Abstract

A fim de explorar a utilização eficiente dos recursos vegetais de alagados construídos, os potenciais efeitos anti-metastáticos de flavonóides de

Potamogeton crispus

L. foram investigados em células de cancro humano do ovário (ES-2). Dois principais flavonóides, luteolina-3′-O-β-D-glucopiranósido e flavona-6-C-β-D-glucopiranósido, foi isolado a partir de

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e identificados. Os efeitos destes flavonóides sobre a proliferação celular, a morfologia das células, do ciclo celular, apoptose, e a migração celular e invasão foram então investigados. Além disso, a transcriptase reversa da polimerase ensaios de reação em cadeia e análise de Western blotting foram conduzidos para examinar o nível de mRNA e expressão de proteína. Os resultados indicaram que a luteolina-3′-O-β-D-glucopiranósido inibida ES-2 migração celular e invasão e suprimiu a expressão de duas metaloproteinases da matriz (MMP), MMP-2 e MMP-9, e flavonas-6-C-β -D-glucopiranósido teve nenhum efeito inibitório significativo sobre as células ES-2. Assim, este estudo demonstrou as potenciais propriedades anti-metastáticos de um

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flavonóides, e forneceu uma abordagem científica para o rastreamento dos recursos naturais promissores de alagados construídos para identificar produtos úteis para uso nas indústrias farmacêutica e de saúde

Citation:. Du Y, Feng J , Wang R, Zhang H, Liu J (2015) Efeitos de flavonóides de

Potamogeton crispus

L. na proliferação, migração e invasão das células do cancro do ovário humano. PLoS ONE 10 (6): e0130685. doi: 10.1371 /journal.pone.0130685

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia, República da

Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 24 de maio de 2015; Publicação: 22 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 31.200.426), Projeto Nacional especial água (No. 2012ZX07203-004), Ciência e tecnologia Projeto de Planejamento da província de Shandong (No. 2011GGH21605) e Natural Science Foundation da província de Shandong da China (No.ZR2014YL001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

plantas desempenhar um papel fundamental na construção de ambientes de zonas húmidas de engenharia e eles devem ser geridos estritamente para manter a eficiência de zonas húmidas, minimizando o risco de poluição secundária e efeitos ecológicos negativos sobre o ecossistema. utilização eficiente de alta biomassa recursos vegetais wetland é importante porque incentiva a colheita e gestão sustentável das zonas húmidas construídas.

Potamogeton crispus

L. é uma das plantas mais importantes utilizados em ecossistemas alagados construídos [1]. Os relatórios anteriores identificaram carotenóides, ácidos graxos, lignana, diterpenos labdano, flavonóides e phytosterins em

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[2-5], e extratos de carotenóides de

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foram relatados para induzir a apoptose em células HeLa

in vitro

[6]. Nosso estudo preliminar mostrou actividades anti-tumorais de um

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extrato no peito humano e linhas celulares de cancro do ovário [7], e análises químicas sugeriu flavonóides ser os principais componentes deste extrato.

Está bem estabelecido que os flavonóides têm uma grande variedade de atividades bioquímicas e que desempenham um papel importante no setor de saúde humana [8-9]. dados epidemiológicos e clínicos indicam que os flavonóides dietéticos fazer contribuições cruciais para a prevenção e /ou tratamento de doenças crônicas como câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e infecção pelo vírus da imunodeficiência humana, [10-14]. Investigações recentes sobre as propriedades de flavonóides tem sido focada sobre as suas actividades anti-tumorais citotóxicos, e estudos experimentais indicaram que os flavonóides suprimir a migração e invasão, afectar a progressão do ciclo celular e induzir a apoptose de várias linhas celulares de tumor [15-16].

metástase do cancro é a principal causa de mortalidade em pacientes com tumores malignos, e estima-se ser responsável por 90% das mortes relacionadas com o cancro humanos [17]; ele permanece, assim, um desafio importante para a terapia do cancro. A degradação da matriz extracelular (ECM) é uma característica essencial de tumores metastáticos e este processo está associado com a sobre-expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) [18-19]. Tem sido relatado que a luteolina e baicaleína flavonóides inibir a metástase através da supressão da expressão e secreção de MMP2 e MMP9 em células de cancro da mama humano (MCF-7 e MDA-MB-231) e células de carcinoma hepatocelular (em MHCC97H) [20-22] . No entanto, não está claro se os flavonóides têm efeitos anti-metastáticos em células de cancro do ovário.

