Abstract
Fundo
A curcumina inibe o crescimento de linhagens de células de câncer de esôfago; No entanto, o mecanismo de acção não é bem compreendido. Torna-se cada vez mais claro que a activação aberrante de Notch tem sido associada com o desenvolvimento de cancro do esófago. Aqui, nós determinamos que a curcumina inibe o crescimento do câncer de esôfago através de um mecanismo mediado através da via de sinalização Notch.
Metodologia /Principais Achados
Neste estudo, nós mostramos que o tratamento curcumina resultou em uma dose e inibição dependente do tempo da proliferação e colônia formação em linhas de células de câncer de esôfago. Além disso apoptose, induzida por tratamento curcumina através da activação da caspase 3, confirmada por um aumento na proporção de Bax para Bcl-2. análise do ciclo celular demonstrou que o tratamento curcumina morte celular induzida e os níveis de ciclina D1 para baixo regulamentados. tratamento curcumina também resultou em número e tamanho dos esophagospheres reduzida. Além disso, o tratamento conduziu a curcumina reduzida Notch-1 de activação, expressão de Jagged-1 e o seu objectivo a jusante HES-1. Esta redução na Notch-1 activação foi determinada como sendo devido à regulação negativa das componentes críticos das proteínas do complexo y-secretase, como Presenilina 1 e Nicastrina. A combinação de um inibidor de DAPT γ-secretase conhecido e curcumina diminuiu ainda mais a proliferação e apoptose induzida em células de cancro esofágico. Finalmente, o tratamento curcumina regular negativamente as expressões de Notch-1 específica microRNAs miR-21 e miR-34a, e regulada positivamente supressor de tumor let-7-miRNA.
Conclusão /Significado
A curcumina é um potente inibidor do crescimento do câncer de esôfago que tem como alvo os Notch-1 ativando proteínas complexas y-secretase. Estes dados sugerem que a inibição da sinalização Notch é um novo mecanismo de acção para a curcumina durante a intervenção terapêutica em cânceres de esôfago
Citation:. Subramaniam D, Ponnurangam S, Ramamoorthy P, pe D, Battafarano RJ, Anant S, et al . (2012) curcumina induz a morte celular em células de câncer de esôfago, através de modulação sinalização Notch. PLoS ONE 7 (2): e30590. doi: 10.1371 /journal.pone.0030590
editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 31 de outubro de 2011; Aceite: 19 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Subramaniam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho foi suportado por concessões do NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de esôfago é o oitavo câncer incidente mais comum no mundo eo sexto na mortalidade por câncer [1]. Nos Estados Unidos, 4-10 em 100.000 pessoas sucumbem à doença por ano e a incidência global da doença é maior em homens com mais de 50 anos de idade [2]. A American Cancer Society (ACS) estima que, em 2011, 16,980 americanos (13.450 homens e 3.530 mulheres) serão diagnosticados com câncer de esôfago. A ACS também estimou que a maioria desses indivíduos [14, 710 americanos (11.910 homens e 2.800 mulheres)] iria morrer de câncer de esôfago em 2011 [3]. adenocarcinoma de esôfago, a principal forma de câncer de esôfago em os EUA, é o câncer mais rapidamente crescente no mundo ocidental. É geralmente diagnosticado numa fase tardia e tem um mau prognóstico, com uma sobrevida de menos de 10% em 5 anos. Embora o actual tratamento inclui quimioterapia, terapia de radiação, e, se possível, a ressecção esofagogástricas, muitos pacientes com adenocarcinoma esofágico experiência progressão da doença apesar de tal tratamento, o que sugere que tais tumores são resistentes à terapia padrão.
