Abstract
Activina e TGF compartilhar cânceres de sinalização e de cólon SMAD podem inativar cada via sozinho ou em simultâneo. Os efeitos diferenciais da activina e TGFp sinalização no cancro do cólon não foram anteriormente dissecado. Um alvo a jusante chave da sinalização TGF é o p21 inibidor cdk2 (p21
cip1 /WAF1). Aqui, podemos avaliar efeitos específicos de activina sobre regulação p21 e funções resultantes. Nós descobrimos que o TGFp é um indutor mais potente de supressão de crescimento, enquanto que a activina é um indutor mais potente de apoptose. Além disso, a supressão do crescimento e apoptose por ambos os ligandos são dependentes SMAD4. No entanto, activina regula negativamente a proteína p21 de uma forma independente de SMAD4 em conjunto com o aumento da ubiquitinação e degradação proteossómica para melhorar a migração, enquanto TGF regula positivamente a p21 de forma SMAD4 dependente de afetar a paragem do crescimento. supressão do crescimento induzido por Activina e morte celular são dependentes de p21, enquanto a migração induzida por activina é contrariado por p21. Além disso, cancros do cólon primários mostrar diferencial expressão p21 coerente com a sua
ACVR2 /TGFBR2
status do receptor. Em resumo, nós relatamos p21 como uma activina alvo diferencialmente afetados /TGF e mediador das funções específicas de ligantes em câncer de cólon, o que pode ser explorada para o futuro estratificação de risco e intervenção terapêutica
Citation:. Bauer J, Sporn JC , Cabral J, Gomez J, Jung B (2012) Efeitos de Activina e TGF sobre p21 no cancro do cólon. PLoS ONE 7 (6): e39381. doi: 10.1371 /journal.pone.0039381
editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 21 de maio de 2012; Publicação: 26 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Bauer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Apoiado por os EUA Public Health Service DK074019 para BJ, os Institutos Nacionais de Saúde concede R01CA141057 e P30 ARRA CA060553 para BJ, as doenças digestivas UCSD Development Research Center DK080506 para BJ, eo Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center suporte concessão P30 CA060553 a BJ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Activina é um membro da superfamília de TGF-p que regula a diferenciação celular, proliferação e apoptose em muitas células epiteliais e mesenquimais [1]. Semelhante ao TGFp, activina utiliza dois tipos de receptores de superfície com intracelular Smad2, 3 e 4 para a transdução de sinal. um receptor de activina (ACVR1B) e activina receptor 2 (ACVR2) são proteínas transmembranares com actividade de ligação a ligando extracelular e actividade de cinase de serina /treonina intracelular. O ACVR2B não substituir as funções e sinalização de ACVR2 [2].
Em particular,
ACVR2
foi encontrado mutado na maioria dos cânceres colorretais com instabilidade de microssatélites de alta frequência (MSI-H) , principalmente devido a um desvio de enquadramento na um
8 trato do exão 10 [3], [4]. Restauração da sinalização de activina, a sua supressão do crescimento, a paragem do crescimento e sua indução da migração ocorrer quando
ACVR2
é complementado [5]. Nós já demonstraram alta frequência de
ACVR2
mutações em amostras de câncer de cólon MSI-H em conjunto com a perda da expressão da proteína ACVR2 [6] e mostraram que a perda ACVR2 está associada com tumores de cólon maiores e pobres grau histológico [7 ]. Ambos
ACVR2
e
TGFBR2
mutações comumente ocorrem simultaneamente em cancros MSI [6], e linhas de células também pode perder tanto TGF e activina sinalização [8]. Curiosamente, ambos os receptores são menos comumente inativado em cancros do cólon MSS, que tendem a ter um prognóstico pior do que os cancros do cólon MSI-H [9], e ambos os caminhos podem ser alvo de forma independente. Até à data, pouco se sabe sobre a nítida contribuição de sinalização de Activina ao desenvolvimento de câncer de cólon e metástase e especificamente, como TGFp e activina efeitos de sinalização diferem apesar de sinalização SMAD intracelular idênticos.
