Abstract

O splicing alternativo envolve a seleção exão diferencial de uma transcrição de genes para gerar mRNA e isoformas da proteína com a diversidade estrutural e funcional. splicing alternativo anormal tem sido mostrado para ser associado com fenótipos malignas de células cancerosas, tais como quimio-resistência e actividade invasiva. Rastreio pequenas moléculas e os medicamentos para a modulação da ARN splicing em linha celular de carcinoma hepatocelular humano Huh-7, que descobriu que a amilorida, distinto de quatro análogos de amiloride-afectar de pH, poderia “normalizar” splicing de

BCL-X, HIPK3

e

RON /MISTR1

transcrições. Nossas análises proteômicas de células tratadas com amilorida detectado hipo-fosforilação do fator de splicing SF2 /ASF, e diminuição dos níveis de SRp20 e duas proteínas SR un-identificados. Nós ainda observado diminuiu a fosforilação de AKT, ERK1 /2 e a PP1, e aumentou a fosforilação de JNK e p38, o que sugere que o tratamento com amilorida para baixo regula-cinases e fosfatases regula-se nas vias de sinalização conhecidos para afectar a fosforilação da proteína factor de splicing. Estes efeitos de amilorida “normalizado” oncogénica de splicing de ARN e factor de splicing hipo-fosforilação foram ambos anulada pela pré-tratamento com um inibidor de PP1. matriz exão global das células tratadas com amilorida Huh-7 detectado padrão de splicing alterações envolvendo 584 exons em 551 transcrições de genes, muitos dos quais codificam proteínas que desempenham um papel-chave no transporte de íons, formação de matriz celular, a remodelação do citoesqueleto, e manutenção genoma. análises funcionais celulares revelado invasão e subsequente defeitos de migração, interrupção do ciclo celular, citocinese deficiência, e degradação do DNA letal em células tratadas com amilorida Huh-7. Outros tumores humanos sólidos e células leucêmicas, mas não poucas células normais, mostrou semelhante splicing de RNA alterou-amiloride com consequência desvitalizado. Este estudo fornece, assim, bases mecanicistas para a exploração de pequena molécula de modulação de splicing de RNA de cancro terapêutica

Citation:. Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow G-P, Chan W-L, Lin H-H, et al. (2011) pequena molécula Amiloride modula Oncogênicos RNA splicing alternativo para desvitalizar Humano do Câncer células. PLoS ONE 6 (6): e18643. doi: 10.1371 /journal.pone.0018643

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de outubro de 2010; Aceito: 11 de março de 2011; Publicação: 09 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Research concede NSC-95-2320-B-037-049 (JGC), NSC 95-2311-B-009-004-MY3 (HDH) e NSC 97-2627-B-009-007 (HDH) a partir de o Conselho Nacional de Ciência de Taiwan e por DOH95-B-11-TM007 (WKY) e DOH96-TD-I-111-TM003 (WKY) do Departamento de Saúde de Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

complexidade proteoma é expandido através de processamento alternativo (aS), um processo que envolve a inclusão ou exclusão exão diferencial das mesmas moléculas de pré-ARNm para produzir várias isoformas de mRNA e proteína [1], [2]. O processo tal como é controlado por duas famílias de proteínas altamente conservadas: repetições de arginina /serina dipeptídicos (SR) e proteínas relacionados com ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP) proteínas relacionados com [3], [4]. SR proteínas contêm uma estrutura modular bipartido incluindo um ou dois motivos de reconhecimento de ARN no terminal N e um domínio rico em repetições RS dipeptídicos arginina /serina no terminal C [5], [6]. A função dos motivos N-terminais das proteínas SR envolve a sequência de ligação específica a exhancers splicing exónicos. O domínio RS C-terminal serve como um domínio geral de ativação para splicing através da ligação a um motivo de ligação RNA heterogênea [6]. proteínas SR regular a selecção dos locais AS, que divergem locais de splicing canônicas, promovendo, portanto, inclusão ou exclusão de exons alternativos. Por outro lado, alguns hnRNPs, tais como hnRNPA1, podem antagonizar a funcionar como proteínas de SR através da ligação a elementos de emenda ex�icas silenciador [7].