Como terapias convencionais , incluindo a ressecção cirúrgica, quimioterapia e radiação são muitas vezes inadequadas no tratamento desta doença, novas opções de tratamento são extremamente necessárias. Apesar do surgimento de novos agentes direcionados e a utilização de várias combinações terapêuticas, não estão disponíveis opções de tratamento que são curativas em pacientes com cancro avançado. A magnitude deste problema exige a necessidade de novos agentes terapêuticos, especificamente a utilização de agentes de quimioprevenção. Este é mais atraente para o adenocarcinoma de esôfago desde uma condição pré-maligna de esôfago de -Barrett é uma lesão bem reconhecida.
A curcumina, um pigmento fito-polyphenolic derivado de cúrcuma (
Curcuma longa
), foi demonstrado que tem múltiplos efeitos anticancerígenos, incluindo a inibição da proliferação, indução de apoptose, a inibição da angiogénese, e a inibição da topoisomerase de ADN II [4]. A curcumina também induz a morte-apoptose independente, como autofagia em células cancerosas esofágicas [5]. Estudos recentes têm demonstrado que a curcumina promove a apoptose, aumenta a quimiossensibilidade, e inibe a NF-kB em adenocarcinoma esofágico [6] [7].
sinalização Notch desempenha um papel crítico no desenvolvimento e homeostasia dos tecidos através do controlo do cell- decisões fate, proliferação, diferenciação e apoptose. via de sinalização Notch está implicada em células estaminais auto-renovação, a determinação de células-destino, a proliferação, a diferenciação e a apoptose [8]. sinalização Notch é regulada em cânceres de esôfago e tem sido proposto como um alvo terapêutico para o câncer de esôfago [9] [10]. sinalização Notch é iniciada quando um ligando entalhe interage com um receptor transmembranar de entalhe em um células adjacentes [11] [12]. Este processo geralmente inicia a γ-secretase libertação proteolítica mediada do domínio intracelular de Notch (NiCd), que, por sua vez, se transloca para o núcleo das células [13]. O NiCd no núcleo interage com o de ligação promotor do factor 1 (CBF1) co-factor de transcrição C e transactiva os genes alvo, tais como aqueles em o intensificador cabeludo e de separação (HES) e Hes relacionada com motivo YRPW (Ei) famílias [ ,,,0],12] [14]. Estudos recentes demonstraram uma ligação entre a curcumina, Notch e NF-kB. Notch-1 via de sinalização tem sido demonstrado directamente para ser activado pelo NF-kB em células de cancro oral [15]. Além disso, a inibição mediada por curcumina de Notch-1 activação também levou à regulação negativa dos seus genes-alvo, incluindo Bcl-2, ciclina D1, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e metaloproteinase de matriz -9 (MMP-9 e NF-kB ) em células de carcinoma epidermóide oral [4].
os microRNAs (miRNAs) são curtas RNAs não-codificantes que se ligam a região 3 ‘não traduzida (UTR) de RNAs mensageiros cognatos (mRNAs), através totalmente complementar ou imperfeita emparelhamento de bases reprimindo a tradução ou a diminuir a estabilidade dos mRNAs ligados [16]. Alguns miARNs são relatados como oncomirs que poderia funcionar tanto como oncogenes ou supressores de tumor [17]. Por exemplo, miR-21 diminui supressor de tumor expressão Pdcd4 e promove a invasão, intravasation e metástase no câncer colorretal [18]. A sobre-regulação de miR-21 está fortemente associado com ambos uma Ki-67 índice proliferativo elevado e à presença de metástases do fígado [19]. miR-21 também regulada via dependente de PTEN e crescimento celular afectada, migração e invasão do carcinoma hepatocelular [20]. Recentemente, demonstramos miRNAs como biomarcadores para a progressão esôfago de Barrett. miR-21 é regulada positivamente 12,57 vezes no cancro esofágico [21]. Outra miARN importante é o miR-34, que foi encontrada para participar na regulação de p53 e Notch vias consistentes com a actividade supressora de tumores [22]. Um estudo recente demonstrou que há uma conversa cruzada entre miARN e Notch vias de sinalização no desenvolvimento e progressão do tumor [23]. Além disso, a sinalização Notch e seus regulamentos são extremamente importantes ao nível da pós-transcricional e /ou regulação de translação de genes por miRNAs no glioblastoma [24]. Por outro lado, deixe-7a diminui a proliferação e migração celular de glioblastoma e reduz o tamanho do tumor no modelo de xenotransplante [25].