p21 (também conhecido como p21
cip1 /WAF1) é um inibidor da quinase de células de controlo de paragem do ciclo dependente de ciclina CDK1 através da inibição e 2 e é o principal regulador de múltiplas vias de supressão tumoral através tanto dependente de p53 e mecanismos independentes [10]. É um gene alvo conhecido de TGFp no cancro do cólon [11], e tem sido associada com a paragem do crescimento induzida por activina em células cancerosas plasmacytic e da mama [12], [13], mas os efeitos da activina no p21 em células de cancro do cólon, bem como consequências a jusante não foram avaliadas.
neste estudo, nós exploramos os mecanismos de TGF e activina na regulação p21 e os que se seguiram efeitos funcionais dos mesmos em cancros do cólon. Descobrimos que, apesar de sinalização SMAD intracelular idênticos, TGF e activina regular p21 através de diversos mecanismos que são funcionalmente relevantes no cancro do cólon levando a mais apoptose ou redução na supressão do crescimento dependente da activina /TGF sinalização status com p21 como um alvo diferencialmente regulado.
resultados
na Presença do SMAD4, TGF é um indutor mais potente de supressão do crescimento Enquanto activina é um indutor mais potente da apoptose
Para testar e comparar os efeitos de activina e TGF no crescimento celular, utilizou-se linhas celulares de cancro do cólon com diferentes status de SMAD4 como descrito em outros lugares [22], [23], além de SMAD4 knockdown. O
ACVR2
/
TGFBR2 /SMAD4
tipo selvagem microssatélites cólon estável linha de células de câncer de FET e
ACVR2 /TGFBR2
tipo selvagem /
SMAD4
-null SW480 células cancerosas do cólon foram tratados com activina ou TGFp e o crescimento celular foi avaliado. Como um controle adicional, SMAD4 foi derrubado através de siRNA em células FET que foram tratados e analisados em conformidade. Enquanto tanto a activina e TGFp tratamento conduziu a uma supressão significativa do crescimento em
SMAD4
FET do tipo selvagem, o efeito foi mais pronunciada após tratamento com TGFp. Em contraste, nem ligando foi supressor do crescimento na ausência de SMAD4 em
ACVR2 /TGFBR2
tipo selvagem /
SMAD4
células cancerígenas do cólon SW480 -null ou seguintes SMAD4 knockdown no
SMAD4
tipo selvagem células FET (Figura 1A).
A) Depois de
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
tipo -wild FET, as células FET seguinte transitória knockdown SMAD4, e
ACVR2 /TGFBR2
-wild tipo /
SMAD4
células SW480 -null foram tratados com veículo (controle), activina ou TGF-p durante 24 horas, a actividade metabólica através do ensaio de MTT-crescimento foi avaliada. supressão do crescimento ocorreu apenas na presença de SMAD4 seguinte tanto a activina e tratamento TGFp (*** p 0,001). Além disso, o TGF-p levou a um aumento significativo na supressão do crescimento em comparação com activina (*** p 0,001). B) Para determinar a taxa de apoptose, um ensaio de TUNEL foi realizada em
SMAD4
tipo -wild FET,
SMAD4
-kd FET, e
SMAD4
células SW480 -null tratados com veículo de controlo (C), activina (A), ou TGF-p (t). A apoptose foi determinada por TUNEL-rotulagem de corpos apoptóticos. C) A normalização [% apoptótica corpos /núcleos] revelou que activin- e apoptose induzida por TGF ocorreu predominantemente em
SMAD4
tipo -wild FET e não no
SMAD4
-kd FET ou
SMAD4
SW480 -null células cancerígenas do cólon. Nas células que expressam SMAD4, activina apoptose induzida a um grau maior do que o TGF-p (* p 0,05). D) Os fragmentos de DNA intracelulares marcadas com BrdU, indicativo de apoptose, foram determinados 24 horas após a activina ou tratamento TGF da
SMAD4
tipo -wild células cancerosas FET cólon, células FET com KD p21, células FET com SMAD4 KD e
SMAD4
células cancerígenas do cólon SW480 -null. Aumento da fragmentação do ADN foi observada após tratamento activina e TGFp apenas nas células do tipo selvagem SMAD4, com a activina indução de fragmentação mais em comparação com o TGF-p. Na presença de SMAD4, p21KD conduzir a um aumento na apoptose basal, mas a vantagem de tratamento de activina para qualquer indução de apoptose. SMAD4 knockdown resultou na perda de apoptose em células FET semelhante aos efeitos observados no