AS portanto regula a expressão do gene através da geração de isoformas proteicas discretas envolvidos em distinta funções de eventos celulares, tais como a apoptose, a determinação do sexo, axon orientação, a excitação de células, e a contracção celular [8], [9]. Tal como também desempenha um papel central no desenvolvimento de doenças hereditárias humanas e cancro [10], [11], [12], [13], [14]. Aberrante a partir de proto-oncogenes e /ou genes supressores de tumor pode contribuir para fenótipos malignas celulares, tais como a resistência à apoptose, a promoção da invasão e metástase, e estimulação de angiogénese de tumores [11], [12], [13], [14 ]. Postulando que a modulação desses genes relacionados com o cancro pode ter profundo impacto sobre suas atividades patogênicas, fomos à procura de pequenas moléculas ou drogas com efeitos sobre a AS modulação. Neste estudo, verificou-se que a amilorida, um diurético bem conhecido, pode alterar oncogénico do que nas células de carcinoma hepatocelular humano Huh-7, bem como em várias outras linhas de cancro humano e de células leucémicas, e, por conseguinte, explorar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes para possíveis implicações terapêuticas.

Resultados

Amiloride “normaliza” o splicing de RNA isoforma da

BCL-X, HIPK3

e

RON /MISTR1

em Huh -7 células

recentemente tornou-se claro que a emenda do RNA desequilibrada de certos genes está associada com propriedades malignas de células cancerosas humanas [11], [12], [13], por exemplo, resistência à quimioterapia e radioterapia, com

BCL-X, estado

onco-developmentally indiferenciado com

HIPK3,

e potenciais metastáticos invasivas com

RON /MISTR1

. No carcinoma hepatocelular Huh-7 células,

BCL-X

é alternativamente emendados em anti-apoptótica isoforma grande RNA,

BCL-XL,

mais de pequena isoforma RNA pró-apoptótica,

BCL-XS

[15];

HIPK3

é splicing no exão 11-excluídos L (-), bem como 11-exão incluídos L (+) para a interacção com as isoformas de Fas /FADD para modular a apoptose no processo de desenvolvimento [16]; e

RON /MISTR1

for dividida em 5-kb full-length (

flRON

) RNA e 2-kb exon 11-excluídos

RON

(

sfRON

) isoformas de RNA, o último dos quais tem sido correlacionada com a transição epitelial mesenquimal na invasão de células de cancro e metástase [17], [18]. Após uma análise mais de 500 pequenas moléculas e medicamentos, incluindo aqueles em uso clínico, descobrimos que amiloride exerceu um efeito potente sobre a AS destes transcritos do gene (Figura 1A). Huh-7 células tratadas com amiloride mostraram: (a) redução relativa de

BCL-XL Comprar e aumento de

BCL-XS isoformas

RNA; (B) manutenção relativa de

HIPK3

U (-) e diminuição de

HIPK3

U (+) isoformas; e (c) diminuição de ambos exon 11 (+)

flRON Comprar e exon 11 (-)

sfRON

RNA isoformas. Tais efeitos de amilorida foram dose e dependente do tempo, sendo detectáveis ​​por 2 horas e marcados após 24 horas de incubação com 0,5 mM de amilorida. Estas observações sugerem aumento da utilização da alternativa local de agregação 5′- a montante dentro do exão 2 de

BCL-X

, aumentou exon 11 (U) exclusão do

HIPK3

, e diminuiu complexos splicing formados para produção de ambos

RON /MISTR1

exon 11 (+) e exon 11 (-) isoformas. Assim, amiloride pode modular os AS destes três transcritos do gene para uma menor padrões malignos “normalizado”, semelhantes às normais em relatórios anteriores [15], [16], [17], [18].

o ARN foi extraído a partir de Huh-7 células expostas ao meio de crescimento contendo amiloride ou outros derivados modulador amilorida pHi e examinados para o ARN splicing alternativo oncogénica por RT-PCR, como descrito em Materiais e Métodos. O painel (a) mostra que o uso de amilorida aumento de alternativa local de agregação 5′- a montante dentro do exão 2 que produz a isoforma apoptótico de BCL-XS (linha superior), o aumento do exão 11 (exão L) saltando de HIPK3 que aumenta a isoforma apoptótica (linha do meio) e um ligeiro aumento do exon 11 saltando de RON à concentração de 0,5 mM (linha inferior). O painel (B) mostra que os padrões de splicing dos genes testados não foram significativamente afectados pelos quatro derivados amilorida, incluindo 5- (N-etil-N-isopropil) -amiloride ou EIPA; 5- (N-metil-N-isobutil) amiloride ou MIBA; 5- (N, N-dimetil) amiloride ou de DMA; e 5- (N, N-hexametileno) amiloride ou HMA, em concentrações equivalentes de modulação do pHi.

