Abstract

análise funcional orientada para a doença de fatores epigenéticos e seus mecanismos de regulação em silenciamento aberrante é um pré-requisito para um melhor diagnóstico e terapia. No entanto, os mecanismos precisos são ainda obscuro e complexo, envolvendo a interação de diversos efetores, incluindo posicionamento nucleosome, a metilação do DNA, as variantes de histonas e modificações de histonas. Foi investigada a complexidade silenciamento epigenética no gene supressor de tumores

Cadm1

em linhas celulares de cancro do pulmão de células progenitoras de ratinho, apresentando a hipermetilação do promotor associado a repressão da transcrição, mas na maior parte não responde a tratamentos de desmetilação de drogas. Depois de prever posições nucleossomos e sítios de ligação de factor de transcrição ao longo do

Cadm1

promotor, foi realizado mapeamento única molécula com DNA metiltransferase

M.Sss

I, que revelou em promotores silenciosas alta ocupação nucleossomo e oclusão de locais de ligação do factor de transcrição. Além disso,

M.Sss

mapas I de promotores variou dentro e entre as diferentes linhas de células de câncer de pulmão. análise da cromatina com nuclease Micrococo também indicou variações de posicionamento nucleosome ter implicações na ligação de fatores de transcrição perto das fronteiras nucleossomos. Cromatina imunoprecipitação mostraram que variantes histonas (H2A.Z e H3.3) e opostas marcas de modificação das histonas (H3K4me3 e H3K27me3) todos colocalized nas mesmas posições nucleossomos, que é uma reminiscência de plasticidade epigenética em células-tronco embrionárias. Ao todo, epigenética complexidade silenciamento na região promotora de

Cadm1

é definido não só por hipermetilação do DNA, mas alta ocupação nucleossomo, posicionamento nucleosome alteradas, e as modificações das histonas “bivalentes”, também provavelmente contribuiu na repressão da transcrição desta gene nas células de câncer de pulmão. Nossos resultados vão ajudar a definir estratégias de intervenção terapêutica usando drogas epigenéticas no cancro do pulmão

Citation:. Reamon-Buettner SM, Borlak J (2012) Dissecando epigenética silenciamento Complexidade no supressor de cancro do mouse Lung Gene

Cadm1

. PLoS ONE 7 (6): e38531. doi: 10.1371 /journal.pone.0038531

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 22 de setembro de 2011; Aceito: 07 de maio de 2012; Publicação: 06 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Reamon-Buettner, Borlak. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e da Cultura, Lower Saxony, Alemanha 25A 5-7251-99 /00. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte, mas os mecanismos moleculares da doença são pouco conhecidos. Muitos estudos mostram agora que as alterações genéticas e epigenéticas, como culpados [1]. eventos epigenéticos são alterações hereditárias na expressão gênica sem alterações na sequência de ADN primário. Eles são importantes para o desenvolvimento normal e diferenciação, mas a vantagem quando mal direcionada às doenças, especialmente câncer [2]. No entanto, muitos dos processos que resultam em silenciamento de gene pode ser invertido com drogas epigenética, oferecendo uma esperança para o tratamento e terapia de [3]. A paisagem epigenética de silenciamento é, no entanto, complexa, que envolve a interacção de efectores principais incluindo o posicionamento dos nucleossomas, a metilação do DNA, histonas variantes, modificações de histonas e RNAs não-codificantes [4]. Como estes efectores interagir entre si para afectar a expressão do gene e causar doença permanece obscura.

O ADN é empacotado numa estrutura de nucleoproteína do complexo no núcleo de uma célula, a cromatina, e a unidade de repetição básica da cromatina é conhecida como nucleossoma, a estrutura e função dos quais estão ainda a ser elucidados [5]. Cada nucleossomo consiste em um grupo de histonas octam�ica (duas cópias de cada um dos H2A, H2B, H3, e H4), em torno do qual aproximadamente 147 bp de DNA são embrulhados em 1,65 voltas superhelical. posicionamento Nucleosome desempenha um papel crucial na cromatina maior dobrar ordem e na regulação dos genes [6] – [8]. Nucleossomos podem afectar a transcrição por modulação da acessibilidade de DNA para as proteínas reguladoras da transcrição e maquinaria, que conduz à activação de genes ou de repressão. Nucleosome posicionamento pode, por sua vez, ser afectada por vários factores, incluindo as preferências de sequências de ADN, a metilação do DNA, histonas, variantes e modificações pós-tradução das histonas [6]. Além disso, o posicionamento dos nucleossomas difere da ocupação do nucleossoma, que não leva em conta nucleossoma começa a condição de que um determinado par de bases está dentro de um nucleossoma [7].

