Abstract

Quebrando o equilíbrio entre proliferação e diferenciação em células animais podem levar ao câncer, mas os mecanismos de manutenção este equilíbrio permanecem em grande parte indefinido. O cálcio activada canal de cloreto de A1 (CLCA1) é um membro da família de cloreto de cálcio sensíveis a condutância de proteínas e é expresso principalmente no cólon, intestino delgado e apêndice. Mostramos que CLCA1 desempenha um papel funcional na diferenciação e proliferação de células Caco-2 e de tecido intestinal. células Caco-2 diferenciar espontaneamente quer em cultura confluente ou quando tratadas com butirato, uma molécula presente naturalmente na dieta. Aqui, foram comparados os níveis Expressional CLCA1 entre pacientes com ou sem cancro colo-rectal (CRC) e determinado o papel funcional de CLCA1 na diferenciação e proliferação de células Caco-2. Nós mostramos que: 1) CLCA1 e CLCA4 expressão foram regulada para baixo significativamente em pacientes com CCR; 2) expressão CLCA1 foi regulado para cima em 2-Caco células induzidas a diferenciarem por cultura confluente ou por tratamento com butirato de sódio (NABT); 3) Queda de CLCA1 com ARNsi diferenciação celular significativamente inibida e promoveu a proliferação de células em culturas de células Caco-2 confluentes, e 4) Na cultura 3D Caco-2, a supressão de CLCA1 aumentou significativamente a proliferação celular e comprometida inibição induzida NABT de proliferação. Em conclusão, CLCA1 pode contribuir para promover a diferenciação espontânea e reduzir a proliferação de células Caco-2 e pode ser um alvo de inibição induzida por NABT de proliferação e, portanto, um potencial marcador de diagnóstico para CRC prognóstico

citação:. Yang B , Cao L, Liu B, McCaig CD, Pu J (2013) a transição da Proliferação de Diferenciação no câncer colorretal é regulado pelo cálcio muito activo Cloreto Canal A1. PLoS ONE 8 (4): e60861. doi: 10.1371 /journal.pone.0060861

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 14 Dezembro, 2012; Aceito: 03 de março de 2013; Publicação: 12 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Fundo NHS Endowment (12/50) para LC, JP e MDL, e Amigos da Anchor para JP e CDM. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em intestino dos mamíferos enterócitos são renovados continuamente a cada 4-8 dias. Isto ocorre através de uma série coordenada de eventos que envolvem a proliferação, diferenciação e migração das criptas intestinais para cima para o lúmen [1]. Perturbação do equilíbrio entre a divisão celular e a diferenciação pode conduzir a estados de doença, tais como cancro [2]. Alterações do equilíbrio bem regulada entre os enterócitos altamente proliferativas /menos diferenciadas e /estado altamente diferenciada não-proliferativa pode levar à hiperplasia, benignos (pólipos) ou tumores malignos [3]. A via de sinalização Wnt é o principal mecanismo de controlo da proliferação em enterócitos das criptas intestinais [4].

Canais

Ion contribuir para tumores através da regulação dos processos celulares básicos da proliferação, a diferenciação e a apoptose [5]. Por exemplo, KCNK9 (canal de potássio da subfamília membro do K 9) é abundante e contribui para a tumorigênese, promovendo a sobrevivência de células cancerosas no câncer de mama [6]. GIRK1 (G-proteína para o interior do canal de potássio de rectificação 1) expressão aumentada em pacientes com cancro do pulmão de células não-50/72-pequeno e a presença deste mRNA foi associado com taxas de sobrevivência significativamente reduzido de cinco anos [7]. Além disso, a proteína do canal TRPM8 (receptor transiente potencial canal de catião da subfamília M membro 8) um ​​marcador específico da próstata estava sobre-regulada no tecido tumoral [8]. Estudos que descrevem a ocorrência de canais iônicos individuais em células tumorais e as suas consequências funcionais no crescimento, migração ou invasão estão aumentando [9].