Como amilorida é um protótipo do pH intracelular (pHi) modulador de drogas, nós examinamos quatro derivados de amiloride em equivalente ou maior do pHi-afectar as doses. Observou-se que estes derivados não induziu efeitos similares “normalização” na

BCL-X

,

HIPK3,

e

RON /MISTR1

como padrões em Huh-7 células (Figura 1B). Por outro lado, em um estudo anterior [19] observou-se que 5- (N-ehyl-N-isopropílico) amiloride (EIPA), mas não amiloride modulada AS diminuindo a exclusão exon7 patogênico da

SMN2

transcrições de hereditária células atrofia muscular espinhal. Estas observações paradoxais demonstrar as complexidades dos mecanismos de AS e também sugerem que a escolha do local de splicing em

BCL-X

,

HIPK3,

e

RON /MISTR1

transcrições em amiloride- tratadas células Huh-7 é mediada através do mecanismo de splicing específico da célula (s) em vez de mudança de pH simplesmente intracelular.

detecção de proteômica do fator de splicing principalmente hipo-fosforilada SF2 /ASF no citoplasma e núcleo de tratados com amilorida células

Como estado de fosforilação de componentes proteicos SR na forma de complexos é conhecido para afectar a interacção proteína-proteína para a função de splicing, o próximo utilizado electroforese 2D-gel para analisar a expressão diferencial de proteínas serina-fosforilada. Encontramos mais de dez proteínas com alterações quantitativas após o tratamento amiloride (Figura 2). Escolhendo sete destes spots de proteínas para a identificação proteômica por espectrometria de massa (Tabela 1), encontramos um deles para ser ASF /SF2, um fator de splicing conhecida por estar envolvida na AS do

RON

transcrição [20] . Para verificar esta descoberta, foram realizadas transferências de Western de ASF /SF2 e encontrou marcadamente reduzida ASF /SF2 fosforilação tanto no citoplasma e núcleo de células Huh-7 tratadas com amilorida (Figura 3A). Análise de outros componentes proteicos de complexos de splicing (tais como SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, SAM68 e proteínas SR comuns) mostrou que SRp20 e duas proteínas SR fosforilados identificou-un foram igualmente reduzidas no citoplasma e núcleo após tratamento amilorida (Figura 3B). Estes resultados implicam que amiloride modula os a partir de

BCL-X

,

HIPK3,

e

RON /MISTR1

através de hipo-fosforilação de ASF /SF2 e diminuição da expressão de SRp20 e algumas outras proteínas SR.

2D-gel análise de eletroforese de proteínas extraídas de Huh-7 células sem (à esquerda) e com (direita) de tratamento 0,5 mM amiloride por 24 horas apresentaram mudanças significativas para pelo menos dez pontos, dos quais sete (indicado por setas) foram isolados para análise de espectrometria de nano-LC-MS /MS e identificação de proteínas, tal como mostrado na Tabela 1.

análise de transferência de Western de fracções subcelulares de células Huh-7 com e sem amilorida tratamento mM 0,5 24 horas foi realizada usando anticorpos específicos contra vários factores proteicos de splicing e β-tubulina. (Painel A) O tratamento amilorida aumentou as formas SF2 /ASF desfosforilados em ambas as fracções citoplasmáticos e nucleares. (Painel B) O tratamento amiloride diminuiu a expressão de SRp20 e duas proteínas SR fosforilados un-identificados em ambos C (citoplasmática) e N (nuclear) frações celulares.