No presente estudo, nós purificado dois flavonóides de

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e examinou seus efeitos sobre o câncer de ovário humano linha de células ES-2. A proliferação, a morfologia, a progressão do ciclo celular, apoptose, migração e invasão destas células foram investigados com o objectivo de elucidar os efeitos de

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flavonóides sobre as células ES-2 e os mecanismos envolvidos.

Materiais e Métodos

Ética declaração

A pesquisa de campo e coleta de amostra envolvidos neste estudo foram realizados com a permissão oficial do Bureau de Proteção Ambiental de Weishan County e do Comité de Gestão da Xinxue Rio construída pantanal. O trabalho de campo não envolve quaisquer espécies de plantas ameaçadas ou protegidas ou de qualquer espécie animal. O protocolo laboratorial foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Shandong.

Preparação de material vegetal

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material foi coletado no rio Xinxue construída pantanal (117.16 ° E, 34.78 ° N), em Nansi Lake, Weishan County, China. A coleta foi realizada no início de julho, quando o

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teve a biomassa máxima. A planta inteira foi seca, em pó, e extraiu-se com etanol, sob refluxo, aquecimento, três vezes, durante 90 minutos por cada extracção. O extracto de etanol foi então suspenso em água antes de se repartir com éter de petróleo (PE), acetato de etilo (EtOAc), e n-butanol sequencialmente; estes foram concentrados sob vácuo para dar um extracto de PE, um extracto de EtOAc, e um extracto de n-butanol. Com base nos nossos estudos anteriores [7], o extracto de EtOAc foi seleccionado para posterior separação. O extracto de EtOAc foi cromatografado sobre uma coluna de gel de MCI, seguido por cromatografia em coluna Sephadex LH-20, os dois compostos principais foram então preparadas usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Agilent 6270, EUA). Os dois compostos foram identificados por HPLC, de ressonância magnética nuclear (RMN) (AVANCE 600, Bruker, Alemanha), e espectrometria de massa com ionização por electrospray de alta resolução (HR-ESI-MS) (LTQ Orbitrap XL, ThermoFisher, EUA).

cultura celular e tratamento

a linha de células de cancro do ovário humano ES-2 foi obtido a partir da Análise e Test Center Shandong, em agosto de 2014. as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, EUA) e antibióticos (100 ug /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) (Hyclone). As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Os compostos foram dissolvidos a uma concentração de 0,1 M em 100% sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Solarbio, China), para formar soluções de reserva, armazenados a -20 ° C, e diluído para as concentrações indicadas, com a forma antes de cada experiência. A concentração final de DMSO não excedesse 0,1% durante todo o estudo, e todos os grupos de controlo foram expostos a 0,1% de DMSO.

proliferação celular ensaio

flavonóides efeitos sobre a proliferação celular foi avaliada utilizando o MTT (azul de tiazolilo brometo de tetrazólio) (Solarbio) ensaio. células ES-2 foram semeadas (1 × 10

4 por poço) numa placa de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS. Após incubação durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2, diferentes concentrações (15-240 ug /mL) dos compostos foram adicionadas a poços em triplicado. Após incubação durante 48 h, adicionou-se MTT a cada cavidade para se conseguir uma concentração final de 0,5 mg /ml e a incubação foi realizada durante um adicional de 4 h. O meio foi então substituído com a solução de paragem (DMSO; 150 mL por poço) e a absorvância a 490 nm foi medida num leitor de placas (Enspire, Perkin Elmer Corporation, EUA). Os controles DMSO a 0,1% foram medidos em paralelo. A citotoxicidade foi expressa como a taxa de inibição, o qual foi calculado da seguinte forma: em que A

controle = a absorvância dos poços de controlo; A

amostra = a absorvância dos poços tratados; A

0 = a absorção de poços branco. Origem 7,5 software foi utilizado para analisar os dados e calcular IC

50 valores. Os ensaios foram repetidos pelo menos três vezes.