Modificação por metilação do DNA ocorre pela adição covalente de um grupo metilo na posição 5 do anel citosina, 5-metilcitosina criação. metilação de ADN é um mecanismo de silenciamento epigenético bem conhecida e está associado, em vários processos biológicos e doenças (avaliações, [4], [9]). Tet (1011 translocação) proteínas pode converter 5-metilcitosina (5mC) em 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) [10], [11] e, recentemente, também em 5-formylcytosine (5FC) e 5-carboxylcytosine (5caC) [12] . metilação de ADN podem inibir a expressão genética através da prevenção activadores de transcrição de ligação a ADN alvo ou por recrutamento de metil-CpG de ligação a proteínas de domínio (MBD), que por sua vez recrutam histona-modificadora e complexos de remodelação da cromatina para locais metilados [4]. CpG metilação também podem contribuir para a repressão do gene através da indução de uma conformação nucleossomo mais compacta e rígida [13].

A maquinaria de metilação do DNA de mamíferos é mediado pelos metiltransferases de DNA (DNMTs), que estabelecer e manter a metilação do DNA padrões. DNMT1 é necessária na manutenção padrões de metilação de DNA, enquanto que

de novo

Metiltransferases DNMT3A e DNMT3B alvo novos sites de DNA metiladas (para revisão, [14]). Nucleossomos podem influenciar a metilação do DNA, mas os estudos até agora mostram resultados contrastantes. Ou metiltransferases DNA alvo preferencialmente DNA-bound nucleossomo [15], ou nucleossomos tornar a protecção contra a metilação [16]. Além disso, nucleossomas contendo ADN metilado estabilizar de novo ADN metiltransferases 3A /3B (DNMT3A /3B) permitindo pouco DNMT3A livre /3B de existir no núcleo [17]. Estabilização da DNMT3A /3B em nucleossomos nas regiões metiladas promove ainda mais a propagação de metilação do DNA e, assim, garante a herança epigenética fiéis. CpG metilação também podem ter uma influência distinta sobre a ligação às proteínas quando ela está presente dentro de um fundo nucleosomal [18].

histonas nucleosomal podem ser trocados com variantes de histonas, e sua incorporação pode influenciar o posicionamento nucleosome, e, portanto, a atividade do gene (revisto em [19]). A síntese de histonas canónicos é acoplado a replicação do ADN em fase S, enquanto que as variantes das histonas são sintetizadas durante todo o ciclo celular. Além disso, em contraste com histonas canónicos, cuja função é essencialmente no empacotamento do genoma e regulação de genes, histonas não canónicas têm papéis cruciais em uma variedade de processos, incluindo a segregação cromossoma, regulação da transcrição e a reparação do ADN. Entre estas variantes de histona H2A H2A.Z é a variante, a qual é altamente conservada ao longo da evolução eucariótica [20], [21]. Histona H2A.Z variante difere significativamente da H2A por vários aminoácidos e preferencialmente localizando a promotores de genes em células de mamíferos, em que ele é espalhado ao longo de vários nucleossomas a montante e a jusante do local de início da transcrição [22]. Uma outra variante da histona bem conservada é H3.3, uma variante que difere do H3 canónica por algumas substituições de aminoácidos, e verificou-se ser enriquecido ao longo do corpo de gene de genes transcritos, regiões promotoras de genes activos e inactivos, e em elementos reguladores. Esta variante também se acumula em loci silenciosa na cromatina e telómeros pericêntrica [23].