Amiloride down-regula fosforilação de AKT cinase e da fosfatase PP1

estudos recentes têm mostrado que a amilorida inibe a fosforilação de cinases e fosfatases associados com a via PI3K-AKT [21], [22], [23], e que a AKT cinase e PP1 fosfatase pode regular a actividade de proteínas SR [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Por conseguinte, determinados os efeitos de amilorida sobre as formas fosforiladas de Akt quinase e as fosfatases relacionados em células Huh-7. Diminuição dos níveis do Ser (473) de p-AKT e a Thr (320) de p-PP1 foi observada no citoplasma e no núcleo, sugerindo a inibição da actividade de quinase AKT e activação da actividade de fosfatase PP1 (Figura 4A). Para determinar se a inactivação da Akt quinase, por si só iria desempenhar um papel na regulação do processamento alternativo, as células Huh7 foram tratados com inibidores da via PI3K-AKT, incluindo LY294002, wortmanina e triciribina; 1 | iM de triciribina, mas não LY294002 ou wortmanina diminuiu o nível de P-Akt. No entanto, com esta concentração de triciribina exerceu nenhum efeito sobre o processamento alternativo de

BCL-X

e

HIPK3

transcritos (Figura S1). Interessantemente, o pré-tratamento das células com ácido ocadaico para inibir a actividade de fosfatase PP1 anulou os efeitos da amilorida em

BCL-X

e

HIPK3

splicing, bem como efeitos de amilorida sobre a desfosforilação de SF2 /ASF e diminuição do nível SRp20, mas o ácido ocadaico exerceu qualquer efeito definido na expressão de hnRNP A1 e PRNhn A2B1 (Figura 4B). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a PP1 desempenha um papel importante na modulação de fosforilação de factores de splicing SR e, consequentemente, a modulação de oncogénica AS em células Huh-7 após tratamento com amilorida.

(Painel A). Western blots mostram uma diminuição significativa de citoplasmática P-Akt, Akt nuclear p-nuclear e p-PP1 em Huh-7 células tratadas com amilorida a 0,3 mM e acima. (Painel B) RT-PCR e análises de Western blot mostram que o pré-tratamento com um inibidor de PP1, ácido ocadaico, anulou os efeitos amilorida no BCL-X e HIPK3 ARN oncogénica splicing, a fosforilação de ASF2 /factor de splicing ASF e o nível de SRp20 em células Huh-7.

detecção exão-matriz Genome-wide de splicing de ARN alterado de muitos genes funcionais em células tratadas com amilorida

é possível que os efeitos de amiloride na fosforilação e localização intracelular de factores de splicing e mRNA de exportação [29] poderia afetar splicing de outros transcritos do gene, além de

BCL-X, HIPK3

e

RON /MISTR1

. O uso de chips de matriz gene (Affymetrix GeneChip® Exon Human 1.0 ST Array de 518000 exons de 42974 genes) para análise de arranjo de exon (parâmetros definidos do coeficiente de correlação ≥0.7, índice de splicing ≤-1.585, e log

2 rácio ≤- 1.585), descobrimos que amiloride influenciam os padrões de splicing de 551 genes que envolvem pelo menos 584 exons, que incluiu 495 genes codificadores de proteínas conhecidas envolvendo 526 exons (Tabela S1; Miame número de acesso # GSE24581). Estes 495 genes codificadores de proteínas conhecidas poderiam ser classificados em categorias funcionais que envolvem a remodelação do citoesqueleto, a adesão celular, o transporte de iões, factores de transcrição, resposta imune, e a contracção muscular (Figura 5A-C e Tabela S2). Para verificar estes resultados matriz exão, foram selecionados sete (

APF-1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPDS

e

survivin

) para análise por RT-PCR e de fato confirmou distinta AS alterações no padrão destes transcritos de genes em células tratadas com amilorida (Figura 5D).

