foram significativamente diferencialmente expressos em tecido de tumor de cólon. Dois dos 41 SNPs significativamente associados com os níveis de expressão de miRNA foram associados com o risco de câncer de cólon: rs8176318 (

BRCA1

), OU

AA CI 1,31 95% 1,01, 1,78, e rs8905 (

PRKAR1A

) ou

GG 2,31 IC 95% 1,11, 4,77.

Conclusão

dos 327 SNPs identificados na literatura como sendo importantes devido à sua regulação potencial dos níveis de expressão de miRNA , 12,5% tinham estatisticamente significativa associações com expressão miRNA. No entanto, apenas dois desses SNPs foram significativamente associados com o cancro do cólon

Citation:. Mullany LE, Wolff RK, Herrick JS, Buas MF, Slattery ML (2015) Regulamento SNP de Expressão microRNA e risco do cancro do cólon subsequente. PLoS ONE 10 (12): e0143894. doi: 10.1371 /journal.pone.0143894

editor: Geraldo A. Passos, Universidade de São Paulo, BRASIL

Recebido: 16 de setembro de 2015; Aceito: 10 de novembro de 2015; Publicação: 02 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mullany et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Com base em assinado formulários de consentimento dos participantes do estudo, que os dados só podem ser liberados para fins declarados no formulário de consentimento. solicitação de dados devem ser endereçadas ao Dr. Slattery que irá rever e completar conforme o caso. dados GWAS SNP estão sendo enviados para dbGaP pelo Instituto de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson, tanto para assuntos Utah e Minnesota (número repositório de dados ainda não estão disponíveis)

Financiamento:. O financiamento para este estudo foi recebido pelo Instituto Nacional do Câncer ( https://www.cancer.gov). Os números de subsídios são: CA163683 e CA48998. O financiamento foi recebido pelo MLS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não-codificantes, regulamentares [1-5] que têm a capacidade de alterar a expressão genética e função via assim biológica. Os miRNAs têm sido associados a várias doenças, incluindo o risco de câncer colorretal e sobrevivência [6-8]. A importância dos miRNAs no processo cancerígeno está em estudo intenso. Tem sido proposto que os SNPs localizados em loci de genes de miARN e mostrado para ser associado a cancro colorrectal pode estar a operar através da sua influência sobre os níveis de expressão de miARN [9]. Outros propuseram que SNPs dentro genes miARN alvo (isto é, ARNm) pode influenciar a ligação de miARN destes genes por meio da alteração de locais de ligação de miARN dentro do ARNm, causando expressão alterado de ARNm [10]. níveis de miARN maduro têm sido propostos para ser correlacionado com a presença dos seus mRNAs alvo

in vitro

dentro de organismos modelo [11], e como tal, os SNPs em genes alvo pode alterar a expressão de miARN devido a níveis alterados de ARNm. Assim, também foi proposto que SNPs dentro genes alvo miARN (mRNAs), que estão associados com um risco de doença pode estar a funcionar através da sua influência sobre miARNs. A maioria da regulação miARN ocorre através da ligação da região da semente miARN (~ 7-8 nucleótidos na extremidade 5 ‘UTR da miARN) à extremidade 3’ UTR do ARNm [12]; como tal, SNPs dentro da UTR 3 ‘de genes miRNA-alvo podem criar ou destruir locais de ligação de miRNA [10], e são de particular interesse para esta investigação.

Estamos em uma posição única para avaliar se SNPs em miRNA loci de genes e SNPs em genes alvo de miRNA influenciar a expressão miRNA no tecido do cólon, e por sua vez investigar se essas mesmas variantes influenciam o risco de cancro do cólon. Para testar a hipótese de que os SNPs alterar os níveis de expressão de miARN, usamos tecido não-tumoral e avaliar as diferenças na expressão de toda genótipo. No entanto, uma vez que um SNP pode alterar os níveis de expressão de miARN igualmente em ambos os tecidos de tumor e não de tumor, tal associação não seria, necessariamente, contribui para o risco do cancro. Para determinar se os SNPs são associados com o processo carcinogénico por regulação miARN, nós também avaliar se a expressão de miARN é diferente entre os genótipos entre tecidos tumorais e não tumorais. Além disso, nós avaliamos se miARNs que estão associados com os SNPs são diferencialmente expressos em tumores do cólon. Por fim, avaliar a associação entre SNPs associados com a expressão miRNA e risco de câncer de cólon.