No cólon, canais de cloro (CLCs) formam uma grande família funcional com estruturalmente diversos membros que desempenham um papel importante na regulação do fluido epitelial e do transporte de eletrólitos [10]. A activação da corrente de cloro através de canais especializados regulada volume de aniões (VRACs) em resposta à célula inchaço (I

Cl, inchar) é um dos principais mecanismos pelos quais as células restabelecer o seu volume a seguir estresse hipo-osmótico (RVD) [ ,,,0],11]. Isto é importante uma vez que existe uma ligação directa entre a resistência à apoptose conferida pelo anti-apoptótica da proteína Bcl-2 e o fortalecimento da capacidade de RVD devido ao aumento da regulação do I

Cl, inchar [12]. Além disso, o (CLC3) proteína de canal de cloreto de 3 está entre os VRACs específicos da próstata e é sobre-regulada em células de cancro de próstata independente de androgénios [13]. canais de cloreto activados por cálcio (CLCAs) são também expressas em bovinos [14], do rato [15] e humano [16] enterócitos e existe uma correlação inversa entre os níveis de canal de cloreto (CLCA1 e CLCA2) Expressão e tumorigenicidade, indicando que eles agem como supressores de câncer de mama e colo-rectal [17], [18], [19]. No entanto, a função biológica detalhada de CLCAs permanece a ser determinada. Por isso, nós investigamos se CLCA1 contribui para a tumorigénese através da regulação do equilíbrio entre a proliferação e diferenciação em enterócitos.

A linha celular de cancro intestinal humano Caco-2 é um sistema modelo bem estabelecido para o estudo da diferenciação celular de enterócitos humanos desde diferencia espontaneamente em células polarizadas com características morfológicas e bioquímicas de pequenas enterócitos intestinais [20]. Além disso, as células Caco-2 também diferenciar quando exposta ao ácido gordo de cadeia curta fisiologicamente relevante, butirato [19]. ácidos gordos de cadeia curta duração (SCFA), principalmente o butirato, o propionato e o acetato, são produzidos no intestino através da fermentação de fibra dietética por microbiota do cólon [21]. Butirato, em particular, é a fonte de energia preferencial para as células da mucosa do cólon e exerce vários efeitos biológicos sobre células de mamíferos em cultura, incluindo inibição da proliferação celular, apoptose e indução de diferenciação [22], [23]. Devido a isso, o seu potencial terapêutico no cancro do cólon tem sido proposto [23]. células Caco-2, quando cultivada como uma monocamada confluente ou expostos a um tratamento de butirato de sódio (NABT), diferenciam-se para imitar fenotipicamente e funcionalmente maduros epitélio do cólon e são um modelo útil para investigar os mecanismos moleculares da diferenciação no CRC. Aqui, demonstramos que CLCA1 (cloreto de membro da família de canais de cálcio activada 1) desempenha um papel funcional na regulação da diferenciação e proliferação de células Caco-2.

Resultados

Down-regulação da CLCA1 a expressão em cancro colorrectal (CRC) pacientes

em primeiro lugar, investigou-se a nível de expressão em humanos dos canais de cloreto em tecidos normais e tumorais usando a base de dados de microarray de NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /geo /). Os níveis de expressão de CLCN2, CLCN3, CLCA1, CLCA4 e CFTR no paciente no início CRC foram significativamente reduzidos em 31%, 59%, 74%, 41% e 58% respectivamente, comparado com a mucosa de cólon normal (Fig. 1A). Para confirmar ainda mais a sub-regulação de CLCA1 em pacientes com CCR, utilizou-se coloração de imunofluorescência para detectar a expressão em ambos CLCA1 CRC e tecidos intestinais normais e encontrou a expressão de CLCA1 reduzida significativamente em CRC tecidos intestinais (Fig. 1B). Uma das características em tumorigênese é a baixa taxa alta de proliferação /diferenciação das células. Talvez CLCA1 contribui para tumorigênese regulando o equilíbrio entre proliferação e diferenciação em enterócitos.

A. valores de expressão crua normalizados dos membros da família do canal de cloreto foram analisados ​​em mucosa do cólon humano e tecidos CRC início de Gene Expression Omnibus (série de referência é GSE4017). CLCA1, CLCA4, CLCN2, CLCN3 e CFTR foram regulada para baixo significativamente em pacientes com CCR primeiros. Os valores são média ± S.E.M, *

p Art 0,01. B. Análise de imunofluorescência demonstraram que a expressão de CLCA1 foi reduzida em tecidos de CRC em contraste com a mucosa de cólon normal. Bar = 50 mm.