Bioinformatic análises dos transcritos do gene 495 com splicing alternativo modificado com amilorida, detectados pelas medições exão-matriz do genoma, foram realizadas de acordo a categorias de ontologias gene de Processo Biológico (a), função molecular (B) e Celular Componente (C). Amiloride-alteradas como padrões de

APAF1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPD5

e

SU

R

Vivin

transcritos específicos de genes codificantes de proteínas detectado pelo exon- análise de arranjo foram validados por RT-PCR de isoformas de RNA splicing (Painel D)

em níveis detalhados ontologia gênica (GO), as transcrições de RNA mostrando aS afectadas pela amilorida incluída: a.). 4 de 5 genes (80,0%) de “atividade motora microfilament” (GO 0.000.146) e 28/132 (21,2%) dos genes de “atividade motora” (GO 0.003.774); b). 5 de 7 (71,4%) de “cação: atividade cloreto de symporter” (GO 0.015.377), 5/18 (27,8%) de “symporter ânion-cação” (GO 0.015.296), 3/10 (30,0%) de “potássio e sódio troca de ATPase “(GO 0.005.391) e 2/8 (25,0%) da atividade de troca aniônica inorgânico” (GO 0.005.452); c). 2 de 3 (66,7%) atividade sintase de óxido nitric- (GO 0.004.517); d) 16/29 genes (62,1%) de “matriz extracelular constituinte estrutural que confere resistência à tração” (GO 0.030.020), 38/346 genes (11,0%) de “citoesqueleto ligação às proteínas” (GO 0.030.020), 2/7 (28,6% ) de colágeno de ligação (GO 0.005.518); 2/8 (25,0%) de “miosina de ligação” (GO 0.017.022), e outros. De 213 genes relacionados com a apoptose, 6 (

CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC e PRPF8

) mostrou splicing alternativo alterado pelo amiloride. De 608 genes relacionados com o cancro, 32 incluindo

RON /MISTR1, ATM

(telangiectasias ataxia mutado) e

FANCM

(proteína anemia Fanconi M) foram afetados pelo amiloride. Como

ATM

desempenha um papel importante na reparação de danos no DNA, enquanto

FANCM

está envolvido na montagem de complexos de proteínas dis que mantêm a integridade do genoma e estabilidade [30], alterado AS destes dois transcritos do gene pelo amiloride pode resultar na degradação da cromatina, como verificado em nossos experimentos posteriores. No entanto,

RON /MISTR1

, mas não

BCL-X Comprar e

HIPK3

, estava entre os 495 genes detectados a ter padrões de emenda alterou-amilorida por análise de arranjo de exão, presumivelmente por causa dos critérios quantitativos rigorosos estabelecidos, e /ou sequências curtas de splicing

BCL-X

.

Usando sequências de consenso de nucleotídeos conhecidos de elementos reguladores de splicing, nós ainda identificados possível potenciador splicing e silencioso elementos no exon splicing alternativo, flanqueante 5 ‘e 3’ do intrão que flanqueia regiões de intrões dos 495 genes afectados pela amilorida (Tabela S3). Estes elementos cis splicing são os locais de ligação de ASF /SF2, SRp55 e outros factores reguladores desconhecidos. Durante interacções de SF2 /ASF e outros factores proteicos SR com elementos cis nos complexos de splicing, o estado funcional dos complexos de ligação proteína-proteína podem ser modulados pelo estado de fosforilação das proteínas [21], [23], [31] , [32]. Isto implica que o splicing alterada destes transcritos de genes foi mediada através induzida por amilorida hipo-fosforilação de SF2 /ASF e outras proteínas SR.

A diminuição da actividade de mobilidade de células /invasão e empobrecido estruturas do citoesqueleto seguinte como alterações de genes envolvidos após exposição amilorida

Porque alterada

RON /MISTR1

splicing mediada por SF2 /ASF foi mostrado resultar em aumento da mobilidade e actividades invasivos de células [20], examinámos o impacto funcional de amilorida diminuição induzida do exão 11 (+) fl

RON Comprar e exon 11 (-) sf

RON

isoformas (Figura 1C) e diminuição do exão 13 e exon 20 inclusão detectada por análise de matriz exão (Tabela S1). A migração de células a partir de uma borda monocamada raspada foi prejudicada pela amilorida 0,4 mM (Figura 6A). Fluorescente ligação alteração demonstrada de andaimes do citoesqueleto de actina F de uma estrutura de rede peri-nuclear em células de controlo para uma distribuição de superfície celular com um invólucro aparentemente rígida de múltiplos núcleos em células tratadas com amilorida faloidina, e depleção também grave de conteúdos citoplasmáticos, incluindo F-actina, após exposição a 0,4 mM ou mais elevadas concentrações de amilorida (Figura 6B). Estas observações de mobilidade celular prejudicada e organização citoplasmática anormal de F-actina são consistentes com os nossos achados de matriz exão de splicing de RNA alterado de muitos componentes interagindo proteína-chave da matriz extracelular, incluindo famílias de colágeno para as redes do citoesqueleto, bem como famílias de miosina e sua ligação proteínas (Tabela S1), além de

RON /MSTIR Comprar e moléculas regulatórias associadas.