Métodos

População do estudo

O estudo populacional consistiu de indivíduos inscritos anteriormente em um estudo da dieta, estilo de vida, e cancro do cólon, da Universidade de Utah e do Programa de Investigação médica Kaiser Permanente (KPMRP) [13] para os quais os dados GWAS, bem como miRNA do tecido tanto do tumor e não-tumor estava disponível, e nas cidades gêmeas área metropolitana em Minnesota para dados GWAS única (Tabela 1). Os sujeitos do estudo incluiu casos incidentes de câncer de cólon entre as idades de 30 e 79 que estavam não-hispânicos brancos, hispânicos ou Africano americano, e foram capazes de fornecer um consentimento informado assinado antes da participação no estudo. O estudo foi aprovado pela Universidade de Utah Institutional Review Board para seres humanos.

processamento de miRNA

RNA (miRNA) foi extraído de parafina tecidos fixados em formalina. Foram avaliadas as lâminas e blocos de tumor que foram preparados ao longo da duração do estudo antes de o tempo de isolamento miARN para determinar a sua conveniência. O patologista estudo analisou lâminas para delinear tecido tumoral e não tumoral. As células foram dissecados de 1-4 secções sequenciais em lâminas coradas de azul de anilina usando um H E de slides para referência. O ARN total foi extraído contendo miARN, isolado e purificado utilizando o kit de isolamento de RECOVERALL total Ácido Nucleico (Ambion); rendimentos de ARN foram determinadas utilizando um espectrofotómetro NanoDrop. 100 RNA total ng foi marcado com Cy3 e hibridado com Agilent Humano miRNA Microarray v19.0 e foram digitalizados em um Agilent microarray SureScan modelo de scanner G2600D. O microarray Agilent humano foi gerada usando informações conhecidas sequência miRNA compiladas no banco de dados v19.0 Sanger miRBase. O micromatriz contém as sondas para 2006 miARNs humanos únicos, com um a quatro sondas únicas para cada um dos miARNs conhecidos. A matriz miRNA contém 60.000 sequências humanas únicas e as médias de 30 repetições por sequência de sonda. Os dados foram extraídos a partir da imagem digitalizada usando Agilent v.11.5.1.1 software Extrato de Recurso. Os dados foram obrigados a passar parâmetros QC rigorosos estabelecidos pela Agilent, que incluiu testes para o fundo excessiva de fluorescência, variação excessiva entre sequência sonda replica na matriz, e as medidas do sinal total gene na matriz para avaliar baixo sinal. Se as amostras não cumpriram as normas de qualidade para qualquer um destes parâmetros, a amostra foi re-rotulados, hibridizado com matrizes e digitalizada. Se uma amostra falhou avaliação QC uma segunda vez a amostra foi considerada ser de má qualidade e o indivíduo foi excluído da análise a jusante. Para minimizar as diferenças que poderiam ser atribuídos à matriz, a quantidade de RNA, localização na matriz, ou outros fatores que poderiam influenciar erroneamente expressão, sinal total gene é normalizado pela multiplicação de cada amostra por um fator de escala estratificada por local do tumor. Dentro de cada local de tumor, o factor de escala [14] (https://genespring-support.com/files/gs_12_6/GeneSpring-manual.pdf) é a mediana do 75

percentis de todas as amostras divididas pela indivíduo de 75

percentil de cada amostra.

Nós nos referimos a miRNAs usando nomenclatura padrão usado no banco de dados miRBase [15]. Neste formato, as primeiras três letras representa o organismo, e estes são seguidos por um número único. O número é seguido por um hífen e o número (isto é, -1) se mais do que um códigos loci de miARN. Um sufixo letras denota miRNAs estreitamente relacionadas. Se dois miARNs são codificados pelo mesmo produto precursor, em seguida, o produto secundário é atribuído o sufixo (*). Se predominante /menor estado do produto não é conhecido, então o sufixo -5p -3p e são usados ​​para denotar a 5 ‘e 3’ do braço, respectivamente. Um exemplo seria, deixe-7 podem ser relatados na literatura anteriormente, no entanto, desde então, deixe-7 foi ainda delineada para várias sequências maduras estreitamente relacionadas e loci genômica, incluindo deixá-7a-3p, deixe-7a-5p, e deixar-3p-7b.

previamente testado a fiabilidade da Agilent Microarray ao longo do tempo, repetindo oito tumor e cinco amostras normais correspondentes (para um total de 13 amostras) que tinha ser verificados ao longo do curso do estudo , e o coeficiente de correlação encontrou repetibilidade de 0,98 [16]; comparação anterior de expressão Agilent miRNA para alguns miRNAs ao gerado pela qPCR mostrou uma concordância de 100% em termos de direção da mudança e dobrar mudança [17].