Up-regulação da CLCA1 induzidas por butirato de sódio em Caco-2 Células

Um efeito pró-diferenciação de butirato de sódio (NABT) tem sido estudado extensivamente em várias linhas de células malignas [24], [25]. Analisamos Ca

2 + padrões dependentes de expressão do canal de cloreto em células Caco-2 utilizando um ensaio de RT-PCR quantitativo (qPCR). Descobrimos que os níveis de expressão CLCA1 e CLCA3 foram upregulated 35 vezes, e mais de 100 vezes, respectivamente, após tratamento NABT 2 mM durante 24 horas (Fig. 2A). As transferências de Western mostraram que, adicionalmente, o aumento de proteína CLCA1 era dependente do tempo. Quando as células Caco-2 foram tratadas com NABT durante 24 horas, a expressão CLCA1 foi regulada positivamente de forma significativa em comparação com o grupo sem tratamento (Fig. 2B). No entanto, houve pouca ou nenhuma expressão de CLCA1 seguinte exposição mais curto (8 e 12 horas tratamentos, Fig. 2B). Expressão de CLCA1 em monocamadas não tratadas com NABT também apresentaram um aumento significativo às 24 horas (em comparação com 8 e 12 horas) culturas devido à diferenciação espontânea de células Caco-2 confluentes em culturas (Fig. 2B). NABT também elevados da expressão de fosfatase alcalina de intestino (ALPI) e β-catenina em células Caco-2 (Fig. 2C). Ambos são marcadores de diferenciação enterócito e são regulados positivamente em células diferenciadas. Os nossos dados sugerem que CLCA1 podem mediar a diferenciação celular induzida por cultura confluente e por NABT em células Caco-2.

. A expressão de ARNm de CLCA1, A2, A3 e A4 foram medidos utilizando RT-PCR quantitativo. CLCA1 e CLCA3 foram supra-regulados respectivamente em células Caco-2, após tratamento com NABT 2 mM durante 24 horas. Os dados são apresentados como média ± S.E.M de três experiências independentes, *

P

0,01. B. Caco-2 monocamada foi cultivada durante diferentes períodos de tempo com /sem tratamento 2 NABT mM. Expressão de CLCA1 foi detectado por Western blot. Na cultura confluente 8 e 12 horas, controlar nem NABT aumentou a expressão de CLCA1. Quando as monocamadas de Caco-2 foram cultivadas durante 24 horas, o controlo e com NABT expressão sobre-regulada CLCA1, mas NABT expressão aumentada CLCA1 muito mais do que foi visto nos controlos. C. NABT elevada ALPI e expressão β-catenina (marcadores de diferenciação) em culturas confluentes de células Caco-2. Os histogramas em B e C mostram a intensidade relativa de 90 KD, CLCA1 ALPI e β-catenina expressa como uma proporção em relação ao controlo de GAPDH. Todos os resultados foram de três experiências independentes.

CLCA1 é regulada em um estágio inicial durante espontânea Diferenciação de Caco-2 células em cultura confluente

Cultura de confluência induz a diferenciação espontânea de Caco células -2 [19], [24], [25], [26]. Usando esse modelo, foi perguntado se CLCA1 contribuiu para a diferenciação de células Caco-2. Em primeiro lugar, nós detectamos a expressão de CLCA1 e os dois marcadores de diferenciação ALPI e sacarase-isomaltase (SI) na cultura confluentes. Descobrimos que a expressão de CLCA1 (incluindo os dois diferentes da superfície celular associada a subunidades de 38 kD e 90 KD [16]) foi detectada em níveis muito baixos no início da cultura. No entanto, como culturas tornaram-se confluentes, expressão CLCA1 começou a aumentar de uma forma dependente do tempo. Este aumento na expressão era evidente dentro de 1 dia (Fig. 3A, 3B). Expressão de ALPI e SI também mostrou um dependente aumento da regulação de tempo significativo, mas isso não ocorreu até o dia 4, mais tarde do que para a expressão CLCA1 (Fig. 3C, 3D). Além disso, também detectada a expressão de β-catenina em diferentes dias de cultura confluentes de células Caco-2. Descobrimos que o β-catenina aumentou ligeiramente em células Caco-2 confluentes em monocamada (Fig. 3E). estudos de fraccionamento subcelular mostrou que o aumento de β-catenina foi atribuível a um aumento na fracção de membrana de β-catenina, enquanto que os níveis citosólicos permaneceram inalterados (Fig. 4B) [27]. Estes dados sugerem que a expressão de CLCA1 pode contribuir para a diferenciação espontânea de células Caco-2.