Neste artigo, nós determinamos o efeito de curcumina em células de câncer de esôfago e mecanismos mediados através da via de sinalização Notch.
Materiais e Métodos
células e Reagentes
TE-7, TE-10 são humanos e ESO-1 é de mouse células cancerosas adenocarcinoma de esôfago que eram gentilmente cedido pelo Dr. Richard J. Battafarano, Universidade de Maryland e cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e solução de antibiótico-anti-micótica 1% (Mediatech Inc., Manassas, VA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2. A curcumina foi adquirido a LKT Laboratories, St. Paul, MN. N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanil] -S-fenil-glicina t-butil éster (DAPT) foi adquirido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
e Proliferação ensaios de apoptose
para avaliar a proliferação, as células foram semeadas sobre a placas de 96 poços e crescem durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com doses crescentes de curcumina em FBS a 10% contendo meio RPMI 1640. Análise de proliferação celular foi realizada por ensaio enzimático como descrito [26]. Para a apoptose, 3/7 actividade de caspase foi medida usando o Apo-ona A caspase-3/7 kit de ensaio homogéneo (Promega, Madison, WI).
Colónia ensaio de formação de
Resumidamente, 6 bem pratos foram inoculadas com 500 células viáveis e deixou-se crescer durante 24 h. As células foram em seguida incubadas na presença ou ausência de curcumina 30 uM, durante 24 h. Curcumina contendo meio foi então removido, e as células foram lavadas em PBS e incubou-se durante um adicional de 10 d em meio completo. Cada tratamento foi realizado em triplicado. As colónias obtidas foram lavadas com PBS e fixadas em formalina a 10% durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas com PBS, seguido por coloração com violeta de cristal. As colónias foram contadas e comparadas com células não tratadas.
análises do ciclo celular
As células foram tratadas com 30? M de curcumina para 12 e 24 h, em seguida, as células foram tripsinizadas e suspensas em solução salina tamponada com fosfato ( PBS). Suspensões de uma única célula foram fixadas usando 70% de etanol durante 2 h, e posteriormente permeabilizadas com PBS contendo 1 mg /ml de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich), 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) e 2 de RNase ug DNase-livre (Sigma-Aldrich) à temperatura ambiente. A citometria de fluxo foi realizada com um analisador FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA), a captura de 10000 eventos para cada amostra. Os resultados foram analisados com o software ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME).
Tempo real transcrição reversa Análise Polymerase Chain Reaction
O RNA total isolado a partir de células TE-7 usando o reagente TRIZOL foi transcrito de modo reverso com transcriptase reversa Superscript II, na presença de iniciadores aleatórios hexanucleotide (todos da Invitrogen, Carlsbad, CA). Os ADN complementares foram, em seguida, utilizado para PCR em tempo real utilizando a polimerase JumpStart Taq ADN (Sigma-Aldrich) e mancha de ácido nucleico SYBR Green (Molecular Probes, Eugene, OR). Cruzando valores limites para genes individuais foram normalizados para p-actina. Alterações na expressão de ARNm foram expressos como alteração em relação ao controlo de dobragem. Os iniciadores utilizados neste estudo foram os seguintes: β-actina: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ‘e 5′-ATCATTCTCCTCCTCAGCG-3′; Ciclina D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ‘e 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3′; Notch-1: 5’-CACTGTGGGCGGGTCC-3 ‘e 5′-GTTGTATTGGTTCGGCACCAT-3′; HES-1 5’-AGGCGGACATTCTGGAAATG-3 ‘e 5′-CGGTACTTCCCCAGCACACTT-3’; A presenilina-1 5 ‘ATCATGCTCTTTGTCC-3′ e 5’-TCTTCTGTGAATGGG-3 ‘; Nicastrina 5’-CAGATTGGCTGCCAGT-3 ‘e 5′-CTCCAGCAGAACCAT-3’.