GWAS

Foi colhido sangue para os participantes que forneceu consentimento informado; estes participantes incluídos os do referido estudo da Universidade de Utah, KPMRP e, em Twin Cities área metropolitana em Minnesota [13]. GWAS dados foram obtidos utilizando Ilumina HumanHap 550K, 610k como parte do estudo GECCO e foi descrita anteriormente [18]. Imputação à HapMap2 lançamento 24 foi realizada utilizando MACH que foi imputada a HapMap Release 22 Usando o Beagle. amostras GWAS obtidos a partir de Utah e Minnesota estão sendo carregadas em dbGaP do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap) pelo Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson.

Seleção de SNPs relacionados ao miRNA

Uma pesquisa bibliográfica foi conduzida para identificar todos os SNPs relacionados ao miRNA mostrados para ser associado com a susceptibilidade a qualquer tipo de câncer e mais especificamente ao cancro colo-rectal [9,19-51]. Foram excluídos os SNPs de consideração que falharam medidas de qualidade Illumina ou procedimentos de controle de qualidade padrão [52]. Especificamente, SNPs foram excluídos se qualquer um dos seguintes critérios foram satisfeitos: i) pontuação Illumina GenTrain 0,6 ou separação aglomerado 0,4; ii) o genótipo discordantes chama em qualquer par de amostras de estudo duplicados; iii) erro mendeliana em qualquer uma das trios HapMap CQ ou um pequeno número de famílias identificados nos dados BEACON; iv) desvio considerável em relação Hardy-Weinberg (P 10

4)

Análise Estatística

O fluxo de dados do estudo é mostrado na Figura 1 e ilustra a sequência líder para a final. análise de miARNs e sua SNP relacionado. Nossa amostra foi composta por 344 indivíduos que tinham tanto os dados de miRNA e dados GWAS e 1.115 casos e 1.173 controles com dados de SNP para avaliação de risco de cólon. Começamos com um total de 559 pares de miRNA-SNP. Estes pares foram expandidos para abranger miARN terminologia específica (isto é, 3p, 5p, etc.) para se obter 835 pares de miARN-SNP para avaliação. A partir deste número, foram excluídos miARNs que não foram expressos em pelo menos uma amostra de cólon deixando 622 pares. Nós ainda excluída qualquer SNPs para as quais não tínhamos informações GWAS, deixando 552 pares. Também foram excluídos SNPs que não teve variação (ou seja, alguns com menor alelo em nossa amostra), deixando 548 pares. A nossa análise final incluiu 327 pares depois que nós ainda excluída qualquer miRNAs, e sua SNP associado, que não têm expressão no tecido do cólon não-tumor em pelo menos 5% da população.

Utilizamos várias ferramentas de bioinformática. DbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) foi utilizado para identificar as coordenadas SNP: todas as coordenadas cromossómicas são SNP do conjunto GRCh37 (GRCh37.p13). ferramenta de Ensembl Variant Efeito Predictor (VEP) foi utilizado através do site Ensembl GRCh37 (https://grch37.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html) para produzir localização variante e efeito. VEP foi utilizado usando todas as configurações padrão. Todos os SNPs foram encontrados em VEP. MiRNASNP v2.0, com base em 19 miRBase construir e versão dbSNP 137 (https://bioinfo.life.hust.edu.cn/miRNASNP2/index.php) [53] foi utilizado para identificar previu perdido e ganhou miARNs regulam como um resultado de 3 ‘UTR alterações nos genes de mRNA devido a SNPs associados com o risco de câncer de cólon. Estas foram então miARNs também avaliada com os seus associados SNPs para alterações significativas na expressão de miARN.