Para além de variantes de substituição de histona, os resíduos de aminoácidos nas caudas N-terminais das histonas (canónica, bem como variantes), pode ser modificado por várias modificações pós-traducionais covalentes (PTMs) e formar a base para a regulação epigenética da estrutura da cromatina e a função do gene [24]. Mais importante ainda, não há interferência entre as modificações das histonas com outros reguladores epigenéticos sentido de reforçar ou funções de modificações reverter. Tais PTMs, que incluem, entre outros acetilação, metilação e fosforilação, desempenhar um papel direto para afectar a estrutura da cromatina, ou eles podem representar marcas ou sinais que devem ser reconhecidos pelos leitores de modificações de histonas, para especificar uma cromatina solto ou compacto [25]. Interrupções de histonas modificações nos processos regulatórios normais foram encontrados em doenças, incluindo o desenvolvimento e progressão [26] câncer.

CADM1

(molécula de adesão celular 1) é um gene supressor de tumor identificado em não cancro -pequena do pulmão (NSCLC), mas também implicados em outras doenças de cancro humano [27], [28]. Nós mostramos anteriormente que

Cadm1

foi reprimido em linhas de células progenitoras câncer de pulmão do rato, e a expressão do gene altamente correlacionada com a hipermetilação do promotor [29]. Mas após o tratamento com o agente de desmetilação 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza-dC), a maioria das linhas celulares não foram considerados respondedores sugerindo a participação de eventos adicionais de silenciamento epigenética. O presente estudo teve como objetivo compreender paisagens epigenéticos que levam a transcrição repressão da

Cadm1

nas mesmas células progenitoras de cancro do pulmão do rato, e, eventualmente, para obter insights mecanicistas para o silenciamento epigenético de genes supressores de tumor, em geral, e resposta a drogas epigenéticas. Usando ferramentas de bioinformática, previmos posições nucleossomos e fator de transcrição locais ao longo do

Cadm1

promotor de ligação. Foi realizado um mapeamento única molécula rigorosa da cromatina com o DNA metiltransferase,

M.Sss

I para determinar a ocupação nucleossomo e oclusão de locais de ligação do factor de transcrição. Com um painel de iniciadores para interrogar o meio, bem como as fronteiras esquerda e direita de nucleossomas preditos, analisou-se para o posicionamento dos nucleossomas diferencial na cromatina de MNase e o ADN digerido com chiped histona H2A canónica, histona H3.3 e variantes H2A.Z, , bem como para modificação das histonas, H3K4me3 e H3K27me3. Ao todo, as células de câncer de pulmão exibidos vários eventos silenciamento epigenéticas que irão ajudar a definir estratégias de intervenção terapêutica.

Resultados

Cadm1

hipermetilação do promotor se correlaciona com a repressão da transcrição

Este e estudo anterior [29], descobriu que

Cadm1

promotor CpG hipermetilação correlacionada com a repressão da transcrição em linhagens de células de câncer de pulmão estabelecida a partir de células tumorais individuais, espontaneamente transformadas pulmonares de

c-Myc

e

c-Raf

ratos double-transgênicos. CpG metilação em clones individuais foi heterogêneo dentro e entre as 10 linhas celulares de cancro de pulmão diferentes. Esse estudo anterior também demonstrou que a metilação de CpG na locais de fatores de transcrição Sp1, SP3 e ZF5 revogados DNA-proteína de ligação de ligação do núcleo. Além disso, o tratamento com o agente de desmetilação, 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza-dC) restaurado

Cadm1

expressão do gene, mas até agora só em duas linhas celulares, sugerindo que eventos de silenciamento epigenética adicionais. Com efeito, comparando a metilação do DNA em não tratada e em linha celular de cancro do pulmão tratadas com A2C12-aza correspondente re-expressão de

Cadm1

mostraram que a maioria dos 69 CpG analisadas na região do promotor foram ainda metilado na aza-tratada A2C12. Assim, o tratamento com 5-aza-dC por si só não foi capaz de restabelecer a expressão do gene em todas as linhas celulares de cancro do pulmão ou desmetilar região promotora do

Cadm1

e estas observações nos levou a suspeitar de camadas adicionais de silenciamento epigenético no lugar. Nós investigamos ainda mais o

Cadm1

promotor e, assim, para obter insights sobre a extensão da complexidade silenciamento epigenético nas diferentes linhas celulares de cancro do pulmão.