análise miRNA
Total de miRNA foi isolado utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion Inc, Grand Island, NY) . MiARN total isolado a partir de células TE-7 foram sujeitos a transcrição reversa com Superscript ™ II RNase H-Reverse Transcriptase e iniciadores aleatórios hexanucleotide (Invitrogen). O ADNc foi subsequentemente usado para realizar PCR em tempo real SYBR por química (SYBR® Green I; Molecular Probes) para pri-
let-7a
transcrição utilizando iniciadores específicos e polimerase JumpStart Taq ADN (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO). O valor limite cruzamento avaliada por PCR em tempo real foi anotado para
pri-deixá-7a
miRNA e normalizada com
U6
pri-miRNA. As alterações na pri-miARN foram expressos como alteração vezes relativamente ao controlo com valor médio ± SEM. Os iniciadores utilizados são os seguintes:
pri-U6
: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘e 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’,
pri-let-7a
: 5′-GAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAA-3 ‘, 5’-AAAGCTAGGAGGCTGTACA-3 ‘. Pri-miR-34-5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3 ‘e 5′-GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3′, pri-miR-21:. 5’-GCTTATCAGACTGATGTTGACTG-3 ‘e 5′-CAGCCCATCGACTGGTG-3’
Análise western Blot
Os lisados celulares foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida e transferidos para membranas Immobilon-P de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). Notch-1, caspase 3, Bcl2 anticorpos e Bax foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). A ciclina D1, Notch-1, Jagged-1, HES-1 e anticorpos de actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Presenilina 1, 2, anticorpos Nicastrina, APH1 e PEN2 de GenScript Inc (Piscataway, NJ) e proteínas específicas foram detectadas pelo sistema de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
ensaio Spheroid
Para a formação de esferóides, as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Mediatech) suplementado com 20 ng /ml de bFGF (Invitrogen) a 10 mL por 500 mL de 50X B27 suplemento (Invitrogen) EGF 20 ng /ml (Invitrogen) e antibiótico e antimicótico solução. As células foram semeadas a baixa densidade (5000 células /ml) em placas de 6 cavidades de baixa aderência. As células foram tratadas com concentrações crescentes de curcumina (0-50 uM). Após 7 dias, os esferóides foram fotografados.
Imunofluorescência coloração
As células foram cultivadas durante a noite em lamelas em placas de seis poços. Após o tratamento com 30 uM de curcumina por 24 h, as células foram então fixadas com paraformaldeído durante 15 min, lavadas com PBS, e incubadas com 2% de albumina de soro bovino em PBS durante 30 min. As células foram então incubadas durante a noite com anti-Notch-1, anti-Jagged-1, anti-HES-1, anti-A presenilina 1 e anticorpo anti-Nicastrina, respectivamente. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado-3-Cy durante 30 min e lavadas com PBS. imagens celulares foram observados sob um microscópio de fluorescência.
A análise estatística
Todos os valores são expressos como a média ± SEM. Os dados foram analisados utilizando um teste não emparelhado 2-tailed t.