A e B. A expressão de subunidades de 38 kD (CLCA1 e 90 KD) foram sobre-reguladas após 24 horas de confluente cultura e atingiram um pico aos 10 dias de cultura. C. ALPI como um marcador de diferenciação celular Caco-2 foi regulada de forma significativa após 4 dias de cultura confluente. D. Expressão de sacarase-isomaltase (SI), um outro marcador de diferenciação celular, foi também significativamente aumentada após 4 dias de cultura confluente. E. Expressão de β-catenina foi aumentada ligeiramente ao longo do tempo na cultura. Os histogramas em A a E mostram a intensidade relativa de CLCA1, ALPI, SI e β-catenina expressa como uma proporção em relação ao controlo de GAPDH. Todos os resultados foram analisados ​​a partir de três experimentos independentes.

A. Caco-2 As células foram transfectadas transientemente com 0, 50, 100, 150 e 200 nM de ARNsi

clca1 e transferido para CLCA1. siRNA

clca1 a 100 nm ou CLCA1 acima efetivamente inibidos e reprimidos expressão de ALPI e β-catenina. B. coloração por imunofluorescência mostrou a expressão de β-catenina em culturas confluentes de células Caco-2. β-catenina foi localizado principalmente no núcleo das células nas fases iniciais da cultura (2 dias). Após 10 dias de cultura, β-catenina tinha translocado para a membrana celular. Knockdown de CLCA1 reduzida distribuição de β-catenina na membrana. C. células Caco-2 foram tratadas com ARNsi de controlo negativo ou siRNA

clca1 e em seguida foram cultivadas durante 72 horas. Os lisados ​​celulares foram recolhidos para a detecção de actividade de ALP utilizando o Kit de Detecção de Fosfatase Alcalina ou para expressão de ALP por western blot. O resultado mostra que tanto a actividade de ALP e expressão foram reduzidos significativamente em células CLCA1 knockdown. Os histogramas em A apresentaram a intensidade relativa de CLCA1 de 38 kD, 90 kD, e ALPI β-catenina expressa como uma proporção em relação ao controlo de GAPDH. Todos os resultados foram de três experiências independentes. **

p

. 0,01

CLCA1 é necessária para espontânea Diferenciação de Caco-2 Células

Para determinar o papel funcional da CLCA1 em Caco-2 diferenciação celular, foi utilizado um RNA curto interferindo furtiva (siRNA

clca1) para knock-down a expressão de cLCA1 em células Caco-2. Após 72 horas da transfecção, as células foram testadas para a expressão de CLCA1, ALPI e β-catenina por Western blot (Fig. 4A). Os nossos dados mostraram que a expressão CLCA1 foi regulada negativamente de um modo dependente da dose em resposta a concentrações crescentes de transfecção de siRNA

clca1. Para evitar efeitos fora do alvo por uma maior concentração de siRNA, escolhemos 100 nM siRNA

clca1 como uma concentração ideal para experiências posteriores.

ALPI e expressão β-catenina foram reduzidos significativamente após knockdown CLCA1. Além disso, a imagem confocal mostraram uma coloração da membrana celular reduzida de β-catenina em siRNA

células clca1 knockdown (Fig. 4B). Para confirmar adicionalmente o papel pró-diferenciação de CLCA1 em células Caco-2, foi detectada actividade de ALP utilizando um kit de detecção de diferenciação celular em células Caco-2. Os nossos dados demonstram que a actividade de ALP foi inibida significativamente em CLCA1 knockdown células (Fig. 4C). Estes resultados indicaram que a CLCA1 desempenha um papel fundamental na regulação da diferenciação espontânea de células Caco-2.