Previsões de posicionamento nucleosome e anotações ao longo do

Cadm1

Promotor Região de

para determinar se CpG metilação poderia influenciar ocupação nucleossomo levando ao silenciamento epigenético, conforme demonstrado anteriormente [30], usamos ferramentas de bioinformática para prever posições nucleossomos, e para anotar o

Cadm1

região promotora. Usando uma previsão posicionamento nucleossoma com base na sequência de ADN genómico (Segal, ver Materiais e Métodos), que localizado, pelo menos, cinco posições possíveis de nucleossomas, aproximadamente, 1000 pb em direcção ao local de início da transcrição (TSS) e o sítio de iniciação da tradução (ATG). O RefSeq TSS (NM_001025600.1) está localizado na -21 de ATG. Os nucleossomas preditos são designados arbitrariamente em relação ao ATG, como nuc 1 (-1011 a -865), Nuc 2 (-697 a -551), Nuc 3 (-417 a -271), Nuc 4 (-230 a -84 ) e Nuc 5 (-41 a +106). Os sítios de ligação de factores de transcrição específicos de sequência prevista se encontram nas fronteiras ou dentro destes nucleossomas, e altamente concentrada nos nucleossomas adjacentes mais no TSS (Figura 1A). Muitos CpG são encontrados dentro de nucleossomas, especialmente aqueles dentro da ilha de CpG da região promotora de

Cadm1

(Figura 1B). A região de 1000 pb é coberto por cinco fragmentos de tamanhos 124-349 pb foi utilizado para analisar a metilação de CpG em ADN genómico tratado com bissulfito, particularmente em conjunção com ADN-metiltransferase base única molécula de cromatina (MAP-TI) ensaio (Figura 1C , Tabela S1). Durante o estudo, outros algoritmos de posicionamento nucleossomos tornou-se disponível (por exemplo NuPOP, ICM, ver Materiais e Métodos) e comparação mostrou sobreposição de previsões entre os três métodos utilizados (Figura 1D). No entanto, a posição dos três nucleossomas (nuc designado 1, 3, 4) pareceu ser mais ou menos consistentes.

(A) na posição de cinco analisados ​​nucleossomas (rectângulos azul) e os sítios de ligação de factores de transcrição. Nucleossomas são numerados arbitrariamente a partir da mais distante (por exemplo, Nuc 1) para o local de início da transcrição RefSeq (TSS) e o local de início da tradução ATG, que estão ambos localizados no nucleossoma 5 (Nuc 5). numeração de nucleótidos com um corresponde a um do ATG. (B) Previsto nucleossomos e localização de CpGs (listras verticais) ea ilha CpG ao longo do

Cadm1

promotor. (C) cinco fragmentos cobrindo CpG analisadas no ADN genómico tratado com bissulfito e previu nucleossomas. (D) posições nucleossomos possíveis de três algoritmos diferentes.

única molécula Cromatina Mapeamento de

Cadm1

Promotor Região com

M.SssI

revela alta Nucleosome Ocupação na as células do cancro do pulmão

Nós próxima realizados um mapeamento cromatina única molécula da região promotora

Cadm1

. Utilizamos uma estratégia footprinting que permite o mapeamento estrutura da cromatina em ilhas de CpG não metiladas por tratamento de núcleos isolados com ADN metiltransferases, nomeadamente a metiltransferase de ADN específico do CpG (

M.Sss

I), seguido de sequenciação genómica bissulfito de progenitura indivíduo moléculas de ADN [31], [32]. Este procedimento denominado como única análise promotor à base de metilação (M-SPA), também é descrito como protocolo de acessibilidade metiltransferase para modelos individuais (MAP-IT) [33]. Essencialmente, CpGs será metilado pela

M.Sss

I, a bacteriana metiltransferase citosina C5, a menos que os CpGs são bloqueados por nucleossomos ou proteínas de ligação de ADN. Para este efeito, a localização nucleossomo é definido como uma região de cerca de 147 pb que é inacessível para

M.Sss

I.

Os CpGs dentro da região promotora

Cadm1

em pulmão normal são essencialmente não metilado e o gene é expresso. Nós tratada a cromatina de pulmão normal com

M.Sss

I e analisados ​​CpGs protegidas (não metiladas) ao longo da região do promotor de

Cadm1

, especialmente aqueles dentro nucleossomos previsto ou sítios de ligação de factor de transcrição. Foram utilizados os primers que amplificam bissulfito cinco fragmentos, três dos quais se sobrepõem, e cobrem 69 CpGs de -944 a +41, em relação ao local de início da tradução, ATG (veja a Figura 1C, Tabela S1).