valor P
inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
A curcumina inibe a célula de câncer de esôfago crescimento
Nós determinamos o efeito de curcumina em esôfago proliferação de células cancerosas numa variedade de linhas de células cultivadas (TE-7, TE-10 e ESO-1). A curcumina suprimiu significativamente a proliferação de linhas de células de câncer de esôfago TE-7, TE-10 e Eso-1 na dose eo modo dependente do tempo. Este efeito anti-proliferação de células tumorais foi visto dentro de um período de 24 h, a qual continuou a aumentar significativamente ao longo dos próximos 72 h (Figura 1A). Para determinar o efeito a longo prazo do tratamento curcumina, as células foram tratadas com 30? M curcumina durante 24 h, após o que as células foram deixadas a crescer em meio normal. tratamento curcumina suprimiu a formação de colónias em todas as linhas de células de câncer de esôfago (Figura 1B), sugerindo efeito desse curcumina nas células tumorais era irreversível. A ciclina D1 é uma proteína reguladora do ciclo celular, que regula a transição G1 para a fase S do ciclo celular e funciona como um cofactor para vários factores de transcrição em várias linhas celulares. Este ciclina forma um complexo com e funciona como subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6 cuja actividade é necessária para a transição G1 /S. A sobre-expressão de ciclina D1 foi ligado ao desenvolvimento e progressão do cancro [27]. D1 mRNA tratamento Curcumina inibiu a ciclina e a expressão da proteína, sugerindo que inibe a proliferação de células de cancro. Por outro lado, a expressão da proteína p21 foi aumentada (Figura 1C e D).
(A) curcumina inibe a proliferação de células de cancro esofágico. As células foram incubadas com doses crescentes de curcumina (0-50 uM) durante até 72 h, e analisadas para a proliferação celular. Curcumina tratamento resultou numa diminuição da dose e dependente do tempo significativo na proliferação de células em todas as três células, quando comparado com controlos não tratados. (B) A curcumina inibe a formação de colónia. células de câncer de esôfago foram incubadas com 30? M de curcumina por 24 h e permitiu a crescer em colônias por 10 dias. A incubação com a curcumina inibe a formação de colónia. Os resultados são representativos de três experiências independentes. (C) A ciclina D1 é uma proteína reguladora do ciclo celular e que está envolvida na paragem do ciclo celular. ARN de TE-7 incubadas com 30 uM curcumina foi submetido a PCR em Tempo Real para ciclina D1 mRNA expressão. Curcumina tratamento inibe significativamente a expressão de ARNm da ciclina D1 (* p 0,05). (D) Os lisados de TE-7 incubadas com 30 uM curcumina foram analisados por transferência de Western para os níveis de expressão da ciclina D1, utilizando anticorpo anti-ciclina D1 rato. tratamento curcumina inibe a expressão da proteína ciclina D1.
curcumina induz a morte celular por apoptose
Devido aos efeitos da curcumina na supressão da proliferação e formação de colónia, o próximo determinado se a curcumina afeta ciclo celular progressão. O tratamento com a curcumina induziu significativamente a morte celular de células TE-7 dentro de 12 h e continuamente aumentado até 24 h (Figura 2A). Tais aumentos semelhantes na morte celular foram observados em outros tipos de células [28]. A curcumina é conhecido por induzir a apoptose em diversas células cancerosas. As caspases são uma família de proteínas conhecidas para a execução da apoptose. A caspase-3 e caspase-7 são moléculas efectoras chave que se sabe induzirem apoptose em várias células de cancro, amplificando o sinal a partir de caspases iniciadoras, tais como a caspase-8 ou caspase-10. activação aumentada de efector da caspase-3 e caspase-7 foi observada dentro de 24 horas na linha de células TE-7 tratadas com a indução de apoptose sugerindo curcumina (Figura 2B). análises de Western blot de TE-7 lisados celulares demonstraram uma diminuição significativa na pro-caspase-3 em células tumorais curcumina tratados (Figura 2C). A confirmação adicional de que as células foram submetidos a apoptose foi obtido por análises de Western blot para anti-apoptótico Bcl-2 e Bax BclxL e proteínas pró-apoptóticas. tratamento curcumina inibiu a expressão de Bcl-2 e BclxL e aumentou os níveis de proteína Bax. Estes dados sugerem que a curcumina é um indutor potente da apoptose em células de cancro esofágico (Figura 2D). Análise
(A) ciclo celular das células tratadas curcumina. As células TE-7 foram tratadas com 30? M de curcumina por 12 e 24 h, examinadas por citometria de fluxo, após coloração de iodeto de propidio para teor de ADN. tratamento curcumina leva a um aumento do número de células mortas. Os gráficos são representativos dos dados recolhidos a partir de três experimentos. (B) A curcumina induz a caspase-3, um mediador de apoptose. TE-7 células incubadas com 30 uM de curcumina foram analisadas quanto apoptose por caspase-3 e-7 a activação. Curcumina tratamento aumentou o número de células que sofrem apoptose em comparação com controlos não tratados (* p 0,05). (C) Os lisados de células TE-7 incubadas com 30 uM de curcumina foram analisados por transferência de Western para a caspase-3 níveis de proteína, utilizando anticorpo de coelho anti-caspase-3. Curcumina tratamento resultou numa diminuição da pro-caspase-3. (D) Os lisados de células TE-7 incubadas com 30 uM de curcumina foram analisadas por western blotting de proteínas Bcl-2, BclxL, e Bax. A curcumina reduz a expressão das proteínas anti-apoptóticas e Bcl2 BclxL, enquanto que o aumento da expressão de proteínas pró-apoptóticas em células tratadas quando comparadas com as células não tratadas.