A observação da morfologia celular

ES-2 As células foram cultivadas tal como descrito para o ensaio de proliferação celular. As células foram tratadas com 30 ou 60 ug /mL de luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3’O-GP) ou 100 ug /mL de flavona-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP ). A morfologia celular observações foram efectuadas após incubação durante 48 h, utilizando um microscópio invertido de fluorescência (TI-S, Nikon, Japão).

ciclo celular ensaio progressão

ES-2 células (5 × 10

4 por poço) foram semeadas numa placa de 6 poços e incubadas durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2 antes da adição dos compostos indicados preparadas em meio completo durante 48 h. As células foram então recolhidas por tripsinização, lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante 2 h. As células foram lavadas duas vezes com PBS, e centrifugou-se a 2000 rpm durante 5 min; o sobrenadante foi descartado. As células foram re-suspensas em 100 uL de PBS contendo ARNase (50 ug /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 30 min; a reacção foi então parada colocando em gelo durante 2 min. As células ES-2 foram coradas por incubação com iodeto de propídio /ml 10 ug (PI) com 0,1% de Triton X-100 no escuro a 4 ° C durante 30 min. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACSAria, BD, EUA) e os resultados foram analisados ​​por FlowJo 7.6.1.

apoptose celular ensaio

A anexina-V-PE /7-AAD kit de detecção de apoptose (BD Pharmingen, EUA) foi utilizado para investigar os efeitos dos compostos de teste sobre a apoptose em células ES-2. Anexina V é uma proteína que tem uma elevada afinidade para a fosfatidilserina (PS). Durante a apoptose, PS transloca-se a face interna da membrana plasmática para a superfície celular, onde pode ser detectado utilizando um conjugado de anexina V fluorescente. células ES-2 foram cultivadas e semeadas como descrito acima para o ensaio de progressão do ciclo celular. Após a incubação com

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flavonóides durante 48 h, as células foram recolhidas por tripsinização, lavadas duas vezes com PBS e re-suspensas em 400 uL de tampão de ligação antes da adição de 5 mL de anexina V-PE, a incubação no escuro a 4 ° C durante 15 min, e coloração com 10 mL de solução de 7-AAD. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACSAria, BD) após a incubação no escuro a 4 ° C durante 15 min, e os resultados foram analisados ​​pelo software FlowJo 7.6.1. Apoptótica e células necróticas foram identificados por anexina V positiva /7-AAD coloração negativa e anexina V coloração positiva positiva /7-AAD, respectivamente.

A migração celular ensaio

ensaios de migração celular foram realizadas usando Transwell câmaras (Corning Costar, EUA) a câmara de Transwell foi preenchido com albumina de soro médio e 0,1% de bovino (BSA) (Gibco, Life Technologies) foi incluído no meio isento de soro, na câmara superior, para manter a pressão osmótica. células ES-2 foram expostas às concentrações de flavonóides indicados em um meio isento de soro durante 48 h antes de se adicionar as células (2 x 10

5) para a câmara superior Transwell. A câmara de meio continha inferior com 5% de FBS para servir como um quimio-atractor. As câmaras foram incubadas durante 24 h, e as células não-migração sobre o lado superior da membrana Transwell foram removidos usando cotonetes de algodão. A membrana foi fixada em 100% de metanol; as células migradas foram depois coradas com 0,1% de violeta de cristal durante 10 minutos, e lavadas três vezes com PBS. A membrana foi fotografado sob um microscópio antes de ser lavada com ácido acético 33%; a absorvância do eluente foi medida a 590 nm num leitor de placas (Enspire, Perkin Elmer Corporation).

invasão celular ensaio

invasão celular foi ensaiada utilizando o protocolo descrito acima para a migração de células ensaio, excepto que a câmara de Transwell com Matrigel foi revestido (BD Pharmingen) e o meio estava livre de BSA.

ensaio de isolamento de ARN total e a transcriptase inversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

ES-2 As células foram semeadas numa placa de 6 poços (4 × 10

5 células por poço) e incubadas durante a noite antes do tratamento com várias concentrações de LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /mL ) durante 48 h. As células foram recolhidas por tripsinização e lavadas em PBS. O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen, Life Technologies) e 5 mg foi utilizado para sintetizar ADNc, utilizando M-MLV (Invitrogen, Life Technologies). O cDNA foi amplificada utilizando os seguintes sequências iniciadoras (BGI, China):

MMP2, para a frente, 5′-GTTCATTTGGCGGACTGT-3 ‘, reverso, 5′-AGGGTGCTGGCTGAGTAG-3’;

MMP9 , para a frente, 5′-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3 ‘, reverso, 5′-CCAAACTGGATGACGATGTC-3’;

Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), para a frente, 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘, reverso, 5’ -CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3 ‘

a PCR foi efectuada utilizando o seguinte programa:. 95 ° C durante 5 min; depois 45 ciclos de 95 ° C durante 10 s; 55 ° C durante 15 s; e 72 ° C durante 10 s. As amostras foram, em seguida, aquecida (72 ° C durante 10 min) e arrefecida a 4 ° C. GAPDH foi usada como controlo de carga de ARN. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 1% e detectados por coloração com brometo de etídio. Os resultados foram analisados ​​por BandScan5.0.

