Sumário

expressão aberrante de miR-196a tem sido frequentemente relatados em diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas. No entanto, a sua função no câncer de pâncreas ainda não foi completamente elucidado. Aqui, nós investigamos o padrão de expressão e o papel biológico do miR-196a em linhas celulares de cancro do pâncreas, bem como a sua interacção com um gene relacionado com a metástase, factor alfa-kappa-B-inibidor nuclear (NFKBIA). Nós demonstramos que o miR-196a foi regulado para cima em linhas celulares de cancro pancreático humano em comparação com as células epiteliais do ducto pancreático imortalizadas por meio de micro-arranjo e microARNs qRT-PCR. Além disso, a sub-regulação de miR-196a em PANC-1 suprimiu a sua proliferação e migração com um aumento em L

0 /L

1 transição e a diminuição da expressão da Ciclina D1 e CDK4 /6. Enquanto isso, um aumento na expressão de E-caderina e a diminuição da expressão de N-caderina e vimentina foram também observados. Foram identificados um alvo miR-196a romance, NFKBIA, e a sub-regulação de miR-196a aumentaram a expressão de proteína NFKBIA. ensaio de luciferase confirmou que NFKBIA era um alvo direto e específico de miR-196a. Silenciamento NFKBIA em células PANC-1 aumentou a sua proliferação e migração. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que o miR-196a é altamente expresso em linhas celulares de cancro do pâncreas, e pode desempenhar um papel fundamental na proliferação e migração do cancro do pâncreas, possivelmente através do seu alvo a jusante, NFKBIA. Assim, miR-196a pode servir como um potencial alvo terapêutico para câncer de pâncreas

Citation:. Huang F, Tang J, Zhuang X, Y Zhuang, Cheng W, Chen W, et al. (2014) miR-196a Promove cancro do pâncreas Progressão por Segmentação Nuclear Factor de Kappa-B-Inhibitor Alpha. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10.1371 /journal.pone.0087897

editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de agosto de 2013; Aceito: 03 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (30973505), de Ciência e Tecnologia Fundação da Província de Guangdong (2009B030801005), a Fundação de Guangzhou Secretaria de Ciência e Tecnologia (2009Y-C011-1) e da Fundação de Ministério da educação da China (20120171110075) para H. Yao. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma neoplasia agressiva com um dos piores resultados entre todos os cânceres. Para todas as fases combinadas, a taxa de sobrevivência relativa de 5 anos é de apenas 5% [1]. A elevada taxa de mortalidade de cancro pancreático pode ser em parte devido à capacidade das células de cancro do pâncreas a adquirir características invasivas durante as fases iniciais da carcinogénese. Assim, é provável que, mesmo no estágio de uma doença localizada, aparentemente, micrometástases podem já estar presentes em locais distantes de órgãos [2]. A quimioterapia convencional raramente é curativa para câncer pancreático metastático. As estratégias de tratamento que especificamente e prevenir metástases pode, portanto, têm o potencial de melhorar significativamente o prognóstico da doença sombrio.

Estudos recentes têm mostrado que microRNAs (miRNAs) desempenham um papel crítico na regulação de vários biológica e patológica processos, incluindo metástase [3]. Estas moléculas pequenas, não codificadoras exercem os seus efeitos através da ligação de regulação para a região não traduzida 3 ‘do ARNm alvo, fazendo com que qualquer degradação do mRNA ou a inibição da sua tradução para proteínas funcionais. A expressão de RNAs tem sido reconhecida como componentes integrais de muitos processos biológicos que envolvem a proliferação de células normais, a diferenciação, a apoptose, e resistência à tensão [4]. Mais importante, foi sugerido recentemente que a regulação positiva ou a regulação negativa aberrante de miARNs específicos e os seus alvos em vários tipos de cancro está associada com o desenvolvimento e progressão do cancro [5]. A expressão aberrante de alguns RNAs tem sido mostrado para ser envolvidos na carcinogénese do cancro do pâncreas [6], [7]. Além disso, o miR-196a foi encontrado para ser sobre-expresso em cancro do pâncreas, e significativamente correlacionada com a taxa baixa de sobrevivência [8]. No entanto, o mecanismo da sua função no cancro pancreático permanece obscura.