SMAD4
células SW480 -null (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)
. indução de apoptose
, em seguida, comparados de qualquer ligando na presença e ausência de SMAD4 ou p21. Activina apoptose induzida a um grau maior do que o TGF-p, e a apoptose ocorreu apenas na presença de SMAD4 (Figura 1B, C). dependência /p21 SMAD4 foi confirmada por um ensaio de apoptose alternativa determinar-BrdU rotulagem dos fragmentos de ADN intracelular. A apoptose foi aumentada após o tratamento a activina e TGFp em células positivas SMAD4 FET, com a activina induzir um maior grau de apoptose. Não foi observada a indução da apoptose quer com o ligando em
SMAD4
células SW480 -null ou células FET seguintes SMAD4 knockdown paralelo as experiências TUNEL (Figura 1B, C). p21 knockdown no
SMAD4
células FET tipo selvagem resultou na perda de indução de apoptose (Figura 1D).
Em conclusão, estes dados sugerem que, embora activina e TGF compartilhar sinalização SMAD intracelular, cada favorece distinta efeitos fisiológicos a jusante em doses consistentes. Além disso, mostra-se que tanto a supressão do crescimento e apoptose induzida por ambos os ligandos estão SMAD4-dependente.
Activina Regula p21 nucleares, de forma independente
-SMAD4
Um dos genes alvo de crescimento conhecidos supressora de TGFp é p21, que é regulada positivamente após tratamento com o TGF-p em células de cancro do cólon FET [11]. O efeito da activina em p21 no cancro do cólon não foi avaliado. Para analisar os efeitos a jusante da sinalização activina SMAD4-dependente, determinou-se a expressão da p21 após o tratamento activina em relação ao tratamento TGF. Ao contrário do que os efeitos de TGF-p previamente conhecidos no p21, encontramos nenhum aumento na transativação p21 e apenas um modesto aumento na transcrição após o tratamento activina na presença de SMAD4, enquanto TGF acentuadamente induzida tanto transativação específicos de p21 e transcrição quando SMAD4 estava presente (Figura 2A). No que respeita à expressão da proteína p21, verificou-se que em contraste com o TGF-p, o tratamento com activina diminuiu p21 total e nuclear, independentemente da presença de SMAD4, enquanto p21 citosólica permaneceu relativamente constante (Figura 2B). Continuar a analisar a regulação da proteína p21 por activina, foi realizado um curso de tempo mostrando que depois de uma ligeira regulação positiva inicial, a proteína p21 é regulada negativamente por 24 horas após o tratamento activina (Figura 2C, duas pistas certas adjacentes).
A )
SMAD4
tipo -wild FET e
SMAD4
células cancerígenas do cólon SW480 -null foram tratados com veículo (controle), activina ou TGF por 24 horas. transactivação específica-p21 foi determinada utilizando um ensaio da luciferase dupla com pWWP-Luc e pRL-TK (painel da esquerda) e os níveis de expressão de ARNm de p21 foram quantificados por qPCR e normalizada para L19 (painel da direita). Embora o TGF-p tanto transactivação induzida marcadamente específicos de P21 e de transcrição na presença de SMAD4, nenhum aumento na transactivação de p21 e só um modesto aumento na transcrição a seguir ao tratamento de activina na presença de SMAD4 foram encontrados (* p 0,05). B)
SMAD4
tipo -wild FET e
SMAD4
células SW480 -null foram tratados com veículo de controlo (C), activina (A), o TGF-p (t), ou uma combinação de ambos os ligandos (a + T) durante 24 horas antes da lise para proteína total, nuclear, citoplasmática e da preparação. Histona H3, α-tubulina, e GAPDH foram utilizados como controlos de carga para as respectivas fracções. Embora o TGF-p aumentou marcadamente os níveis de p21 em todos os três fracções na linha celular positiva SMAD4 única, activina induziu uma diminuição da proteína p21 nuclear e total nas células SMAD4 positivos e negativos (painel da esquerda). A análise densitométrica de todos os borrões revelaram alterações estatisticamente significativas nos níveis de p21 (painel direito) (ns = não significativo, * p 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001). C) regulação positiva inicial da proteína p21 é seguido por regulação negativa por 24 h após o tratamento activina.