Western blotting análise

ES-2 As células foram semeadas numa placa de 6 poços (4 × 10

5 células por poço) e incubadas durante a noite antes do tratamento com várias concentrações de LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml) durante 48 h. As células foram suspensas em 500 uL de tampão de lise a 4 ° C (Tris-HCl a 40, EDTA a 1 mM, KCl a 150 mM, NaVO3 100 mM, PMSF a 1% de Triton X-100, 1 mM, pH 7,5). As proteínas foram separadas por electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio a 10% e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram subsequentemente bloqueadas com leite desnatado em 5% de solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST) a 37 ° C durante 1 h e incubou-se durante a noite com anticorpos primários (MMP-2 de anticorpo: Santa Cruz Biotechnology, EUA; MMP-9 anticorpo: RabMab, Abcam, Reino Unido) em TBST contendo 5% de leite desnatado a 4 ° C. As membranas foram depois incubadas com um anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas foram detectadas por quimiluminescência aumentada e fotografada; os resultados foram analisados ​​pelo programa Image J.

Análise estatística

Para cada ensaio, ensaios em triplicado foram realizados e os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD). O significado de diferenças entre os grupos foi analisada pelo teste t bicaudal de Student (software Microsoft Excel).

Resultados

Identificação dos dois principais

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flavonóides

HPLC, RMN e HR-ESI-MS foram conduzidos para isolar e identificar os dois compostos principais dentro do

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extracto de EtOAc. Estes compostos foram identificados e caracterizados como luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3’O-GP) e Flavone-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP) por comparação dos seus dados espectrais (HPLC , HR-MS-ESI,

1H e

13C RMN) e propriedades físico-químicas com os relatados na literatura [23-25]. Este é o primeiro relato de extracção destes dois flavonóides de

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. A estrutura molecular dos dois compostos foram mostrados na Figura 1, e a pureza de ambos os compostos foi superior a 90% (Figuras a e b no ficheiro S1).

LU3’O-GP inibida ES- 2 proliferação celular

ES-2 células de cancro do ovário foram incubadas durante 48 h com cinco concentrações diferentes de LU3’O-GP ou FL6C-gp. Os resultados do ensaio de MTT indicaram uma redução dependente da concentração na viabilidade celular na presença de LU3’O-GP (Figura 2). A viabilidade celular diminuiu em 63,8% e 73,6% após 48 h de exposição a 120 e 240 ug /mL LU3’O-GP, respectivamente, e o

valor de IC50 foi de 57,1 ug /mL. As mesmas concentrações de FL6C-GP teve um impacto significativamente menor sobre a viabilidade celular e este composto tinha uma

valor de IC50 de 182,7 ug /mL. Estes resultados indicaram que LU3’O-GP inibiu a proliferação de células ES-2 de um modo dependente da concentração

As células foram incubadas com cinco concentrações diferentes de flavonóides ou sulfóxido de dimetilo. (DMSO; controlo) durante 48 h. Os dados representam as médias de experiências em triplicado ± desvio padrão (SD) *

p Art 0,01.

LU3’O-GP afetados morfologia ES-2

exames morfológicos foram realizados para investigar o efeito de LU3’O-GP em células ES-2. As células ES-2 foram tratadas com concentrações de LU3’O-GP associados com baixa citotoxicidade (30 e 60 ug /ml), ou 100 ug /ml FL6C-gp. As imagens obtidas por microscopia invertida após 48 horas de incubações são mostrados na FIG 3. O controlo e as células de comparação FL6C-gp mostraram o padrão de células fusiformes clássica observada em células tumorais de ovário. As células tratadas com LU3’O-GP mostrou uma perda significativa da mobilidade e alterações na morfologia da célula; A principal alteração morfológica foi à forma cytomere, que se tornou esférico, com um tentáculo encurtado. Estas alterações ocorreram de um modo dependente da concentração. O tratamento FL6C-GP não produziu qualquer alteração significativa, em comparação com células de controlo. Estes resultados indicaram que LU3’O-GP poderia alterar a morfologia celular de células ES-2 e sugeriram a sua possível influência sobre a mobilidade celular.