CLCA1 desempenha um papel anti-proliferativa em células Caco-2

O efeito antiproliferativo do NABT tem sido extensivamente estudada em diversas linhas celulares malignas [25]. Para verificar se CLCA1 apresentou um efeito anti-proliferativo em células Caco-2, que as células cultivadas em 3D Matrigel durante 5 dias para formar colónias. Verificou-se que o tamanho da colónia média em células Caco-2 CLCA1KD aumentou significativamente em comparação com as células de tipo selvagem (p 0,01, n = 50 cada). Quando as células foram tratadas com NABT 2 mm, o tamanho das colónias foi inibido significativamente em células Caco-2, mas em CLCA1KD células com tratamento de NABT o tamanho da colónia não foi significativamente reduzida (

P

0,05, n = 50 cada) (Fig. 5A). Estes resultados indicam que o efeito antiproliferativo dos NABT poderia ser mediada por CLCA1. Para confirmar ainda mais o efeito de CLCA1 sobre a proliferação, avaliamos esta via ethynyldeoxyuridine (UDE) a incorporação em células Caco-2. Verificou-se que a proliferação de células Caco-2 foi reduzida em 3 dias de culturas confluentes. No entanto, a proliferação de células Caco-2 foi promovida de forma significativa em siRNA

clca1 células tratadas quando comparado com um siRNA controlo negativo (células

P

0,01, n = 100 cada) (Fig 5B.). Juntamente com a cultura 3D, estes resultados mostram que a expressão de CLCA1 contribui para a regulação da proliferação em células Caco-2.

. Caco-2 As células, quer tratado por ARNsi de controlo negativo, ou com ARNsi CLCA1 sozinho, ou com adição de NABT foram semeadas no Matrigel a 25% e mantidas em 5% de CO

2 e 37 ° C durante 5 dias. O diâmetro de quistos foi medida e analisados ​​utilizando o software Metamoph. O tamanho da colônia média de Caco-2 células CLCA1 knockdown aumentou significativamente em comparação com células de controlo. NABT inibiu significativamente o tamanho da colônia, mas knockdown de CLCA1 comprometida redução induzida NABT do tamanho da colônia. Ampliação da objectiva é de 10 ×. 50 cistos foram medidos em cada grupo numa experiência. B. células Caco-2 foram tratadas com controlo negativo ou CLCA1 siRNA e cultivadas durante os dias indicados. A proliferação celular foi detectado com um ensaio de incorporação EdU. EdU foi visualizada usando Alexa Fluor 594 (Red) e DNA para DAPI (azul). O histograma apresenta a% de positivos EdU células em diferentes grupos e mostra que knockdown de CLCA1 aumentou significativamente a proliferação celular.

valores P Quais são mostrados no histograma. N = 100 de cada grupo em um experimento. Barra de escala = 100 um de A, 50 mm em B. Os resultados são apresentados como uma média ± SEM de três experiências independentes.

Discussão

A proliferação de transição diferenciação (PDT ) é um passo crítico na renovação contínua de um epitélio intestinal normal de células [1] e epiteliais do cólon estão entre os modelos mais bem estudados da tumorigênese desde a sua renovação constante requer uma estreita regulação do PDT [3], [28]. Muitas lesões genéticas, incluindo mutação do APC e p53, produzir transformação neoplásica do enterócito cólon. Além disso, durante a organogénese, as células-tronco executar o silenciamento de genes de proliferação ea ativação de genes de diferenciação de uma forma temporal, passo a passo. insights importantes sobre as moléculas que possam servir como alvos para a terapia poderia ser adquirida a partir de uma plena compreensão dos mecanismos moleculares destes processos. Aqui, encontramos que o cálcio activado CLCA1 canal de cloreto desempenha um papel crucial na regulação e manutenção do PDT no enterócito cólon, uma vez que a perda de CLCA1 levou a reversão de células a um baixo status diferenciado.