O factor nuclear kB (NF-kB) desempenha um papel significativo na regulação da resposta imune [9] e a inflamação [10]. Ele compreende uma família de factores de transcrição envolvidos na regulação de uma grande variedade de processos biológicos, e as evidências crescentes demonstrado o seu envolvimento na tumorigénese [11] – [14]. Ele tem sido implicada em muitos indicativos do desenvolvimento e progressão do cancro, incluindo a proliferação de crescimento independente de factor de [15], a inibição da apoptose [16], e a invasão de tecidos e metástases [17]. Além disso, provas emergentes de que implicam activação de NF-kB desempenha um papel importante na progressão do cancro pancreático [11], [18] – [20]. Inibição de NF-kB sensibiliza as células cancerígenas pancreáticas humanas à apoptose [21]. NFKBIA, também conhecido como IκBα, é um dos membros da família de proteínas celulares que inibem o factor de transcrição NF-kB. NFKBIA inibe a NF-kB por mascarar os sinais de localização nuclear (NLS) de proteína de NF-kB e mantê-lo retido num estado inactivo no citoplasma [22]. Além disso, NFKBIA bloqueia a capacidade de NF-kB para se ligar ao ADN, o que é essencial para a função de NF-kB [23]. Tem sido demonstrado que há um enriquecimento de polimorfismos específicos de nucleotídeo único e de haplótipos NFKBIA no linfoma de Hodgkin, cancro colo-rectal e do mieloma múltiplo, sugere que NFKBIA pode ser um supressor tumoral [24] – [26].

neste estudo, demonstrámos que o miR-196a é sobre-expresso em linhas celulares de cancro do pâncreas e investigaram o efeito da sub-regulação de miR-196a em uma linha de células de cancro do pâncreas, PANC-1. Temos elucidado que NFKBIA é alvo de miR196a e miR-196a desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro pancreático provavelmente, visando NFKBIA.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Quatro linhas celulares de cancro pancreático humano PANC-1, Capan-2, BxPC-3 e SW1990 foram adquiridos a partir da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e uma linha ductal pancreático imortalizado células epiteliais H6C7 foi gentilmente fornecida pelo Prof. Ming-som Tsao (Ontario Cancer Institute, Universidade de Toronto, Canadá), e incubou-se neste estudo como relatado anteriormente [27]. Quatro linhas celulares de cancro pancreático humano (Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, PR China) foram cultivadas em DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone, Logan, UT), 100 une /ml penicilina G, e 100 ug /ml de estreptomicina. H6C7, obtido a partir de Prof.Ming-som Tsao do Ontario Cancer Institute (Ontário, Canadá), foi cultivada a 37 ° C em meio isento de soro de queratinócitos (K-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 100 U /ml penicilina, 100 U /ml de estreptomicina, 0,2 ng /ml de factor de crescimento endotelial recombinante (RegF) e 20 ng /ml de pituitária de bovino Extracto (BPE). Em todas as experiências, as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 com atmosfera de ar.

GeneChip Microarray de miARNs

O perfil de expressão do gene de miARN quatro cancro pancreático humano linhas celulares e H6C7 foi determinada por análise de microarray GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Síntese de ADNc, hibridação com fichas, e lavagens foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. GeneChips foram feitos a varredura em densidade de 3 mm, com um GeneArray Scanner (Affymetrix). As imagens foram inspecionados para garantir que todos os chips tinha baixa de fundo, mas sinais de hibridação brilhantes. A média de intensidade do sinal de fluorescência para cada sonda foi quartil normalizado. A média dos três sinais médios para cada sonda miRNA foi normalizada para que, por um oligonucleotídeo controle adicionado e foi log

2 transformada. Cada sonda de miARN foi avaliada para a expressão com base em um teste de Wilcoxon Rank-Sum dos sinais de conjunto de sonda de miARN em comparação com a distribuição de sinais a partir do fundo. O Student

t

-test foi utilizado para determinar diferenças significativas na expressão de miRNA entre linhagem humana pâncreas célula cancerosa ea linha ductal pancreático imortalizado células epiteliais H6C7, onde

P Art 0,05 foi interpretado como significativa.

quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR)

Para analisar a expressão de miR-196a, qRT-PCR foi realizado em quatro linhas celulares de cancro pancreático humano (PANC- 1, Capan-2, BxPC-3 e SW1990) e uma linha ductal pancreático imortalizado células epiteliais H6C7. Resumidamente, o ARN total foi extraído das células utilizando TRIZOL (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. U6 foi validado como normalizador. O ARN total foi transcrito reversamente utilizando o iniciador de RT correspondente e o Kit de Transcrição Reversa TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O iniciador de PCR para madura miR-196a foi concebida como se segue: sentido miR-196a, 5′-TCG CTG TCG TGT CTT CCG CAC TCC C-3 ‘, reverso, 5’-TGC AGC CCC ACA GCC CCC GTC CCT C-3 ‘. A expressão de miR-196a e sua U6 controle foram detectadas utilizando sistema de ensaio TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A transfecção de PANC-1 células