ES-2 As células foram tratadas com o indicado

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flavonóides crispus

para 48 h, e fotografada usando um microscópio de fluorescência invertido.

LU3’O-GP induzida paragem do ciclo celular em células ES-2

Para determinar se

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flavonóides afectada do ciclo celular, as células ES-2 tratados com LU3’O-GP ou 100 ug /mL de FL6C-GP para comparação, antes da análise por citometria de fluxo. Os resultados (figura 4) indicou que o tratamento LU3’O-GP causaram aumentos dependentes da concentração no número de células na fase G0 /G1, e uma diminuição do número de células em fase S, enquanto que o tratamento FL6C-GP não tiveram efeitos significativos na progressão do ciclo celular em células ES-2. Estes resultados demonstraram que LU3’O-GP afectada ES-2 progressão do ciclo celular, causando a paragem do ciclo celular na fase limite de fase G1 e na fase S

(a) controlo negativo.; (B) as células tratadas com 100 ug /mL de flavona-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP); (C) as células tratadas com 30 ug /mL de luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3’O-GP); e (d), as células tratadas com 60 ug /mL LU3’O-gp. As células foram fixadas com etanol e coradas com iodeto de propidio antes da análise da distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo. O número de células na fase G0 /G1 é representado pelo primeiro pico, e aqueles na fase G2 /M são representadas por o segundo pico. As células na fase S estão presentes na área entre o G0 /G1 e G2 /M picos. Estes dados representam a média de experiências em triplicado. *

p

0,01 em comparação com o controle

P

..

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flavonóides não teve nenhum efeito sobre a apoptose em células ES-2

A apoptose é um modo activo e fisiológico de morte celular que é comumente restaurada por agentes anti-cancro. A citometria de fluxo foi usada para determinar se LU3’O-GP afectada ES-2 apoptose. Como representado na figura 5, a população de células na zona Q3 representado as células apoptóticas, que foram anexina V positiva e negativa 7-AAD. Esta população não mostrou nenhuma mudança óbvia na presença de LU3’O-GP ou FL6C-GP, sugerindo que

P

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flavonóides não teve nenhum efeito sobre a apoptose em células ES-2

(a) controlo negativo.; (B) as células tratadas com 100 ug /mL de flavona-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP); (C) as células tratadas com 30 ug /mL de luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3’O-GP); (D) As células tratadas com 60 ug /mL LU3’O-gp. células em apoptose são mostrados na Q3.

LU3’O-GP inibiu a migração e invasão de células ES-2

motilidade celular é considerada um determinante importante do potencial metastático células cancerosas. O efeito de LU3’O-GP sobre a motilidade das células cancerosas ES-2 foi examinada utilizando um ensaio de migração de células. Como mostrado na Figura 6, a migração de células ES-2 foi significativamente diminuído em uma maneira dependente da concentração após a exposição ao LU3’O-gp. Esta inibição foi de cerca de 67,7% e 88,1%, em comparação com células de controlo, na presença de 30 e 60 ug /mL LU3’O-GP, respectivamente. As células tratadas com FL6C-GP não mostrou qualquer alteração significativa na actividade de migração, em comparação com células de controlo.

As células foram expostas às concentrações indicadas de luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3 ‘ O-GP) e flavona-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP), e a sua migração foi quantificada utilizando uma câmara de Transwell. Os valores representam as médias de experiências em triplicado. *

p Art 0,01, em comparação com o controlo; #

p Art 0,05, em comparação com a concentração indicada.

durante a metástase do tumor, as células devem passar através da MEC. Para avaliar se LU3’O-GP afectada invasão de células ES-2, os ensaios de invasão de células foram realizados numa câmara de Transwell revestidas com Matrigel. O tratamento de células ES-2 com o aumento das concentrações de LU3’O-GP levou a uma diminuição dependente da concentração significativa na taxa de invasão de células, em comparação com o controlo (Figura 7). Este processo foi inibida em cerca de 73,7% e 89,9% na presença de 30 e 60 ug /mL LU3’O-GP, respectivamente, enquanto que a inibição induzida por 100 ug /mL FL6C-GP foi apenas 6,7%. Os resultados deste ensaio demonstraram que LU3’O-GP inibiu dramaticamente a invasão de células ES-2.