SMAD4
células FET do tipo -wild foram tratados com activina ou veículo (controlo) e colhidas em vários pontos de tempo para a quantificação da expressão da proteína p21. GAPDH foi usada como controlo de carregamento e expressão relativa foi calculada por meio de densitometria. D) Enquanto regulação positiva induzida por TGF de p21 foi SMAD4 dependente, downregulation induzida por activina de p21 foi ainda observada na ausência de SMAD4.
SMAD4
células FET do tipo -wild foram tratados com veículo (CNT), activina ou TGF-p na presença de qualquer precipitação foram determinadas siRNA (SC) ou SMAD4 siRNA (KD) e os níveis totais de p21. GAPDH foi utilizado como carga e ligado celular C32 como controle positivo p21.
Para confirmar que os efeitos do ligando no p21 estavam directamente dependentes SMAD4, nós derrubado SMAD4 em
SMAD4
selvagem digite células cancerígenas do cólon FET usando siRNA. Descobrimos que a expressão da linha de base de p21 em células FET diminuiu com SMAD4 knockdown (Figura 2D, faixa 3), o que comprova a importância da via SMAD4 para a manutenção de níveis elevados de p21 nesta linha de células [11]. Consistentemente, a regulação positiva induzida por TGF de p21 foi suprimida a perda de SMAD4 (Figura 2D, pista 7). Como esperado, a regulação negativa de p21 por activina não foi afectada pela ausência de SMAD4 (Figura 2D, faixa 5), o que é consistente com a análise de transferência de Western dos níveis de p21 no FET e células SW480 (Figura 2B), mostrando a regulação negativa da p21 no linha celular positiva e negativa SMAD4. Assim, a sinalização SMAD4 parece ser necessário para os processos que dependem de alta expressão de p21, mas dispensável para processos associados com baixa ou diminuição dos níveis de p21.
induzida pela Activina supressão do crescimento é dependente de p21 Expression, e SMAD4 /p21 Sinalização pode neutralizar induzida pela activina independente de SMAD4 Migração
em seguida, buscou-se determinar o papel funcional do p21 na supressão do crescimento induzido por activina e viabilidade celular. Nós descobrimos que a perda de p21 por meio de siRNA knockdown resultou na abolição da supressão do crescimento induzida por activina em
SMAD4-
células do tipo selvagem, indicando que /supressão do crescimento induzida por SMAD4 activina é dependente de p21 (Figura 3A). Além disso, a perda de p21 não só levou a ab-rogação da morte celular induzida por activina, mas também para um aumento no número de células, sugerindo um benefício de sobrevivência com a perda de p21 (Figura 3B). Essas observações ressaltam a importância do eixo /p21 SMAD4 na supressão do crescimento mediada por activina e morte celular. Células FET
A) foram tratados com corrida (SC) ou p21 siRNA específico (KD). supressão do crescimento foi avaliada pelo ensaio de MTT-metabólica após o tratamento com activina. Activina induzida a inibição do crescimento celular na presença de p21, mas o efeito foi revertido na ausência de p21 (* p 0,05). B) viabilidade total é diminuída em SMAD4 tipo selvagem cancros do cólon após tratamento com activina na presença de p21. células FET foram tratados com corrida ou siRNA específico p21. A viabilidade celular foi avaliada por coloração com azul de tripano após o tratamento com activina. Tripano azul células positivas após o tratamento activina foram diminuídos em presença de p21, mas aumentou depois knockdown p21 (*** p 0,001). C) Activina (A) induz a migração celular em linhas celulares SMAD4-positiva e SMAD4-negativas. migração celular é induzida em
SMAD
células FET tipo 4-selvagens e
SMAD4
células SW480 -null após o tratamento activina, mas indução mais pronunciada da migração é visto na ausência de SMAD4. A perda de p21 conduz a um aumento da migração da linha de base em células que expressam SMAD4 (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). D) p21 knockdown aumenta o efeito pró-migratória global de activina em células FET. A perda de p21 na ausência de SMAD4 faz aumentar ainda mais a indução migratório (* p 0,05, ** p 0,01)