Dois pares de sintéticos, quimicamente modificados os oligonucleótidos de ARN de simples ou de cadeia dupla curtas: anti-miR-196a e o seu controlo negativo apropriado (anti-miR-NC), micmics miR-196.º e o seu controlo negativo apropriado (miR-NC) foram adquiridos a GenePharma (Xangai, China). NFKBIA-siRNA (si-NFKBIA) eo seu controlo negativo apropriado (si-NC) foram adquiridos de GeneChem (Shanghai, P. R. China). A transfecção foi realizada pelo reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para a transfecção, 2 × 10

5 células PANC-1 foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços e incubadas durante a noite. Os níveis de expressão foram quantificadas 24 h após a transfecção.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi detectado por WST-8 método. Anti-miR-196atransfected células PANC-1 e células anti-miR-NCtransfected PANC-1 foram colhidas e dissocia-se em suspensão de célula única, 1,2 × 10

3 células foram semeadas em placa de 96 poços por poço. Além disso, si-NFKBIA transfectadas células PANC-1, si-NC transfectadas PANC-1 células, si-NFKBIA + anti-miR-196a transfectadas células PANC-1 e + células si-NC anti-NC PANC-1 foram colhidas e dissociada em suspensão de célula única, 2 × 10

3 células foram semeadas em placa de 96 poços por poço. A proliferação celular foi analisada em diferentes horas (24 h, 48 h, 72 h). WST-8 de reagentes (10 uL por poço) de células de contagem Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) foi adicionado, incubado durante 4 h, e a absorvância foi determinada com um espectrofotómetro com múltiplas cavidades (BioTek, VT, EUA) a 450 nm e 630 nm.

a migração celular ensaio

ensaio de migração celular foi levada a cabo usando Transwell câmara (Corning, Nova Iorque, EUA) com tamanho de poro de 8,0 uM. 72 h após a transfecção, o total de 10

5 as células foram ressuspensas em meio isento de soro e semeadas no compartimento superior da câmara. O compartimento inferior foi carregada com meios de cultura completos contendo 10% de FBS. Depois de ter sido incubada a 37 ° C durante 8 horas, a câmara foi fixado, 0,1% de violeta de cristal-coradas e contadas.

análise de citometria de fluxo

Para detectar o efeito da sub-regulação de miR -196 no ciclo celular e apoptose, citometria de fluxo foi realizada. Para a análise do ciclo celular, anti-miR-196a-transfectadas PANC-1cells foram colhidas em diferentes horas (24 h, 48 h, 72 h) após a transfecção, e foram tripsinizadas e fixo com gelo frio de 70% de etanol durante 18 h a 4 ° C. As células fixadas foram coradas com 50 mg /mL de iodeto de propídio (BD Pharmingen, San Diego, CA) e 50 mg /ml de RNase e em seguida analisadas utilizando um citómetro de fluxo (BD Pharmingen, San Diego, CA). Para a análise da apoptose, anti-miR-196a-transfectadas PANC-1cells também foram colhidas em diferentes horas (24 h, 48 h, 72 h) após a transfecção, coradas com FITC-anexina V e iodeto de propídio (PI) e, em seguida, analisadas através de um citometria de fluxo (BD Pharmingen, San Diego, CA). Anti-miR-NC-transfectadas PANC-1cells foram realizados como controle.

Imunofluorescência análise

Para investigar as alterações fenotípicas de PANC-1 transfectadas com anti-miR-196a, a análise de imunofluorescência foi realizada . Observação de morfologia de vazio, anti-miR-NC e grupo anti-miR-196a foi realizada por microscópio. A expressão de E-caderina e vimentina, marcadores de EMT, foram detectados por imunofluorescência em 3

dias após a transfecção Rd. As células foram lavadas com PBS e fixadas em 4% paraform durante 15 min em gelo. Depois de mais dois solução tamponada com fosfato (PBS) de lavagem, as células foram cobertas com 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos em gelo, depois lavadas com PBS e incubadas com leite magro a 5% durante 1 h à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica de IgG. As células foram incubadas com o rato do anticorpo primário anti-humano de E-caderina (Abcam, MA, EUA) ou vimentina (Abcam) durante 2 h à temperatura ambiente, em seguida, lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo à temperatura ambiente durante 30 minutos numa câmara escura. As células foram lavadas com PBS e cobertas com DAPI para corar os núcleos. Tiramos fotos aleatórias usando ampliação de 200 vezes.