Nós avaliamos a expressão de miARN em ambos os tecidos do cólon e diferenças de expressão que não de tumor entre o tumor e o tecido não-tumoral para se obter uma melhor compreensão do como os SNPs referem-se a expressão de miARN. Olhando para tecido não-tumoral permitiram avaliar o efeito da expressão de SNP em miARN. Um SNP associado à expressão de miARN entre genótipos de tecido não-tumoral poderia influenciar o nível de expressão da linha de base da miARN mas não influenciam o risco de cancro se igualmente expressão alterada miARN em tumores. Assim, as alterações na expressão entre o tumor e o tecido não-tumoral foi avaliada pela sua importância potencial para o processo carcinogénico.

A análise estatística foi realizada em três fases. Primeiro, avaliamos a expressão miRNA para tendência linear entre os genótipos ajuste para idade, centro de estudo e sexo usando um modelo de regressão linear. Os valores de p foram gerados a partir do método de bootstrap [54], através da criação de uma distribuição de 10.000 β coeficientes dos genótipos e avaliando H

0: β = 0 versus H

1: p ≠ 0 usando R 3.1.2 (cran.r-project.org). Toda a análise estatística foi realizada utilizando os dados de expressão miRNA que era tanto normalizado e log2 transformado. As expressões médios reportados nas Tabelas 2, 3 e 4 são normalizados, mas não LOG2 transformados, a fim de apresentar os dados de uma forma mais intuitiva. Toda a análise subsequente foi realizada em SAS 9.4 4 (SAS Institute, Cary, NC). Relatamos p-valores brutos, uma vez que cada análise pareada foi especificamente hipótese, bem como um p-valor ajustado, levando em consideração todos os 327 comparações feitas usando a taxa de falsa descoberta (FDR) [55]. Em segundo lugar, nós avaliamos miRNAs e SNPs de pares previamente identificados para determinar sua associação com câncer de cólon. Nesta análise, nós avaliamos a expressão miRNA diferencial entre tumor e tecido do cólon não-tumor para determinar se a expressão miRNA foi diferencialmente expressos em tumores de cólon. Foi utilizado um teste t pareado para esta análise e valores P calculados usando 10.000 amostras de bootstrap. Finalmente, avaliamos o risco de câncer de cólon associada a SNPs que influenciaram significativamente a expressão miRNA usando análise de regressão logística. Relatamos Odds Ratio (OR) e intervalos de 95% de confiança (IC) que foram ajustadas idade, sexo, e um centro de estudo.

Resultados

Antes para o ajuste para múltiplas comparações, seis SNPs dentro genes de miARN e 16 SNPs dentro genes miARN alvo foram associados com miARNs expressos diferencialmente em tecido do cólon não-tumorais por genótipo (Tabela 2). Doze dos SNPs gene 16-miARN alvo estavam dentro UTR 3 ‘. Após o ajuste para múltiplas comparações, nenhuma das associações identificadas permaneceu estatisticamente significativa.

Seis SNPs nos genes de miRNA e 15 SNPs nos genes de miRNA-alvos foram identificados como sendo associados com os níveis de miRNA diferenciais entre tumor e tecido não-tumoral (Tabela 3); 12 dos 15 genes SNPs dentro miARN alvo ocorreu na UTR 3 ‘. Como foi visto com as associações não-tumorais, estas associações miRNA-SNP não foram significativas após o ajuste para comparações múltiplas.

Além disso avaliação de miRNAs que foram significativamente influenciados pela SNPs antes do ajuste para comparações múltiplas em qualquer não- tecido de tumor ou ao comparar as diferenças entre o tumor /não tumor (ver Tabelas 1 e 2, respectivamente) mostrou que apenas sete foram significativamente miARNs expressos diferencialmente entre tumor do cólon e o tecido não-tumoral (Quadro 4). Desses miARNs associados com SNPs em tecido não-tumoral (Quadro 2), nove miARN foram estatisticamente significativamente regulada negativamente em tecido de tumor e seis foram regulados positivamente. Avaliação de miARNs associados com SNPs no quadro 3 (expresso diferencialmente entre genótipo entre tipos de tecidos de tumor /não tumor) revelou que seis foram estatisticamente significativamente regulada positivamente e seis foram reprimidos no tecido do tumor em relação ao tecido não-tumoral. Dois dos três miARNs que foram observados em ambas as Tabelas 1 e 2, HSA-miR-146a-5p-HSA e miR-25-3p, foram estatisticamente significativamente regulada positivamente no tecido tumoral relativamente ao tecido não-tumoral (Quadro 4).