Assim sendo, testou-se o papel da p21 na migração induzida por-activina. avaliação da mobilidade celular, na presença e ausência de SMAD4. Verificou-se que a activina migração acrescida em células negativas e positivas SMAD4 SMAD4 (Figura 3C), a qual defende um SMAD4 via independente migração regulação. Esta informação é apoiada por descobertas semelhantes na sinalização TGF para o qual foi mostrado um efeito pró-migratória e SMAD4-forte e independente [20], [22]. Como o tratamento com activina foi associada com um decréscimo nos níveis de p21, assim um aumento da migração, espera-se que a perda de p21 por knockdown iria aumentar a migração da linha de base, bem como a migração após activina tratamento em SMAD4 células intactas, se o p21 remanescente foi pelo menos parcialmente envolvidos na luta contra a migração induzida por activina. Consistente com esta hipótese, que mostram um aumento da taxa de migração de células basais em SMAD4 seguintes knockdown p21 (Figura 3C), bem como migração global mais pronunciada após tratamento activina (Figura 3D). Expressando
Descobrimos ainda que basocelular migração foi reforçada por tratamento activina na ausência de qualquer ou p21 em células SMAD4 FET SMAD4-positivas, mas que knockdown de p21 não teve qualquer efeito adicional sobre a migração quando SMAD4 estava ausente, como em células SW480 (Figura 3D). Para o TGF-p, verificou-se que a migração celular foi aumentada, independentemente da presença de p21 (Figura 2B, Figura S1D). Isto suporta mais uma vez que os efeitos mediados por p21 a seguir ao tratamento de activina são dependentes SMAD4 e que actua a jusante de p21 de SMAD4 para os seus efeitos anti-proliferativas e anti-migratórias (Figura 4). Além disso, isto sugere que, no caso do TGFp, alguns sinais promigratory pode ignorar SMAD4 como previamente postulada [22] contornar p21 e os seus efeitos inibidores. Em resumo, deduzimos que p21 pode contrariar a migração a jusante da SMAD4 e que a regulação negativa da p21 pode ser responsável por alguns dos potenciais pró-migratória de sinalização activina. Assim, a regulação diferencial da p21 pode estar no centro de efeitos funcionais distintas de activina e TGF.
Activina tratamento conduz a Ubiquitination de p21 e inibição do proteassoma Extingue induzida pela Activina p21 Downregulation
Para dissecar ainda mais o mecanismo de diminuição da proteína p21 mediada por activina, avaliou p21 ubiquitination após o tratamento activina e sua dependência do proteassoma (Figura 5A, B). Para isso, foram comparados p21 ubiquitination seguinte activina e tratamento TGF. Em contraste com o TGF-p, o tratamento induziu a activina polyubiquitination p21 (Figura 5A). O tratamento com MG-132 inibidor de proteossoma revogada diminuição proteína p21 induzida por activina, (Figura 5B), invocando a degradação mediada por ubiquitina proteossoma na regulação negativa de p21 induzida por activina. Este é semelhante a degradação da proteína p21 induzida por UV [24], mas distinta da degradação basal p21 proteossómica [25], que não emprega ubiquitination.
A)
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
As células foram FET do tipo -wild foram pré-tratados durante 30 minutos com inibidor de proteossoma MG-132 e, em seguida, tratados com veículo (controle), a activina, o TGF-p durante 24 horas e ubiquitinação de p21 global foi avaliada por meio de imunoprecipitação da p21 e do mata-borrão com um específico da ubiquitina- de anticorpos (painel superior) e reblotting de p21. Várias bandas indicativas de polyubiquitination foram observadas somente após o tratamento activina. B) induzida pela Activina downregulation p21 é dependente do proteassoma.