análise de Western blot

A concentração de proteína total extraído de branco anti-miR-NC e anti-miR-196a grupo, foi determinada com um BCA Protein Assay kit (Pierce, EUA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por 10% SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA, EUA) utilizando um mini-trans-mancha. De ratinho anti-humano de ciclina D1 (Abcam), CDK4 (Abcam), CDK6 (Abcam), a E-caderina (Abcam), vimentina (Abcam), de coelho anti-humano de N-caderina (Signaling Technology celular, MA, EUA), NFKBIA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), foram usados ​​para detectar a expressão de proteínas homólogas. GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) foi usada como um controlo interno. Electroquimioluminescência foi realizada com um sistema de imagem Chemilmager 5500 (San Leandro, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

repórter de luciferase 3’UTR ensaio

O repórter de luciferase NFKBIA 3’UTR humana construção (NFKBIA-3’UTR WT) foi gerado por clonagem sequência NFKBIA mRNA 3’UTR para jusante da construção PMIR-Report (terra, Guangzhou, PR China). O miR-196a-alvo sites de mutação NFKBIA 3’UTR repórter luciferase (mutação NFKBIA-3 ‘UTR) construção foi gerado através do emprego de mutagénese directa utilizando iniciadores de mutação que transformam o local de ligação de ACTACCT para ATCGATC miR-196a. células PANC-1 foram co-transfectadas com o plasmídeo de miR-196a e de tipo selvagem ou mutantes actividades de construção repórter e luciferase NFKBIA 3’UTR foram medidos utilizando o Dual-Glo Luciferase. Os dados foram normalizados dividindo-se a actividade da luciferase Firefly com a de Renilla luciferase.

A análise estatística

Os dados são apresentados como média desvio ± padrão (SD), calculado usando o software SPSS, versão 13.0. Os meios foram então comparados usando um one-way ANOVA com LSD entre os grupos ou estudante

t

teste entre os grupos.

P

. 0,05 significância estatística indicou

Resultados

miR-196a é sobre-expresso em linhas celulares de cancro do pâncreas

Para explorar o papel de miR- 196a no desenvolvimento do câncer de pâncreas, em primeiro lugar, examinamos a expressão de miR-196a em quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (Capan-2, BxPC-3, PANC-1 e SW1990) e imortalizado pancreático ductal H6C7 linha de células epiteliais por miRNAs microarray e real tempo de RT-PCR. O cluster hierárquica revelou que as expressões de miR-196.º em linhas celulares de cancro pancreático foram muito mais elevados do que em H6C7 (Figura 1A). Enquanto isso, o resultado em tempo real de RT-PCR foi de acordo com o microarray. Expressão de miR-196a foi (706,4 ± 9,4) vezes de em células PANC-1, (310,1 ± 7,5) vezes de em células SW1990, (7,6 ± 1,1) vezes de em BxPC-3 e células (204,9 ± 4,8) vezes de em células Capan-2, em comparação com (H6C7

P

0,05) (Figura 1B). Está implícito que miR-196a pode desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer de pâncreas humano.

(A) análise de agrupamento hierárquico de miRNAs que foram ou diferencialmente cima ou reprimidos em linhas celulares de cancro do pâncreas e H6C7. MiRNAs que marcou um valor diferencial de 1 ou superior foram categorizados como diferencialmente regulada e miRNAs que marcou um valor de -1 ou menos foram categorizadas como diferencialmente regulados negativamente. A barra de escala e em toda a parte inferior do mapa de calor mostra mudança DP da média. expressão miR-196a foi significativamente mais elevada em linhas celulares de cancro pancreático em microarrays. (B) Validação do nível de expressão de miR-196a em linhas celulares de cancro do pâncreas por qRT-PCR. MiR-196a foi significativamente regulada em linhas celulares de cancro do pâncreas. Expressão de miR-196a foi (706,4 ± 9,4) vezes de em células PANC-1, (310,1 ± 7,5) vezes de em células SW1990, (7,6 ± 1,1) vezes de em BxPC-3 e células (204,9 ± 4,8) vezes de em Capan-2 células, em comparação com H6C7 (*,

P Art 0,05).

Efeito do miR-196a sobre a proliferação e apoptose das células PANC-1