A curcumina inibe a formação esophagosphere
Dado que curcumina inibe a formação colonosphere em células de câncer de cólon e que afetam proteínas via de sinalização Notch. A seguir, determinou os efeitos da curcumina sobre a formação de esferóides de células de câncer de esôfago. Curcumina tratamento inibiu significativamente esophagosphere formação de uma forma dependente da dose em ambas as células TE-7 e TE-10 (Figura 3A). O tamanho esferóides, números foram contadas. Curcumina tratamento reduziu tanto a formação de esferóides primária e secundária (Figura 3B e C).
células TE-7 e TE (A) foram cultivadas em placas aderentes de baixa e tratado com concentrações crescentes de curcumina (0-50 uM) e realizado para o ensaio esferóide. Após uma semana, os esferóides foram fotografadas. (B) Spheroid foi contada e realizada diagrama de barras. Curcumina tratamento inibiu significativamente esofágicas células cancerosas esferóides (* P 0,05). (C) Os esferóides primários foram recolhidos e separados em células individuais e novamente plaqueadas. tratamento de curcumina inibiu significativamente a células de câncer de esôfago esferóides secundárias (* p 0,05).
A curcumina inibe a ativação Notch por downregulating o complexo γ-secretase
Notch-1 é uma membrana celular associada proteína. acoplamento de ligando faz com que o domínio intracelular do receptor de Notch transmembranar (NiCd) a ser clivada a partir da membrana através da acção do complexo γ-secretase. NICD transloca para o núcleo, onde se associa com uma família de proteínas de ligação de ADN para activar a transcrição de genes alvo, tais como Notch cabeludo e intensificador-de-split 1 (
HES1
) [29]. Determinou-se o efeito da curcumina na Notch-1, o seu ligando Jagged-1 e HES-1 em células TE-7. Curcumina tratamento regulada negativamente de forma significativa os níveis de proteína (Figura 4A e B) Notch-1 e o seu ligando alvo proteínas Jagged-1 e a jusante tanto HES-1 mRNA e. Os níveis de proteína foram confirmadas por coloração imuno-fluorescência, onde foram observados níveis significativamente mais baixos de Notch-1 nuclear e citoplasmática Jagged-1 nas células tratadas com curcumina (Figura 4C).
(A) em tempo real transcrição reversa análise-PCR de ARN total a partir de células TE-7 seguinte 30 uM de tratamento curcumina durante 24 h mostrou redução na expressão de Notch-1, o seu ligando Jagged-1 e seus HES-1 gene-alvo de ARNm (* P 0,05). (B) Os lisados de tratamento curcumina causou uma redução significativa na expressão de Notch-1 clivada, o seu ligando Jagged-1 e seus HES-1 gene alvo níveis de proteína em células TE-7. (C) TE-7 células tratadas com 30 pM de curcumina por 24 h foram submetidos a coloração imuno-fluorescente, utilizando anti-Jagged-1 e anti-HES-1 de anticorpos anti-Notch-1. tratamento curcumina resultou em níveis mais baixos de Notch-1 proteína no núcleo e reduziu Jagged-1 expressão e Hes-1 em células TE-7.