SMAD4
células FET do tipo -wild foram pré-tratados durante 30 minutos com inibidor de proteossoma MG-132 seguido de tratamento com veículo (controle) ou activina durante 24 horas e em comparação com as células tratadas em conformidade, sem inibição proteossoma. a expressão da p21 foi avaliada e mostrou inibição da regulação baixa p21 após o tratamento activina em conjunto com a inibição proteossómica.
p21 nuclear é perdida em um subgrupo de cancros do cólon primários com Intact
ACVR2
em seguida, avaliou se activina prejudicada /TGF sinalização afetados localização p21 em cancros do cólon primários. Determinou-se a presença contra a perda de expressão de p21 nuclear em 56 amostras de cancro de cólon primário de vários subtipos genómicos, e estes dados correlacionada com a activina e estado do receptor de TGFp (Tabela 1). Descobrimos que uma grande subconjunto de cancros do cólon mostraram perda de p21 nuclear, e que esta perda foi associada com a preservação da ACVR2 (Tabela 1 e Figura 6), sugerindo diminuição sinalização através do eixo /p21 SMAD4, mas activina intacta sinalização SMAD4-independente . O oposto foi o caso de TGFBR2: Preservação da TGFBR2 foi associada a p21 nuclear persistente (Tabela 1). Estes dados são consistentes com a nossa
in vitro
conclusões de regulação positiva TGF /SMAD4 dependente de p21 e activina /não-SMAD4 dependente de regulação negativa da p21.
Cinquenta e seis cancros do cólon foram coradas para ACVR2, TGFBR2 e p21. Exemplos representativos para coloração p21 são mostrados: tecido do cólon normal com coloração nuclear (painel esquerdo), amostra de cancro do cólon com coloração p21 nuclear mantido (painel do meio), e amostra de cancro do cólon com perda de coloração p21 nuclear (painel direito)
.
Discussão
em cancros do cólon MSI-H, tanto TGF e sinalização activina são revogados devido a mutações frameshift no receptor de tipo II [26]. A perda de ambas estas vias de sinalização pode ser benéfico e aditivo para o crescimento de tumores [20], [27], mas o efeito sobre a migração diferencial permanece obscura. TGFp e activina utilizar as mesmas proteínas intracelulares (SMAD Smad2 /3 e SMAD4) para transmitir o seu sinal. Ambos os caminhos específicos ligando são comumente inativado em cancros do cólon MSI-H, para o qual observamos anteriormente superior a 50% de sobreposição entre o
ACVR2
e
TGFBR2
mutações [6]. Curiosamente, eles são menos comumente inativado em cancros do cólon MSS, que tendem a ter um prognóstico pior do que os cancros do cólon MSI-H [9], e ambos os caminhos podem ser alvo de forma independente. Aqui mostramos que enquanto activina e TGF-p tanto pode induzir a supressão do crescimento e apoptose em diversos graus, que também aumentam a migração, partilhando assim em supressor de tumor, bem como propriedades de promoção do cancro. Ajuste fino destes efeitos opostos, bem como regulação diferencial de TGF contra sinalização activina é provável um processo importante na carcinogênese influenciar o destino das células cancerosas. Este artigo explora os efeitos diferenciais e regulação da activina e TGF sinalização em câncer de cólon.