(Painel a). A migração celular foi determinada em confluentes Huh-7 monocamadas de células raspadas com um raspador de plástico, expostas ao meio de crescimento com ou sem amilorida 0,45 mM durante 48 horas, lavou-se 2x com PBS e subsequente alimentadas com meio de crescimento sem amilorida. fotografias microscópicas em série dos mesmos áreas marcadas (verde ou vermelha sobre o lado inferior de pratos) tomadas em 48 e 96 horas mostram a inibição completa da migração das células a partir da borda da monocamada tratados com amilorida. (Painel B) As células expostas às concentrações indicadas de amilorida em meio de crescimento durante 36 horas, foram fixadas com paraformaldeído, permealized e corados com DAPI e FITC-faloidina para a observação por microscopia confocal. núcleos DAPI-manchadas estão em fotografias confocal mescladas pseudocolored-magenta. (Painel C) Efeito inibitório da amilorida em citocinese foi observada com Huh-7 células mitóticas sacudido do prato, re-plaqueadas em meio de crescimento contendo diferentes concentrações de amilorida. As células filhas divisórias foram fixados em 24, 48 e 72 horas, manchado e fotografado microscopicamente. (Painel D) Medição de distâncias entre os dois núcleos de dividir ou células filhas divididos mostra que amiloride inibe cytokinesis pós-mitótico e separação de células filhas. O diâmetro do núcleo da célula é definido como 10. A média eo desvio padrão de cada ponto de amostra é de 15 a 20 pares de células filhas.

Perturbação da progressão do ciclo celular e citocinese mitótico por amiloride

a nossa análise matriz exão de células tratadas com amilorida Huh-7 (Tabelas S1 S2) detectou alterações de splicing de RNA predominantemente de proteínas envolvidas na citocinese, associados ao transporte de soluto e funções de actina, microtúbulos, e cytokinesis- quinases relacionadas [33]. Além disso, o splicing de RNA alterado de

CENPE

(proteína centrômero E 312kDa),

CEP250

(proteína centrosomal 250kDa) e

seria esperado CEP192

(proteína centrosomal 192kDa) para resultar em separação ineficiente cromatídeos durante o ciclo celular. De facto, a proliferação de células Huh-7 foi inibido por amilorida 0,3 mM ou mais elevada no meio de crescimento (Figura 7A). Além disso, houve uma acumulação de células tetraplóides G2 /M com início às 24 horas, tornando-se marcada às 48 horas (Figura 7B). Por exame microscópico de luz, havia muitas células anáfase bi-nucleada e em estágio final que eram presumivelmente a população G2 /M tetraploid celular observado por fluorocytometry. Durante a progressão do ciclo celular e separação célula filha, na presença de várias concentrações de amilorida, as células mitóticas expostos a amilorida a 0,3 mM ou maior desenvolvida em formas bi-nucleadas em 24 horas mas posteriormente deixado para gerar células filhas separadas (Figura 6C e 6D) . Estes três observações implicam que através da alteração do ARN a partir de genes, amilorida provoca perturbações da citocinese através da inibição das células mitóticas de passar através de processos anafase final de abscisão, divisão, e separação de células filhas. Finalmente, confirmou um relatório anterior que as células Huh-7 Express Prominin /AC133 /CD133, um marcador imunológico das células “câncer tronco-like” [34], e descobriu ainda que amiloride a 0,3 mM ou mais sub-regulada expressão CD133 células huh-7 (Figura S2-a), resultando na supressão do número e tamanho das formações de colónias de células (Figura S2-B).