CLCA1 Regulamenta o PDT em intestinais as células epiteliais

O PDT de células progenitoras única é rigidamente regulados por morphogens, fatores de crescimento e hormônios [29] e alterações moleculares para componentes específicos das vias de sinalização utilizadas por essas diferentes classes de moléculas são importantes durante o desenvolvimento de cancro [30]. Dessas mudanças, a regulação positiva de inibidores de CDK (CKI) p21

Cip1 /WAF1 e p27

KIP1 em muitas células terminalmente diferenciados [31], sinalização de Wnt /β-catenina induzir a diferenciação de células musculares [32], dependente de SOX9 PKCα repressão favorecendo a proliferação e diferenciação de inibição [33] foram relatados. O nosso estudo anterior demonstrou que a CLC-2, (canal de cloreto de 2 e 4) e CFTR CLC-4 (regulador transmembranar da fibrose cística, um canal de cloreto) foram expressos a nível significativamente mais elevado em tecidos corneais humanos isolados de fresco do que em células epiteliais de cultura ( cultura primária ou uma linha celular) [34]. À medida que o número de células de camadas aumenta, o nível de expressão do gene e proteína de intensidade de coloração CLCA2 (membro do canal de cloreto activado por cálcio 2) foi significativamente aumentada [35]. Isto indica que os CLCs (canais de cloreto) pode contribuir para a regulação da diferenciação no desenvolvimento de tecidos epiteliais. Além disso, a actividade de Cl

– canais varia de acordo com o ciclo celular e a perda dos canais de cloreto activados por cálcio iria proporcionar uma vantagem significativa do crescimento de células tumorais [14], [15], [35], [36], [37]. Em CRC, CLCA1 e CLCA2 foi significativamente regulada negativamente em aproximadamente 80% dos pacientes [19]. A perda de expressão de ambos mCLCA1 e mCLCA2 durante a tumorigénese sugerido que a activação de qualquer um forte pode inibir a sobrevivência de células de tumor [16]. CLCA2 é necessário para a diferenciação epitelial e a sua perda durante a progressão do tumor contribua para a metástase [38]. As células em proliferação Caco-2 espontaneamente iniciar o processo de diferenciação, quando as células atingiram a confluência. Este programa de diferenciação celular é iniciada após o contacto célula-célula e o interruptor da proliferação de diferenciação pode ser desencadeada por eventos bioquímicos específicos, incluindo E-caderina mediada adesão célula-célula [20]. canais de cloreto são proteínas de membrana e pode desempenhar um papel importante na comunicação célula-célula após a adesão célula-célula. Colectivamente, isto implica que as CLCAs pode desempenhar um papel funcional na tumorigénese através do controlo da proliferação e diferenciação de equilíbrio.

O precursor CLCA1 é de cerca de 900 aminoácidos de comprimento, com um local de clivagem proteolítica a seguir a sequência de sinal amino-terminal. Eventualmente, dois produtos de uma 90-kDa e 30-40 kDa desempenham papéis funcionais [15], [16], [36], [37]. CLCA1 está estreitamente correlacionada com a transcrição de c-

myc,

um proto-oncogene cujo produto está intimamente envolvida na regulação da proliferação celular e apoptose [39]. Neste estudo, verificou-se utilizando microarrays que a expressão de CLC2, CLC3, CLCA1, CLCA4 e CFTR foram sub-regulada de forma significativa em pacientes de CRC início e esta expressão reduzida de CLCA1 foi confirmada por coloração de imunofluorescência de tecidos de pacientes de CRC (Fig. 1 ). Além disso,

in vitro

mostrámos que CLCA1 estava envolvido na regulação da diferenciação e da proliferação de células Caco-2. Quando CLCA1 em células Caco-2 foi inibida com ARNsi

clca1, tanto NABT-induzida e diferenciação espontânea foi reduzida significativamente (Fig. 4), enquanto que a proliferação aumentou significativamente (Fig. 5). Estes dados sugerem que a activação de CLCA1 pode ser crucial na manutenção do equilíbrio entre a diferenciação e a proliferação dos enterócitos.