M.Sss

I tratamento de DNA genômico “nu” serviu como controle. Usando o padrão de metilação do ADN no ADN genómico “nus” e pulmão normal como referência, analisou-se a partir de cromatina de tumor do pulmão, linhas de células de cancro de pulmão, e uma linha celular de cancro do pulmão tratadas com 5-aza-dC com ligeira gene re-expressão. Para obter insights de diferentes instantâneos da

Cadm1

promotor, comparamos padrões de metilação de DNA de

M.Sss

Eu tratamentos de linhas celulares mesmos.

eficiência metilação independente da M .SssI ao longo da região promotora do Cadm1 nos controles de DNA “nu” genômicos.

eficiência de metilação do

M.Sss

I foi determinada pela primeira vez em DNA genômico “nu” mouse. A eficiência de metilação em média 21 clones para cada fragmento variou 51-91% (Figura S1). A maior eficiência foi obtido em dois fragmentos mais próximos ao redor do TSS, e isto é MFRA TSFR1 em 91%. CpG não metilados nestes fragmentos foram mais ou menos aleatórios. Esta eficiência metilação diferencial pode ser uma indicação de que a região promotora na vizinhança de SST foi mais sensível à metilação de DNA. Em nossa análise anterior, o índice de metilação no fragmento TSFR1 que inclui o TSS deu a correlação mais clara à repressão da transcrição. metilação global em cinco fragmentos, 106 clones e 1.478 CpGs foi de 76%. Usando o mesmo protocolo, que também determinada a eficiência de metilação de ADN genómico “nu” isolado a partir de uma linha celular de cancro de pulmão (A2Cl2) que continha já antes de metilação de CpG. metilação global em cinco fragmentos, 31 clones e 416 CpGs foi de 98%, indicando a robustez do ensaio.

M.SssI mapa cromatina de pulmão normal.

Foram analisados ​​o mapa M.SssI em cromatina isolada a partir de nove pulmões normal reunido. Para BFR fragmento (255 pb, 6 CpGs -944 a -837), a maioria dos clones mostrou um trecho de CpG não metilados (figura S1), especialmente aqueles que estão localizados dentro de um nucleossomo previsto (nuc 1) (Figura S2). Para fragmento 1FR (279 pb, 10 CpGs, -682 a -531), vários clones também mostrou um trecho de CpG não metiladas, muitos caem dentro de um nucleossomo previsto (nuc 2) (Figura S3). Estes resultados são sugestivos de ocupação nucleossomo.

Para os próximos três fragmentos sobrepostos ao redor do TSS (MFR1, MFRA, TSFR1) e na região onde o fator de transcrição vários sítios de ligação Pode ser encontrado (ver Figura 1A), o padrões na maioria dos clones indicou ausência de ocupação nucleossoma, mas sim sugestivo de ligação de factores de transcrição ou outras proteínas necessárias para a regulação. Fragmento MFR1 (124 pb, 14 CpGs, -456 a -341), é amplificado por iniciadores específicos de metilação (com três CpG em ambos os iniciadores directo e inverso). Este fragmento contém previu sítios de ligação para fatores de transcrição, por exemplo PPARg, ER, ETF, em que os CpGs dentro destes sítios de ligação eram em sua maioria não metilado em vários clones, para sugerir a sua ligação e um possível papel na regulação transcricional de

Cadm1

. O sítio ETF previsto tem dentro de um nucleossoma (Nuc 3), enquanto o PPARg é na fronteira de nucA 3, e pode ser facilmente influenciados por alterações relativas à ocupação dos nucleossomas e deslizantes (Figura S4).