huh-7 células (painel a) plaqueadas em placas de 6 poços em 3 × 10

5 células por poço, durante a noite foram mudadas para meio de crescimento contendo várias concentrações de amilorida; os números de células foram determinados um e três dias depois. contagem de células em 24 horas mostram inibição do crescimento por amiloride em 0,4 mM e acima. Novas reduções da contagem de células foram evidentes às 72 horas, devido à morte celular e descolamento em meio contendo amiloride a 0,3 mM e acima. (Painel B) mostra a análise citof luorométrica amilorida inibição da progressão do ciclo celular com a acumulação de células em fase G2 /M. (Painel C) A apoptose é evidente pela detecção citofluorométricas de annexinV obrigatório em Huh-7 células tratadas com 0,5 mM de amilorida. (Painel D) Marcado degradação do DNA nuclear foi observada em Huh 7-células tratadas com amiloride 0,4 mM mas não com amiloride 0,2 mM, particularmente notado em 48 e 72 horas.

A morte celular com a degradação do DNA grave subseqüente ao splicing alterada induzida por amiloride de moléculas funcionais na apoptose e reparo de DNA vias

em células tratadas com amilorida, mudanças de emenda de

BCL-X Comprar e

HIPK3

RNAs ( Figura 1A) poderia prever mecanismos de apoptose celular alterado, e alterou a partir de

ATM

e

FANCM

RNAs (Tabela S1) alteraria reparo de DNA e mecanismos de proteção genoma celular. Huh-7, células de cultura na presença de 0,3 a amilorida 0,5 mM demonstrou não só a falta do crescimento das células, mas também subsequente perda de células plaqueadas inicialmente Huh-7 (Figura 7A). A apoptose foi evidente pelo aumento das percentagens de células ligação annexinV após exposição a amilorida 0,3-0,5 mM durante 24 ou 46 horas (Figura 7C). Além disso, a análise de ADN celular fluorocytometric mostrou grande fragmentação do ADN nuclear e degradação em mais do que as células a ser demonstrado sofrer apoptose; após a exposição ao amiloride 0,4 mM, a apenas 48,2%, 6,5% e 1,2% do Huh-7 células tinham perfis de ADN celular intactos após 24, 48 e 72 horas, respectivamente (Figura 7D).

efeitos de modulação similares de amilorida em splicing de RNA oncognic em outras linhas de tumores sólidos humanos e de células leucêmicas

Para determinar a generalidade dos efeitos amilorida observados em Huh-7 células, que usamos adicional de 10 estabelecida câncer e celulares de leucemia linhas humanos, incluindo 2 hepatoma HepG2 e Hep3B; rabdomiossarcoma TE671; 3 glioblastoma multiforme 8401, ASCG13T1xm e ASCG7T (4); linhas de células cancerosas invasivas 2 do cólon HT29 e COH; e 3 leucemias K562, células HL60 e MOLT4, e uma linha de estroma mesenquimal óssea normal derivadas de medula KP-hMSC, bem como algumas culturas de linfócitos de sangue normais, para executar diversas experiências supracitados. Nossos resultados mostraram que, em amiloride geral tendem a afetar o maligno fenótipo-associado como mais do que o normal, como na célula. Em primeiro lugar, essencialmente como em células Huh-7 (Figura 1), encontramos modulada-amiloride “normalização” do abornal

BCL-X Comprar e

padrões HIPK3

splicing em hepatoma Hep G2, rabdomiossarcoma TE671, glioblastoma 8401, K562 leucemias, HL60 e Molt4 (por exemplo, dados suplementares de [35]). Mais significativamente, amiloride pode modular a transcrição /splicing de

gene de fusão BCR-ABL Comprar e re-sensibilizar a resistente à quimioterapia

Bcr-Abl

T3151 células mutantes ao imatinib [35]. Pelo contrário, usando amiloride até 2 mM no meio de crescimento, detectamos nenhuma alteração no

BCL-X Comprar e

HIPK3

padrões de splicing em células mononucleares do sangue periférico normais activadas em cultura (complementar dados de [35]), nem no estroma da medula óssea células imortalizadas KP-hMSC. Consistentemente, amilorida na gama de 0,02 mM-0,5 mM foi citotóxico para as células cancerosas, mas não para células normais em cultura (Figura S3 A ​​ B). Usando um 72 horas