Avaliação das associações entre o câncer de cólon e SNPs que foram significativamente associados com os níveis de expressão de miRNA mostrou dois SNPs, que também foram significativamente associados ao aumento do risco de cancro do cólon (Tabela 5). Dentro do 3 ‘UTR de

BRCA1

, o genótipo homozigoto variante de rs8176318 foi associado com aumento do risco de cancro do cólon (OR

AA 1,34 IC 95% 1,01, 1,78. O miRNA associado, hsa-miR- 525-5p, não foi expresso numa grande parte da população com o genótipo homozigoto-rara, portanto, diferenças de expressão entre os genótipos pode ser atribuído à redução na percentagem expressa um segundo SNP, rs8905, dentro da UTR 3 ‘. de

PRKAR1A

foi associado a mais de um risco duas vezes maior de câncer de cólon (OR

GG 2,31 IC 95% 1,11, 4,77). um terceiro SNP, rs276466, foi associado com aumento do risco de cancro do cólon com o genótipo heterozigoto (OR

AG 1,21 IC 95% 1,02, 1,44) e não apenas o genótipo homozigoto rara e, portanto, pode ser uma associação espúria.

Discussão

tem sido sugerido que os SNPs associados com o risco de cancro do cólon podem ser funcionar através do seu impacto sobre a regulação miARN [9]. no presente estudo, nós investigamos SNPs dentro de regiões de genes de miARN e gene miARN alvo previamente relatados na literatura como estando associados a cancro, para avaliar se esses SNPs influenciar a expressão miRNA e alterar o risco de câncer de cólon. Dos 327 SNP pares /miARN avaliadas, 22 SNPs foram associados com significativa (P 0,05) diferenças na expressão de miARN no tecido não tumoral por genótipo, e 21 SNPs foram associados com a expressão de miARN diferencial significativa entre o tumor e o tecido não-tumoral pela genótipo. Avaliação desses SNPs com câncer de cólon mostrou apenas dois SNPs foram significativamente associados com o risco de câncer de cólon. Isto sugere que a maioria das associações hipótese não são suportadas quando avaliada directamente com os dados de miARN

dois SNPs em genes miARN-alvo foram identificadas como estando associadas a um risco aumentado de cancro do cólon.; esses SNPs também foram associados com expressão diferencial média estatisticamente significante miRNA através genótipos. Destes, rs8176318, localizado na 3 ‘UTR de

BRCA1

e previsto para ser um sítio de ligação para HSA-miR-525-5p quando o alelo G (ou de C em nossos dados) está presente [21] , foi associada com uma redução linear na expressão hsa-miR-525-5p no tecido não tumoral ao comparar homozigoto comum (CC) para homozigoto genótipos raros (AA). MiARN HSA-miR-525-5p também foi regulada negativamente no tumor, em comparação com o tecido não tumoral (p = 0,0044) e rs8176318 foi significativamente associado com um aumento no risco de cancro do cólon (OU

AA 1,34 1,01 95% CI, 1,78). Esta variante tem sido relatada como sendo associado com a diminuição da

BRCA1

expressão, aumento do risco de câncer de mama, e maior probabilidade de ter câncer de mama em estágio IV [56]. Os níveis de expressão deste miRNA são um pouco baixa, e pode, portanto, menos preciso, no entanto, em conjunto, estes resultados poderiam apoiar a alegação de que os rs8176318 SNP contribui para a incidência e progressão de alguns tipos de câncer de mama e cólon através de regulação miRNA alterado dentro desses tecidos.

foram também identificados outros SNP, rs8905, na 3 ‘UTR de

PRKAR1A

, que foi significativamente associada com a diminuição da expressão em tumores relativos ao tecido não-tumoral do miRNA que as metas

PRKAR1A

, hsa-miR-214-3p, em indivíduos do comum (TT) genótipo homozigoto, em comparação com o raro genótipos (TG, GG, respectivamente) heterozigoto e homozigoto. Além disso, uma percentagem muito maior de tecido não-tumoral não expressaram HSA-miR-214-3p no genótipo heterozigótico, em comparação com o genótipo TT (comum), e foi observado mesmo para a menor expressão rara genótipo homozigoto. HSA-miR-214-3p foi estatisticamente significativamente regulada no tumor contra tecidos não-tumorais, e os rs8905 SNP foi vista a aumentar significativamente o risco de câncer de cólon (OR

GG 2,31 IC 95% 1,11, 4,77). Neste caso, é provável que a alteração da expressão de miARN é causado pelo SNP e isto contribui directamente para o risco de tumores do cólon.