A seguir, determinou o mecanismo pelo qual a curcumina afeta Notch- 1 activação. γ-secretase é um complexo multi-proteico contendo uma protease de clivagem intra-membrana. O complexo tem uma lista crescente de proteínas substratos, incluindo os receptores Notch. Os quatro componentes do complexo γ-secretase, presenilina 1, Nicastrina, Pen2, Aph1 e são tidos como essenciais para a actividade [13] [30] [31]. O domínio catalítico reside dentro de presenilina, enquanto Nicastrina tem sido sugerido para ser crítico para o reconhecimento de substrato [32]. tratamento curcumina resultou em infra-regulação da expressão de proteínas complexas y-secretase, presenilina 1 e 2, Nicastrina, APH1 e PEN2 (Figura 5A, B e C). Estes dados sugerem que a curcumina mediada por sub-regulação da via de sinalização de Notch ocorre, em parte, através da inibição do complexo γ-secretase.
(A), em tempo real A análise de transcrição reversa-PCR de ARN total de TE- 7 células seguintes 30 uM de tratamento curcumina durante 24 h mostrou redução na expressão de ARNm a presenilina 1 e Nicastrina (* p 0,05). (B) Os lisados de tratamento curcumina causou uma redução significativa na expressão de proteínas do complexo y-secretase da presenilina 1 e 2, Nicastrina, APH1 e os níveis de proteína PEN2 em células TE-7. (C) TE-7 células tratadas com 30 pM de curcumina por 24 h foram submetidos a coloração imuno-fluorescente utilizando anticorpos anti-A presenilina 1 e anticorpos anti-Nicastrina. tratamento curcumina resultou em níveis mais baixos de presenilina 1 e expressão Nicastrina em Te-7cells.
A combinação de curcumina e um DAPT inibidor complexo γ-secretase ainda afeta o crescimento do câncer de esôfago
O tratamento com combinação de curcumina e um inibidor complexo (GSI) DAPT γ-secretase proteínas Notch-1-alvo mais inibe HES-1 e expressão de ciclina D1 (Figura 6A). Foi realizada combinação de curcumina com um complexo inibidor de DAPT γ-secretase na proliferação e apoptose. Combinação de curcumina e tratamento DAPT ainda inibe a proliferação e induz a apoptose em células TE-7 (Figura 6B e C). Resultados semelhantes foram observados em células TE-10 (dados não mostrados).
células TE (A) tratadas com DAPT (50 uM) e curcumina (30? M) isoladamente e em combinação, durante 24 h. Os lisados foram analisados por transferência de Western. proteínas HES-1 e Ciclina D1 foram ainda mais reduzida com a combinação dos dois compostos. (B) As células tratadas com TE DAPT (50 uM) e curcumina (30? M) isoladamente e em combinação, durante 48 h. A proliferação celular foi inibida significativamente a seguir ao tratamento com a combinação de DAPT e curcumina, quando comparado com cada curcumina isoladamente utilizando o ensaio enzima hexosaminidase (*
P
0,05). (C) A apoptose foi induzida significativamente a seguir ao tratamento com a combinação de DAPT e curcumina, quando comparado com cada curcumina isoladamente usando um Apo-caspase-3/7 kit de Ensaio Homog�eo (*
P
0,05).
a curcumina inibe oncomir miRNA e aumenta supressor de tumor miRNA em células de câncer de esôfago
a curcumina altera a expressão microRNA no cólon [33] pâncreas [34], de mama [35], bexiga [36] e pulmonar [37] células cancerosas. Recentemente, demonstramos que miRNAs como biomarcadores para a progressão esôfago de Barrett e miR-21 é regulada 12,57 vezes em câncer de esôfago [21]. A seguir, determinou os efeitos da curcumina sobre oncomir células cancerosas do esôfago miRNA e supressor de tumor de miRNA. Curcumina tratamento significativamente regulada negativamente a expressão de miR-21 e miR-34a enquanto upregulating let-7a miARN expressão (Figura 7A e B).