Aqui nós mostramos que, em células cancerígenas do cólon, apesar de sinalização idêntica a jusante SMAD, activina e TGF têm efeitos opostos sobre a p21 inibidor cdk2 resultante em regulamentos distintos de cada via. Enquanto TGF tem um efeito-se-regulação forte em p21, a sinalização activina leva a um ligeiro decréscimo nos níveis de proteína p21. Curiosamente, ambos os ligandos de induzir a supressão do crescimento celular e a morte celular mediada por p21 SMAD4-dependente, ainda TGFp parece ser um indutor mais potente de supressão de crescimento, enquanto activina, por outro lado é um indutor mais potente de apoptose. Como descrito anteriormente, tanto o TGF-p aumentar a activina e a migração de células [20], [22]. Notavelmente, que agora mostram que efeito pró-migratória da activina é regulado de forma SMAD4-independente e descrevem pela primeira vez, um aumento concomitante ubiquitination p21 e degradação proteossómica. Por conseguinte, enquanto a supressão do crescimento induzida por activina é dependente de p21, a migração induzida por activina é acompanhada por níveis reduzidos p21 e independentes de SMAD4. Embora seja sabido que a degradação da proteína p21 induzida por UV é ubiquitinin-dependente [24], basal degradação de p21 através do proteassoma não é [25]. Dados recentes implica ERK2 na mediação nuclear com a troca de citosólica e consequente degradação mediada por ubiquitinin de p21 [28]. Uma variedade de ubiquitina ligases para incluir ecto e Smurf-1 têm sido encontrados para atingir tanto TGFp-dependente e independente sinalização SMAD [29]. A ubiquitina ligase específico responsável pela ubiquitinação p21 mediada por activina não foi determinada a data.
Aumento ou diminuição dos níveis de p21 poderia dirigir uma célula para a ativação preferencial de qualquer via de sinalização da SMAD4-dependente ou independente e vice -versa, modulando assim a resposta celular global. Conclusivamente, p21 parece ser um jogador importante para a regulação diferencial das vias SMAD4-dependentes e independentes controlados por activina e TGF (Figura 4).
Na verdade, parece que tanto a activina e TGF SMAD e não sinalização SMAD ocorrem simultaneamente e que o efeito líquido é uma sequência da dominância dependente do contexto relativa de um dado ligando e /ou via. regulação diferencial da p21 pode ser um importante mecanismo de controle e sinalização preferencial afinar dependente ou independente da SMAD com potencial relevância prognóstica. Perda de sinalização SMAD tem sido associado com o aumento da migração e perda de supressão do crescimento de cancro do cólon [22], e que agora mostrar um possível mecanismo no cancro do cólon, através da qual a sinalização SMAD podem ser derivados por meio de sinalização activina preferencial, apresentar uma explicação para o PRO efeitos -migratory e pró-proliferativa que acompanham a sinalização SMAD perdido.
p21 desempenha um papel complexo no câncer. Tumor propriedades supressivas de p21 tenha sido descrito no contexto de induo da paragem do crescimento, a diferenciação e a senescência e estudos em diferentes tipos de cancro revelou que a expressão da p21 correlaciona-se com um diagnóstico favorável [10]. Consistente com a conclusão acima, vários estudos em câncer de cólon revelou uma associação entre a regulação baixa p21 e metástases, bem como pobres sobrevivência [30], [31], [32] [33], no entanto, alguns relatos apontam para um papel duplo em vários cancros com aumento de p21 correlacionando-se com mau prognóstico [34], [35].
Aqui, nós relatamos um número substancial de cânceres de cólon primários com a perda de p21 nuclear, que se correlaciona com presença de ACVR2 e ausência de TGFBR2 . Isto está em linha com a nossa
in vitro
dados onde mostramos regulação negativa da p21 no contexto da sinalização independente de SMAD4 reforçada induzida por activina. Também é consistente com o conceito de uma regulação positiva ausente de p21 após a anulação do eixo de TGFp /SMAD4, o que pode ser explicado por knockdown de SMAD4, como nas nossas experiências, mas também por ausência de TGFBR2, como pode ser visto nas amostras cancerosas. As consequências funcionais que seria de esperar de diminuição dos níveis de p21 em conjunto com a preservação do ACVR2 e perda de TGFBR2 base nos nossos dados são reforçadas migração via de sinalização SMAD4-independente e perda de supressão de crescimento através da SMAD4 eixo TGF //p21. Independente do efeito sobre a supressão do crescimento, que por si só foi encontrado para ser um marcador de prognóstico fraco em muitos cancros [36], o estado do receptor ACVR2 + /TGFBR2- associada com a perda de pontos de p21 nucleares para um cancro da pró-metastático e, portanto, mais agressiva fenótipo. Isto é consistente com descobertas anteriores que mostram que a perda de p21 está associada a pior evolução em vários tipos de câncer [10]. Enquanto outras vias de sinalização pode dirigir localização p21, nossos dados estabelecer a base para uma avaliação mais aprofundada da activina e status do receptor de TGFp em associação com a localização de p21 para a previsão de resultados e resposta terapêutica no cancro do cólon.