Além disso, a elevada especificidade de tecido da transcrição de alguns CLCs [40], inicialmente sugerido que a detecção do seu ARNm em tecidos específicos pode ser útil para o diagnóstico precoce, estadiamento molecular e vigilância pós-operatória [19]. Importantemente, os nossos dados mostram que inadequado transcrição dos canais de cloreto não apenas incluídos CLCA1, mas também CLC2, CLC3, CLCA4 e CFTR, indicando que os defeitos de transporte ou de cloreto de cloreto de corrente pode desempenhar um papel-chave na CRC. A activação da corrente de cloreto através de canais de aniões regulada volume especializadas (VRACs) é um dos principais mecanismos pelos quais as células restabelecer o seu volume a seguir estresse hipo-osmótico (RVD) [11], enquanto que o transporte transepitelial de cloreto também contribui para o potencial transepitelial diferença (TEP) em intestino [41]. O TEP é uma propriedade inerente de epitélios que transportam e surge de gradientes de iões transportados direccionalmente através de camadas de células epiteliais. Do outro lado intestino humano, há uma TEP de -25 ± 7 mV, lúmen negativo. Será interessante para testar a nova noção de que o TEP podem desempenhar papéis reguladoras no controle PDT e tumourgenesis de intestino.

β-catenina está envolvido na proliferação de células-driven CLCA1 e Diferenciação

A via Wnt é altamente conservada em todo o mundo animal [4]. β-catenina é uma molécula central na via Wnt canónica que regula a diferenciação epitelial intestinal [4], [42], [43]. Além disso, o β-catenina /TCF (factor de células T) via também regula a proliferação das células epiteliais do cólon [33]. Em células C2C12 de mioblastos de rato, via de sinalização Wnt β-catenina pode actuar como um comutador molecular que regula a transição da proliferação de células de diferenciação miogénica [44]. Além disso a maioria dos casos de CRCs surgir a partir de inactivação de mutações na polipose adenomatosa coli (

APC) do gene, que controla β-catenina degradação [28], [45], [46]. Colectivamente, isto sugere que a via β-catenina desempenha um papel fundamental na PDT. Em Caco-2 culturas confluentes, enquanto se diferenciam, β-catenina demonstrou um aumento dependente do tempo na membrana celular (Fig. 3) [27] e quando CLCA1 foi derrubado, β-catenina foi regulada negativamente de forma dramática na membrana celular (Fig. 4). Os nossos dados implica que β-catenina está envolvido na cascata de eventos que conduzem à diferenciação e esta é accionada por activação CLCA1 em células Caco-2.

CLCA1 como um alvo de butirato em Pro-diferenciação e antiproliferação

butirato é um dos ácidos gordos de cadeia curta (SCFA mais abundantes) e desempenha um papel-chave na homeostasia epitélio do cólon. Ele é oxidado em acetil CoA na mitocôndria e representa o principal combustível para enterócitos normais [47], [48], bem como para as células cancerígenas do cólon [49]. Em células cancerígenas do cólon humano, butirato inibe o crescimento celular [49], [50], [51] e promove a diferenciação celular [52]. Além disso, a diferenciação induzida pelo butirato de células PC12 de células cromafins envolve adesão celular apertado e a indução de proteínas de adesão celular extracelulares [53]. efeitos anticancerígenos de butirato foram observadas utilizando linhas celulares de carcinoma

in vitro

. Nestes modelos, butirato leva à inibição da proliferação, indução de apoptose, ou a diferenciação de células de tumor [54], [55], [56], [57]. Além disso, muitos mecanismos de efeitos anticancerígenos de butirato têm sido relatados, por exemplo, é um inibidor da histona desacetilase [58], [59], [60], [61], aumenta p21 (

WAF1

) e a expressão do gene induz a paragem do ciclo celular G1 [62]. Butirato também sub-regula a chave apoptótica e angiogénese regulador de neuropilina-1 (NRP-1) para inibir a migração de células do tumor e a sobrevivência no cancro do cólon [63]. Além disso, as proteínas da família butryrate dysregulates Bcl2 [64], [65], e induz a expressão GPR109A activação do receptor para causar apoptose específica da célula tumoral [66], e modula a sinalização de Wnt canónica [67]. Butirato também aumenta a diferenciação de células de cancro do cólon humano LIM2537, diminui a actividade de GSK-3β e aumenta os níveis de ambos e apc /axina /GSK-3p piscinas complexos associados da β-catenina [39] ligada à membrana. Butirato é reconhecida por seu potencial para agir em quimioprevenção secundário [68]. Os nossos resultados indicam que CLCA1 como um alvo de butirato, eficazmente regular pró-diferenciação e antiproliferação em células Caco-2 (Fig. 2 e 5).