As células foram tratadas com luteolina-3′-O-β-d-glucopiranósido (LU3’O-GP ) ou flavona-6-C-β-d-glucopiranósido (FL6C-GP), e a sua invasão foi quantificado numa câmara de membrana Transwell com Matrigel. Os valores representam as médias de experiências realizadas em triplicado. *

p Art 0,01, em comparação com o controlo; #

p Art 0,05, em comparação com a concentração indicada.

Para determinar a influência da LU3’O-GP sobre os factores a montante que são importantes para a regulação da invasão de células de tumor, o ARNm e a proteína de expressão MMP2 e MMP9 foram investigados. Os resultados do ensaio de RT-PCR são mostrados na FIG 8. Os níveis de MMP2 e MMP9 de mRNAs foram reduzidos de uma forma dependente da concentração por tratamento com LU3’O-GP, análise de transferência de Western (Figura 9) demonstraram uma supressão semelhante de MMP- 2 (pro-MMP2 e actividade de MMP-2) e MMP-9 a expressão da proteína por LU3’O-gp. Estes resultados sugerem que o flavonóide, LU3’O-GP, suprimiu a expressão de MMP2 e MMP9 em ambos os níveis de mRNA e proteína

(a) efeitos LU3’O-GP em MMP-2 expressão.; (B) efeitos LU3’O-GP sobre a MMP-9 expressão. Os níveis de ARNm foram investigados por reacção em cadeia de polimerase transcriptase inversa (RT-PCR), utilizando gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, como controlo de carregamento. Os produtos de RT-PCR foram detectados por coloração com brometo de etídio. Os valores representam as médias de experiências em triplicado. *

p Art 0,05, em comparação com o controlo

(a) efeitos LU3’O-GP sobre a MMP-2 (pro-MMP-2 e actividade de MMP-2).; (B) efeitos LU3’O-GP sobre a MMP-9 expressão. Os níveis de proteína foram investigadas pela análise boltting ocidental. Os valores representam as médias de experiências em triplicado. *

p Art 0,05, em comparação com o controle.

Discussão

Neste estudo, dois grandes flavonóides, LU3’O-GP e FL6C-GP, foram isolados e identificados a partir de

P

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crispus

com o objetivo de explorar os potenciais efeitos anti-metastáticos deste recurso planta alagado construído. A metástase é a principal causa de morte em doentes de cancro e o desenvolvimento de novos regimes de tratamento que inibem a disseminação tumoral é crucial para a terapia do cancro e prevenção bem sucedida. No entanto, a maioria altamente citotóxicos drogas anti-câncer sintéticos possuem uma baixa especificidade; este produz efeitos sobre os tecidos normais, além das células de tumor, levando a resultados clínicos pobres. ênfase considerável tem portanto sido dada para a identificação de novos agentes anti-cancro a partir de fontes naturais, e os recursos alimentares são particularmente valiosos devido à sua elevada margem de segurança; muitos agentes dietéticos naturais estão actualmente em ensaios clínicos de fase precoce [26]. Flavonóides fornecem um dos mais notáveis ​​recursos naturais neste contexto. flavonóides dietéticos quase todos existir como glicosídeos na natureza e as mais abundantes plantas glicosídeos flavonóides são flavona O /C-glicosídeos e flavonóis S-glicosídeos [27].

LU3’O-GP é uma flavona O-glicosídeo e FL6C-GP é uma flavona C-glicósido. No entanto, o presente estudo indicou que LU3’O-GP produziu efeitos significativos sobre a proliferação ES-2, a morfologia, a progressão do ciclo celular, migração e invasão, enquanto FL6C-GP teve nenhum efeito aparente sobre estas células. Nossa hipótese é que essa diferença foi relacionada com duas diferenças entre estes compostos. Em primeiro lugar, agliconas de flavonóides podem apresentar diferentes bioactividades. Luteolina, as agliconas de LU3’O-GP, e alguns luteolina C-glicósidos têm demonstrado inibir a sobrevivência de células tumorais e metástases de várias células cancerosas humanas epitelióides incluindo MCF-7, MDA-MB231 e células LNM35 [21, 28- 29]. Em segundo lugar, os glicosidos flavonóides são também se difunda através da membrana celular solúvel em água, ao passo que as agliconas são mais hidrofóbicos e podem facilmente entrar nas células por difusão passiva; deglycosylation de glicosídeos flavonóides para suas agliconas é, portanto, considerada a primeira fase do metabolismo, produzindo efeitos

in vivo

[30]. Por conseguinte, diferentes porções de açúcar ligados a agliconas de flavonóides poderiam influenciar a sua desglicosilação e metabolismo até um certo grau e resultar em diferenças de bioactividade [31]. No presente estudo, LU3’O-GP não induziu a apoptose em células ES-2, embora luteolina foi previamente relatado para induzir a apoptose em algumas células de cancro humano e em células de neuroblastoma de rato [32-33]. Assim, os nossos resultados também pode fornecer evidência para a variação relacionada com a glicosilação de flavonóides em actividade.