Em resumo, o nosso dados mostram que o TGF-p é um indutor mais potente de supressão de crescimento, enquanto a activina é um indutor mais potente de apoptose. Além disso, a supressão do crescimento e apoptose por ambos os ligandos são dependentes SMAD4 e p21. No entanto, activina regula negativamente a proteína p21 nuclear total e de uma forma SMAD4 independente em conjunto com o aumento da ubiquitinação e degradação proteossómica associado com a migração aumentada. TGFp por outro lado upregulates nuclear p21 de um modo dependente-SMAD4 de afectar a paragem do crescimento e pode desvio de p21 para afectar a migração. Além disso, cancros do cólon primários mostrar diferencial expressão p21 coerente com a sua
ACVR2 /TGFBR2
status do receptor. Conclusivamente, relatamos p21 como uma activina alvo diferencialmente afetados /TGF e mediador das funções específicas de ligantes em câncer de cólon, o que pode ser explorada para o futuro estratificação de risco e intervenção terapêutica.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade de hospitais Carolina do Norte. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para a recolha de amostras no âmbito da aprovação IRB sob conduzida North Carolina Estudo Câncer Colorretal (NCCCS) como relacionado abaixo. O estudo foi aprovado pela Universidade Northwestern Institutional Review Board (IRB # STU00020989). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.
Amostras de Pacientes
Tumores de cólon foram coletados prospectivamente em fase de aprovação IRB como parte do Estudo de Câncer Colorretal Carolina do Norte (NCCCS), uma base populacional, caso -control estudo compreendendo 503 pacientes [14], [15]. Para este estudo, 15 amostras de pacientes com um amplo tumor e tecido normal foram seleccionados aleatoriamente. Para verificação, foram coletadas um adicional de 41 consecutivos espécimes câncer colorretal da Universidade Northwestern, em fase de aprovação IRB institucional (IRB # STU00020989) (Tabela S1). Todos os tumores eram, embebidos em parafina e corte fixado em formol com 5 mm de.
linhas celulares de cancro do cólon
células SW480 (ATCC, Manassas, VA) foram mantidas em Iscove da Dulbecco Modificado de e FET células (presente generoso de Michael Brattain, University of Nebraska, Omaha, NE [16]) em meio F12 /meio de Eagle modificação de Dulbecco (ambos da Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com soro de bovino fetal a 10% e penicilina G [100 U /ml] /estreptomicina [100 ug /ml] (Invitrogen). As células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO
2. Todas as células foram privadas de soro durante 24 horas antes da experimentação para a sincronização do ciclo celular aproximada. As células foram testadas para a infecção por micoplasma usando o PCR Mycoplasma Set Detection (Takara, Otsu, Japão) e autenticado pelo perfil STR usando o PowerPlex 1.2 System (Promega, Madison, WI).
Anticorpos e reagentes
Activina a foi reconstituído em PBS, TGF-p1 em HCl 4 mm, de acordo com as instruções do fabricante (ambos R D, Minneapolis, MN) e usadas em concentrações finais de 25 ng /ml e 10 ng /ml, como descrito anteriormente [17], [18], [19], [20]. MG-132 (Calchemie, Darmstadt, Alemanha) foi utilizado para a inibição do proteassoma. Para as análises de imuno-histoquímica, foi utilizado um anticorpo policlonal de cabra contra ACVR2 (01:50) (ab10595, Abcam, Cambridge, MA), bem como anticorpos monoclonais de ratinho contra TGFBR2 (01:50) (ab78419, Abcam) e p21 (1: 150) (sc-817, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para Western blot, p21 (# sc-469) (1:250) (Santa Cruz, Biotechnology), α-tubulina (# 3873), histona H3 (# 9715) (ambos Cell Signaling Technology, Danvers, MA), e GAPDH