Em resumo, que revelam um novo mecanismo que regula CLCA1 o /β-catenina Wnt conduzido diferenciação espontânea e induzida pelo butirato de enterócitos. Isto indica que pode controlar CLCA1 PDT de enterócito e, portanto, actuar como um supressor de tumor colo-rectal em tumorigénese. A perda da expressão CLCA1 inibe a diferenciação enterócito e pode levar ao desenvolvimento do cancro do cólon. Assim, uma melhor compreensão do fenótipo CLCA1 no epitélio colónico e os mecanismos subjacentes a perda de expressão em carcinomas podem fornecer um meio de intervenção terapêutica através de reversão da progressão da carcinogénese colorectal humano.

Materiais e Métodos

tecidos de Ética Declaração

o cólon e reto foram obtidos a partir de cirurgia de pacientes no Departamento de cirurgia Geral, o Hospital 309 de PLA, Beijing, China. A aprovação ética para o estudo foi concedido pelo Hospital 309 da Comissão de Ética PLA. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo.

células

Cultura celular

Caco-2 (ATCC, HTB-37) foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen , Reino Unido), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, aminoácidos não essenciais, 50 U /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. butirato de sódio foi adquirido de Sigma-Aldrich, Reino Unido.

Knockdown de CLCA1 com siRNA

Knockdown de CLCA1 foi realizada utilizando BLOCK-iT ™ RNAi Expresso motor de busca (Invitrogen, UK). Discrição RNAi ™ siRNA duplex com sequências com sentido vertente 5’CAAUGCUACCCUGCCUCCAAUUACA-3 ‘foi apresentado em uma pesquisa BLAST de bibliotecas de ESTs humanos para assegurar que outros genes humanos não foram alvejados. Em resumo, as células foram cultivadas em DMEM contendo FBS a 10% sem antibióticos um dia antes da transfecção. células Caco-2 foram então transfectadas com ARNsi específicos CLCA1 utilizando Lipofectamina 2000 diluído em Opti-MEM I meio de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, UK) com uma concentração final de siRNA 50-200 nM para a optimização da transfecção de siRNA. Não segmentação siRNA controlo negativo foi utilizado para os efeitos não-específicos das sequências destas moléculas. Para culturas em monocamada 10 dia, 5 × lamelas 10

4 células foram plaqueadas em colagénio I pré-revestimento ou placas de 12 poços. 100 nM de siRNA duplex foi transfectado na 2

º e 6

º dia de cultura. Após 10 dias em cultura, as células em lamelas foram fixadas e as células na placa de 12 poços foram lisadas para análise de Western blot.

PCR quantitativa

Caco-2 As células foram cultivadas em DMEM com /sem tratamento 2 NABT mM durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO

2. O ARN total foi isolado utilizando TRIzol ® Reagent (Invitrogen, UK). O ADNc foi sintetizado com células SuperScript ™ III directa de cDNA Synthesis System (Invitrogen, UK). O nível de expressão de CLCA1, CLCA2, CLCA3 e mRNA CLCA4 foram determinados utilizando quantitativa em tempo real reação em cadeia da polimerase (qPCR). Os iniciadores de PCR foram concebidos utilizando Primer3 on-line [34]. CLCA1 humana, sequências CLCA2, CLCA3 e mRNA CLCA4 foram baixados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) GenBank. Regiões que correspondiam à sequência de consenso para CLCA1, CLCA2, CLCA3 e CLCA4 foram escolhidos para os iniciadores de PCR (Tabela 1). Iniciadores foram escolhidos para serem 20 pb de comprimento, com um teor de GC de 55% e sem longas repetições de uma única base. 01:05 diluída cDNA foi utilizado para executar qPCR (SYBR verde, Roche, Suíça), em LightCycler®

480

sistema.