In vitro

ensaio de cultura, verificou-se que o crescimento de 50% da inibição doses de amilorida foram de aproximadamente 0,02 mM para TE671, 0,10 mM de K562, 0,20 mM de Huh-7, 0,3 mM durante dois outro HCC-Hep G2 e Hep-3B, e 0,2-0,4 mM para as três linhas de glioblastoma multiforme, mas (. Figura S3-B) 3 mM ou não mensurável para as linhas celulares normais. Além disso, foi realizada uma análise global de matriz exão no explosões mielóide leucemia K562 e glioblastoma 8401, com e sem tratamento com amilorida, para comparação com Huh-7 (Tabelas S1, S2 e S3). Prova cruzada dos 200 genes topo-marcados modulada à amilorida de cada uma das três linhas de células revelaram uma característica comum em vez de splicing modulado-amilorida, ou seja, que 187 genes ou 93,5% destes 200 foram os mesmos para os três células; 188 (187, mais

DNAH8

) para Huh-7 e 8401; 189 (187, mais

LRP2 /RYR2

) para Huh-7 e K562; e 190 (187 mais

ABL1, ColSA2, NAALAD2

) para 8401 e A549 (Figura S4-A). A análise GO dos 187 genes comuns de acordo com os processos biológicos (Figura S4-B), funções moleculares (Figura S4-C) e componentes celulares (Figura S4-D) categorias apresentaram distribuição percentual semelhante aos modulada-amilorida 495 genes de células huh-7 (Figura 5), ​​o que implica que, em células K562 e 8401 células como em células huh-7,-amilorida modulada como causas efeitos semelhantes sobre a estrutura do citoesqueleto, a citocinese e a reparação do ADN, bem como sobre o mecanismo de apoptose e o sistema de transporte de soluto.

Discussão

Este estudo é baseado na nossa conclusão inicial de que amilorida mudou o splicing de RNA alternativo de

BCL-X, HIPK3

e

RON /MISTR1

transcrições de padrões oncogênicos em relação padrões normais no carcinoma hepatocelular humano células Huh-7. Em experiências subsequentes, foi observada hipo-fosforilação de factores de splicing SR, especialmente SF2 /ASF, bem como em proteínas cinases e fosfatases a montante, sugerindo que a amilorida podem afectar o estado funcional dos complexos de inclusão /exclusão exão. análise exão global, de fato revelou alterações como em muitos transcritos do gene de redes celulares. Como consequência, Huh-7 células tratadas com amilorida mostrou diminuição da migração /invasão capacidades cytokinetic, progressão do ciclo celular retardada com defeitos mitóticas, aumento sinais apoptóticos, danos de DNA celular graves e morte celular final. Explorando resultados subsequentemente, temos agora obtidos que o tratamento com amilorida pode produzir semelhante à modulação e desvitalização efeitos de vários outros cancros sólidos malignos humanos e linhas de células leucémicas em adição ao carcinoma hepatocelular Huh-7, mas aparentemente não em algumas células normais em cultura testou- (Figuras S3 e S4).

Uma propriedade distinta de amilorida na modulação fenótipos malignas AS-mediadas

amiloride, 3,5-diamino-6-cloro-N- (diaminometileno) pirazinacarboxamida monocloridrato , foi desenvolvido em 1960 [36], e tem sido uma droga utilizada clinicamente para o tratamento de edema e hipertensão com base no seu transporte de sódio e os efeitos na homeostasia de fluidos [37]. Portanto, foi inicialmente pensado que os seus efeitos sobre o splicing de ARN oncogénica seria mediada por alterações no pH intracelular e o movimento de iões. No entanto, nenhum semelhante como alterações foram detectadas em Huh 7-células tratadas com quatro mais potentes análogos amilorida Phi-afectam, incluindo EIPA, que anteriormente mostraram para modular a patogênico

SMN2

transcrição em células de pacientes com atrofia muscular espinhal . Assim, a capacidade de alterar a partir de RNAs oncogênicos parece ser uma propriedade distinta de amilorida.

Como AS é controlado por proteínas da família SR altamente conservadas [1], [3], [5] e desempenha um importante