No entanto, é possível que os efeitos da glicosilação sobre a bioactividade de flavonóides

em vitr

O podem ser diferentes daqueles observados

in vivo

. glicosidos flavonóides foram relatados para mostrar as actividades semelhantes ou até mesmo maior anti-diabético, anti-inflamatória, anti-desgranulação, anti-stress, anti-alérgicos e suas agliconas de flavonóides

in vivo

[31]. No geral, é muito difícil tirar conclusões gerais a respeito do impacto da glicosilação em bioatividades flavonóides e mais pesquisas são necessárias para entender a relação entre glicosilação flavonóides e bioatividade

in vivo

e

in vitro

.

MMP-2 e MMP-9 são enzimas importantes que são consideradas importantes contribuintes para os processos de angiogénese e metástase invasiva em vários tumores [34-37]. os níveis de MMP-9 e MMP-2 de expressão são significativamente elevados em um intervalo de carcinomas [36, 38]. Por conseguinte, a inibição da MMP-2 e MMP-9 de expressão deve ser uma prioridade elevada durante a terapia do cancro. No presente estudo, as células ES-2 foram tratadas com LU3’O-GP em concentrações associadas com baixa citotoxicidade, a fim de avaliar a actividade anti-metastática deste composto, e um ensaio de apoptose foi também realizado. Estes resultados indicaram que a migração LU3’O-GP inibiu significativamente ES-2 e invasão celular e estes efeitos foram intimamente relacionada com uma expressão reprimida da MMP-2 e MMP-9 em ARNm e o nível de proteína na ausência de efeitos citotóxicos ou apoptóticas. Além disso, dado que a disseminação metastática de células de tumor é um processo em várias fases que envolve uma série de eventos fisiológicos complexos, MMP-2 e MMP-9 de expressão é regulada por uma complicada rede de vias de sinalização que pode ser activada por uma variedade de crescimento factores, citoquinas, e produtos químicos tais como PI3K /Akt, p38-MAPK, NF-kB, EGFR, ERK1 /2, e TPA, que actuam através de um número de vias, tal como a via MAPK /ERK [39-45]. Isto indica que os mecanismos subjacentes a metástase podem ser específicos para diferentes tipos de células de tumor. A inibição induzida LU3’O-GP clara de ES-2 metástase deve ser explorado em outros tipos de células tumorais.

P

.

crispus

é uma espécie amplamente utilizada em área alagada construída e deve ser colhida no momento oportuno manter remoção de poluentes eficaz e para evitar a poluição secundária e efeitos ecológicos negativos. A grande quantidade de

P

.

crispus

biomassa pode tornar os procedimentos pós-colheita desafiador. produtos naturais e fitoterápicos são promissoras fontes de novos agentes terapêuticos para o setor de saúde humana [46]. Neste estudo, flavonóides com actividade anti-metastática foram isolados a partir de

P

.

crispus

, indicando que esta espécie tinha benefícios potenciais para a saúde. Nosso estudo fornece uma base científica para o rastreamento dos recursos naturais promissoras como fontes de medicamentos e sugeriu uma abordagem potencial para a utilização eficiente e sustentável dos recursos vegetais em leitos cultivados.

Informações de Apoio

S1 Arquivo. cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) análise de dois flavonóides isolados das

P

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crispus

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Luteolina-3′-O-β-D-glucopiranósido (LU3’O-GP) (Figura a). flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP) (figura b). A HPLC utilizou uma coluna Agela C18 (simetria R 4,6 × 250 mm) com metanol e H

2O (40%: 60%) como fase móvel, a um caudal de 1 ml /min durante 40 min e utilizada . detecção UV /V

doi: 10.1371 /journal.pone.0130685.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Estamos gratos ao editor acadêmico e os clientes por seus valiosos sugestões. Queremos também agradecer aos editores profissionais de Editage para a sua edição de Inglês.