Fragmento MFRA (222 pb, 27 CpGs, -396 a -180) também é amplificado por iniciadores específicos de metilação (com 5 CpGs em iniciador directo, 6 CPGs em primer reverso). Este fragmento abrange um nucleossoma previsto (Nuc 3), e, em parte, que de outro (Nuc 4) (Figura S5). Ele contém dois sítios de ligação para o SP1, que estão localizados dentro ou na fronteira esquerda do nuc 4. Os CpGs nos sítios de ligação o SP1 a -224 e -211 foram ocupadas em muitos clones com padrão livre-nucleossomo. Este resultado suporta ainda que o SP1 pode de fato desempenhar um papel na regulação da

Cadm1

. Havia 2 de 15 clones, no entanto, que mostrou um longo trecho de protecção CpG dentro de uma nucleossomo previsto (nuc 3), indicando a formação de nucleossomo nesta parte do promotor de

Cadm1

.

fragmento TSFR1 (345 pb, 37, -302 CpGs 41) é amplificado por iniciadores que contêm três CpG no iniciador para a frente, e duas CpG no iniciador inverso (Figura 2). Os resultados anteriores mostraram que o índice de metilação obtido a partir deste fragmento altamente correlacionada com a repressão da transcrição em comparação com os outros fragmentos analisadas na região do promotor

Cadm1

. Ele contém sítios de ligação para o SP1, ZF5, e outros factores de transcrição preditos. Incluídas também estão no sítio de iniciação da transcrição RefSeq (TSS), o local de início da tradução, ATG, bem como, pelo menos, dois previu nucleossomas (nuc 4 e 5 nucA). Não houve longa extensão de CpG não metilados, excepto para 3 de 15 clones em que a maioria dos CpGs protegidas caem dentro de um nucleossoma previsto (nuc 4). Nestas clones sem aparente ocupação de nucA 4, previu um nucleossoma (Nuc 5) onde o TSS RefSeq, bem como os locais de ATG está localizado, pareceu não estar presente, bem como, de uma consistente cromatina aberta que está associada com a transcrição. Além disso, a -224 CpG no sítio de ligação do SP1 eo -192 CpG em ZF5, eram frequentemente não metilado, para apoiar a sua ligação na região promotora de

Cadm1.

(A) padrões de metilação em clones após o tratamento com DNA metiltransferase específica do CpG (

M.Sss

I) e pontuação de 32 CpGs (-271 a +24 CpGs, fragmento TSFR1) no DNA do rato-cauda “nu” genômica, e cromatina de nove pulmões normal reunido, três reunidas tumores pulmonares sólidos, e sete linhas celulares de cancro de pulmão diferentes, com pouco ou nenhum

Cadm1

a expressão do gene. Os padrões foram obtidos com Bisma, onde caixas azuis representam CpGs não metilados (= protegida), enquanto as caixas vermelhas, CpGs metilados. Em tumores de pulmão e linhas celulares de cancro do pulmão, CpG metilação pode ser endógena e /ou a partir da

M.Sss

I tratamento. (B) Anotação das analisados ​​

Cadm1 e região promotora (CpGs, sítios de ligação putativos de factores de transcrição específicos do pulmão, previu nucleossomos), e a sequência de contexto padrões de metilação do DNA correspondentes mostrado em (A). Um trecho de CpGs protegidas especialmente dentro do nucleosome previu 4 foi frequente em muitos dos 84 clones obtidos em linhas celulares de cancro do pulmão.

Para resumir, o

M.Sss

Eu metilação mapa observadas em clones de pulmão normal sugeriu a formação dos previstos cinco nucleossomos ao longo região promotora do

Cadm1

. Os padrões encontrados nos três fragmentos (MFR1, MFRA e TSFR1) em torno do TSS, em que três nucleossomos (nuc 3, nuc 4 e nuc 5) estão localizados, mostrou a ausência de ocupação nucleossomo em muitos clones. No entanto, os sítios de ligação de fatores de transcrição, como SP1 e ZF5 mostrou proteção, sugerindo seu papel na regulação da transcrição da

Cadm1

. Em contraste, para os dois nucleossomos mais distantes do TSS (NUC1 e nuc 2), nenhuma remodelação nucleossomo aparente apareceu a ter lugar como a maioria dos clones única exibiu longos trechos de CpG não metiladas.

mapa M.SssI cromatina de pulmão tumor.

Foi analisada a

M.Sss

I Roteiro da cromatina isolada de três reunidos tumores pulmonares sólidas de c

-Raf

camundongos transgênicos.