(A), em tempo real A análise de transcrição reversa-PCR a partir de um total de miARN TE- 7 células seguintes 30 uM de tratamento curcumina durante 24 h. Curcumina tratamento inibir significativamente a expressão de miARN oncomiR em células TE-7 (*
P
0,05). (B) tratamento curcumina significativamente up-regulada supressor de tumor let-7-A expressão miRNA em células TE-7.
Discussão
O câncer de esôfago é um dos sexta principais causas de Câncer mortes relacionadas no mundo ocidental. incidência global da doença é maior em homens com mais de 50 anos de idade [2]. O câncer de esôfago é geralmente diagnosticado numa fase tardia e tem um mau prognóstico, com uma sobrevida de menos de 10% em 5 anos. A morbidade significativa, toxicidade e as taxas de resposta pobres de regimes de quimioterapia atuais levaram a pesquisas para terapias alternativas menos tóxicas. Nós e outros autores mostraram que a curcumina suprime a proliferação e induz a apoptose numa variedade de células tumorais, incluindo pâncreas, mama, cólon, oral, pulmonar, melanoma, mieloma, leucemia, e carcinoma da próstata. Estudos anteriores demonstraram que a curcumina suprime a proliferação e aumenta a apoptose em células de cancro esofágico [5] [6] [38] [39].
Os dados apresentados neste artigo mostram que a curcumina inibe selectivamente a proliferação de esofágica células cancerosas, suprime a formação de colónias de células de cancro esofágico, promove a paragem do ciclo celular e apoptose, inibe a formação de esophagosphere, regula para baixo sinalização notch e suas proteínas complexas y-secretase, e também inibe a expressão de miARN oncomir e induz a expressão de miARN supressor de tumor. Estes resultados são ainda apresentados no diagrama esquemático na Figura 8. Os nossos resultados mostram que a curcumina pode suprimir eficazmente a proliferação celular em 24 h. Além disso, os efeitos inibidores sobre células tumorais parecem ser sustentado e irreversível depois de 24 h de tratamento. Os nossos dados com ciclina D1 é intrigante na medida em que houve uma redução da sua expressão às 24 h. Isto poderia ter resultado em células que sofrem de prisão G0-G1, uma vez que a proteína é responsável pela progressão através da transição de fase G0-G1 /S [40]. Semelhante induzida por curcumina prisão G0 /G1, também foi demonstrado que ocorrem em outros tipos de células, incluindo cancro do cólon e cancros gástricos, e no linfoma de culas do manto [28] [41]. Com efeito, observou-se um aumento significativo nas células mortas nas células cancerosas esofágicas até às 12 h após a incubação com a curcumina, que conduziu subsequentemente à morte celular.
Os nossos estudos demonstram que a curcumina inibe a expressão de Jagged-1 e o receptor de Notch-1. A curcumina também inibe a proteínas do complexo y-secretase, inibindo assim a clivagem do receptor Notch. Como resultado, o domínio intracelular de Notch (NiCd) não é libertado e, por conseguinte, não se translocar para o núcleo para activar a jusante genes alvo c-myc e ciclina D1. Isto resulta na inibição da proliferação de células e a regeneração de células estaminais, enquanto ao mesmo tempo a indução de apoptose.
No presente estudo, nós também descobrimos que a curcumina para baixo regula a sinalização Notch através da inibição de o complexo γ-secretase. A curcumina inibe Notch-1 e o seu ligando Jagged-1 em células de cancro esofágico. Nós também descobrimos que a curcumina inibiu a expressão do Notch-1 alvo a jusante
HES-1