Os nossos dados suportam fez alguma da literatura em termos de associações de SNP e miARN. Num estudo recente, dois SNPs na região promotora do conjugado de HSA-miR-143/145, rs353292 e rs353293, foram significativamente associados com um risco aumentado de cancro colo-rectal (CRC) em uma população predominantemente chinês [9]. Como estes SNPs são na região promotora de miARN, Li et al. proposto que o mecanismo pelo qual estes SNPs aumento do risco de CRC foi através da expressão de HSA-miR143 /145 [9]. Na nossa investigação, tanto rs353292 e rs353293 foram associados com a expressão diferencial de HSA-miR-145-3p e HSA-miR-143-5p entre genótipos entre tecidos de tumor e não de tumor (Tabela 3). Em ambos os casos, a expressão miRNA foi maior entre os indivíduos com duas cópias do alelo comum (ou seja homozigoto genótipo comum) em tecido não-tumoral. Tendo uma cópia do alelo variante resultou em um decréscimo na expressão da miARN no tecido do tumor em comparação com o tecido não tumoral. Destes dois, hsa-miR-145-3p foi significativamente diferencialmente expressos entre tumor e tecido não tumoral, porém nenhum desses SNPs foram significativamente associados com câncer de cólon.

Dikaiakos et al. [44] relataram maior incidência de CRC entre os indivíduos com o genótipo CC e com o alelo C do rs2910164, que fica na região de precursor miRNA de hsa-miR-146a, e sugeriu que este aumento do risco é atribuído a alterações na expressão miRNA e alterações à sua estrutura [44]. Observou-se que o miR-146a é expresso diferencialmente entre os genótipos de rs2910164 para tecido não-tumoral, bem como entre os tecidos tumorais e não tumorais. Além disso, a expressão de HSA-miR-146a-5p foi estatisticamente significativamente regulada positivamente no tecido tumoral em comparação com o tecido não tumoral, sugerindo que este SNP pode influenciar a expressão de miARN. No entanto, ao contrário Dikaiakos, não observamos que esta SNP foi associada com câncer de cólon.

Em uma revisão por Ryan et al. [20],

AFF1

rs1053667

KIAA0423

(ou

FAM179B

) rs17703261 e, foram significativamente associados com o risco de não-especificado câncer. Nesse trabalho,

AFF1

rs17703261 foi inversamente associado com o risco de câncer (OR para a A /T foi CI 0,20, 0,58 0,34 95%) e

KIAA0423

rs1053667 foi diretamente associado com o risco de câncer ( OU para a C /T foi de 95% IC 3,29 1,72, 6,32) [20]. Os miRNAs que visam

AFF1 Quais são HSA-miRs-19a, -19b, -585 e -648. No nosso estudo, identificou-se uma diminuição significativa na expressão de HSA-miR-648 na rara (TT) genótipo homozigoto no tecido não tumoral. Além disso, descobrimos que a expressão deste miARN é significativamente regulada negativamente em tecido de tumor em comparação com tecidos não tumorais. No entanto, não se observou uma associação entre

AFF1

rs17703261 com o risco de desenvolver câncer de cólon. Os miRNAs que foram identificados como alvo

KIAA0423

em Ryan et al. foram HSA-miRs-19a e -19b. Foram identificados expressão significativamente mais baixa do conjugado de HSA-miR-19b-3p no genótipo heterozigótico, em comparação com o genótipo homozigoto comum em tecidos que não de tumor do cólon. Encontramos também expressão desse miRNA a ser regulada no tumor contra tecidos não-tumorais. No entanto, rs1053667 não foi associada a risco de cancro do cólon.