Cadm1

ainda estava expressa nestas tumores (não mostrado). Devido à endógena metilação CpG nos tumores de pulmão, somente os resultados das CpGs não metilados (ou seja, protegidas) após

M.Sss

tratamento que foram interpretados. No entanto, os padrões em clones sugeriu a formação de, pelo menos, três nucleossomas (NUC1, Nuc 2, Nuc 3) (Figuras S1, S2, S3, S5). No fragmento TSFR1, onde nuc 4 e 5 nuc reside, não havia longo trecho de CpG não metiladas ao longo do fragmento para indicar ocupação nucleossomo, mas 18 sites individuais CpG mostrou protecção (Figura 2). De facto, 13 dos 19 clones exibiram o mesmo padrão. Entre as características do padrão comum estes incluem quase nenhum metilação em dois sítios de ligação de Sp1 (-224, -164 CPG), bem como a de ZF5 (-192, -190, -188 CpG). O tratamento da cromatina derivado da amostra de tumor de pulmão não revelou a presença de ocupação nucleossomal em clones analisados ​​no fragmento TSFR1. No entanto, esse resultado baseou-se em tumores de pulmão em pool que ainda expressas em algum grau

Cadm1

. Além disso, tumor do pulmão é composto por diversos tipos de células, incluindo os não-cancerosas que pudessem ter contribuído para os resultados mostrados na Figura 2. No entanto, ao nível de linhas celulares de tumores individuais, marcadas diferenças no posicionamento nucleossomal foram observados como discutido abaixo.

M.SssI mapas de cromatina de diferentes linhas celulares de cancro do pulmão.

Realizamos

M.Sss

mapeamento I em linhas celulares de cancro do pulmão 10 com diferentes graus de

Cadm1

hipermetilação do promotor e a repressão transcricional, assim como uma linha de células de cancro do pulmão tratadas com 5-aza-dC. Semelhante ao tumor do pulmão, devido a metilação de CpG endógena nas linhas celulares de cancro de pulmão, apenas padrões de CpG não metiladas (i.e. protegida) após

M.Sss

eu tratamento foram considerados. Analisou-se os mapas de linhas de células individuais (Figura S6, S7), bem como colectivamente. Como mencionado anteriormente, nós também analisamos os padrões de DNA genômico “nu” a partir de uma linha de células de cancro do pulmão (A2C12), que foi endogenamente metilado (ver Figura S1C). Além disso, para confirmar os resultados e determinar os padrões de diferentes instantâneos da

Cadm1

promotor, temos vindo a desenvolver dois ensaios clínicos de tratamento em algumas linhas celulares (Figura S6). Aqui, descrevemos o colectivo

M.Sss

Eu mapas encontrados nas linhas de células de câncer de pulmão com pouco ou nenhum

Cadm1

expressão do gene.

Para fragmento de BFR, um trecho de, pelo menos, três CpG não metiladas foram observadas em muitos clones. Estes três locais em -944, -924, -903 CpGs, estão localizados no interior nuc 1 e, portanto, sugerindo a ocupação deste nucleossomo (Figura S2). Para fragmento 1FR, embora houvesse clones que exibiam uma extensão de pelo menos três CpG não metilados para sugerir ocupação nucleossoma (Nuc 2), a maioria dos clones foram CpGs altamente metilados e a fonte desta metilação pode ser tanto endógena e devido à

H .sss

I tratamento (Figura S3)

.

para fragmento MFR1, a maioria dos 98 clones foram altamente metilado, exceto para os dois CpGs em -423 e -408. Estes dois CpG estão dentro da sequência de ligação previsto de factores de transcrição (PPARg, er), e são na fronteira de nucA 3 (Figura S4). A protecção destes dois locais CpG poderia ser tanto de se ligar a transcrição e nucleossoma deslizante. resultados da EMSA sugeriu que PPARg ligamento

in vitro

ao

Cadm1

promotor com extractos nucleares a partir da linha de células de cancro do pulmão (A2C12), mas não no pulmão normal (Figura S8), e pode jogar um papel no câncer de pulmão.

para fragmento MFRA, havia cinco clones entre 86 clones com quase nenhum metilação para sugerir ocupação nucleossomo (nuc 3) (Figura S5). Havia também locais CpG individuais que apresentaram baixa metilação, especialmente os locais de ligação o SP1 a -224 e -211, localizada na fronteira de um nucleossomo (nuc 4) (Figura S5). Assim, a protecção nas linhas de células de câncer de pulmão em -224 e -211 poderia ser devido tanto à ligação SP1 e ocupação nucleossomo.

Para fragmento TSFR1, a maioria dos 84 clones exibido longos trechos de CpG não metiladas para sugerir alta ocupação nucleossomo (nuc 4 e nuc 5) em torno do TSS (Figura 2). Um pedaço de protecção era evidente nos locais CpG -224 a -188; outro patch estava em -174 a -90. Os sítios de ligação para SP1 e ZF5 estão dentro de um pedaço de CpG não metiladas que indicam oclusão devido à ocupação nucleossomo. Para apoiar esta hipótese de uma ocupação nucleossoma, o mesmo trecho de unmethylation foi encontrada após o tratamento da cromatina de uma linha celular de cancro de pulmão (GA7) com

M.Cvi

PI (GPC metilase), e em que a metilação de locais CpG (= endógena de metilação de CpG) foi marcado (dados não mostrados).

linha de células de cancro de pulmão (A2C12) após o tratamento com 5-aza-dC.

A linha de células responde A2C12 para o tratamento com 5-aza-dC resultando em

Cadm1

re-expressão. No entanto, o grau de re-expressão varia de tratamento para tratamento. Analisamos o

M.Sss

Eu o mapa de A2C12 5-aza-DC-tratados que exibiu ligeira

Cadm1

gene re-expressão e em comparação com não-tratada A2C12 e pulmão normal (Figura 3 ). Para fragmento de BFR, alguns clones agora mostrou trecho de CpG não metiladas, e este resultado sugeriu ocupação nucleossomo (nuc 1). Para fragmento 1FR, três clones também mostrou trechos de CpG não metiladas para indicar ocupação nucleossomo (nuc 2).

(A) Localização dos cinco fragmentos analisados ​​na região promotora

Cadm1

que cobrem 69 CpGs -944 a +41, relativamente ao local de início da tradução, ATG. CpGs são representadas por listras. (B-D) mapas de metilação de pulmão normal e A2C12; caixas azuis representa CpGs não metilados (= protegida), enquanto as caixas vermelhas, CpGs metilados. Os fragmentos são apresentados com relação à sua localização ou seja, desde a TSFR1 BFR. Os CpGs na sequência núcleo de locais de ligação SP1 e ZF5 são indicados por setas. (D) Após o tratamento e ligeira gene re-expressão 5-aza-dC, alguns clones se assemelham padrões encontrados no pulmão normal (por exemplo, em TFSR1, em anexo), para sugerir remodelação nucleossomo (despejo) na expressão do gene.

nos próximos três fragmentos em direção ao TSS (MFR1, MFRA, TSFR1), alguns clones apresentaram padrões semelhantes aos de pulmão normal, que é indicativo de padrões associados com nucleossomos despejadas e transcrição ativa. Para fragmento MFR1, seis clones se assemelhava padrões de não-nucleossomos de ocupação e factores de transcrição de ligação como visto no pulmão normal. Para fragmento MFRA, havia apenas quatro padrões observados: 7/21 completa ausência de metilação; 12/21 com o mesmo padrão e clones parecia estar em vias de ser reformado ou nucleossomo sendo expulsos; e 2/21 no meio. Os dois locais de Sp1 foram ocupadas em todos os clones. Assim, o SP1 é obrigatório em todos os clones com nucleossomos despejadas, um achado que está de acordo com os nossos resultados EMSA anteriores [29]. Para fragmento TSFR1, vários clones se assemelhava padrão encontrado no pulmão normal, indicando ausência de nucleossomo mas fator de transcrição de ligação. Este resultado sugeriu cromatina remodelação após 5-aza-dC tratamento.

Resultados gerais mapeamento M.SssI.

Para resumir,

M.Sss

Eu mapeamento em suportes pulmonar normal a formação de pelo menos cinco nucleossomos nas posições previstas ao longo região promotora do

Cadm1.

Havia clones para mostrar longos trechos de CpG não metilados nestas posições, especialmente nas duas nucleossomos (nuc 1, nuc 2)