Wu et al. [43] investigaram vários SNPs dentro do 3 ‘UTR de genes na via de sinalização de B7 /CD28, envolvido na estimulação de células T, incluindo o rs7628626 (

CD80), rs1305 (

VTCN1

), e rs44044254 e rs1559931 (

ICOS

). Em seu estudo, eles encontraram um risco aumentado de CRC com o homozigoto raro genótipo do rs1305 e uma diminuição do risco de CRC com o codominante e modelo dominante para rs4404254 e rs1559931. Vimos ligeiramente reduzida, o risco de não significativa para todos estes SNPs com cancro do cólon.

tem sido sugerido que os níveis de expressão de miARN estão associados com a expressão dos seus genes-alvo correspondentes, e que a presença dos genes alvo evita a degradação miRNA por nucleases [11]. Para investigar esta relação, usamos miRNASNP v2.0 para avaliar SNPs dentro 3 ‘UTRs de mRNAs para mudanças na regulação miRNA previsto. Muitos dos SNPs discutido anteriormente tinham documentado perda ou ganho de miARN previu segmentação com base nas alterações do SNP faz na 3 ‘UTR do ARNm alvo, e, assim, a região de ligação da miARN. Um exemplo desta mudança é o SNP no

AFF1

, rs17703261 que está previsto para causar uma perda de segmentação por hsa-miR-648. Este miARN é ligeiramente regulada negativamente no tumor, em comparação com tecidos não tumorais em nossos dados. O genótipo homozigoto rara tem significativamente menos expressão de HSA-miR-648 do que os outros genótipos. Outros exemplos são

SLC10A7

rs105760 e

KIAA0423

rs1053667, que estão previstos para causar perda de segmentação por hsa-miR-25-3p e hsa-miR-19b-3p, respectivamente. Rs1053667 rs105760 e foram associadas com uma expressão reduzida em tumores em comparação com tecidos não tumorais dos miARNs perdidas previstas com o alelo variante. Um outro exemplo, rs9874 (

SELS)

está previsto para causar uma adquirida a segmentação por hsa-miR-181.º-5p, e nós vemos um aumento na expressão média entre tumor e tecido não-tumoral com o alelo variante. Além disso,

BRCA1

rs8176318, está previsto para ter um ganho de função para hsa-miR-20a-3p. Nós avaliamos este par miRNA /SNP e não ver uma associação entre o miRNA previu adquirida e este SNP. No entanto, como mencionado anteriormente,

BRCA1

rs8176318 foi associado com o G específica alelo (C em nossas mesas) miRNA hsa-miR-525-5p e fizemos ver uma redução na expressão de HSA-miR-525- 5p em tecidos que não de tumor com o alelo variante, bem como um nível reduzido de expressão significativo miARN no tecido do tumor, em comparação com o tecido não tumoral. Estes resultados suportam a teoria de que a perda da presença do alvo (como um resultado do SNP) provoca uma redução no nível de expressão de miARN.

Há várias considerações ao avaliar os nossos resultados. Em primeiro lugar, nosso estudo é composta de casos de câncer de cólon, enquanto muitos estudos incluídos tanto os casos de câncer retal cólon e. Diferenças em associações com câncer pode variar de acordo com as diferenças de casos definição. Nossas descobertas elucidar a complexidade da regulação miARN, especialmente o papel de SNPs no processo cancerígeno que envolve miARN. MiRNAs estão envolvidos na regulação de genes múltiplos e, mesmo que os SNPs foram associados com miARNs, a influência de miARNs em outros genes podem determinar a associação com cancro. Por exemplo, HSA-miRNA-25-3p, juntamente com a sua regulação da

SLC10A7

, está associada a

MCM7

,

MIR106B

,

MIR25

,

MIR93

e

AP4M1

e vários SNPs, rs105756, rs999885 e rs1527423. Isso pode tornar a interpretação dos resultados difícil. Embora existam limitações do estudo, uma força importante deste estudo é a capacidade de avaliar hipotéticos associações SNP /miRNA e avaliar SNPs associados e miRNAs com câncer de cólon.

Fora dos 327 pares exclusivos SNP-miRNA única avaliado 41 foram associados com os níveis de expressão de miARN. Destes, apenas dois SNPs foram associados com o risco de câncer de cólon. Embora tenha sido a hipótese de que SNPs em miRNA regiões podem influenciar o risco de câncer através da regulação miRNA, nossos dados sugerem que essas associações são relativamente raros quando se avalia o cancro do cólon.

Agradecimentos

O conteúdo deste manuscrito são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional do Câncer. Nós gostaríamos de agradecer Ulrike Peters pela supervisão e financiamento relacionado com os dados GWAS, Erika Wolff e Michael Hoffman para o processamento de miRNA e Sandie Edwards por seus esforços no acompanhamento estudo global e tumor coleta de tecido