da arte abstracta

Em tipos de células específicas, como queratinócitos, a sinalização Notch desempenha um importante pro-diferenciação e supressores de tumor função, com baixo-modulação do gene de Notch1 sendo associado com o desenvolvimento do cancro. Além de ser controlado por p53, pouco se sabe sobre a regulação da expressão do gene Notch1 neste contexto. Relatamos aqui a que a transcrição deste gene é conduzida por um promotor TATA-menos “afiado pico” e que a região funcional mínima deste promotor, que se estende a partir da posição -342 pb do codão de iniciação, é diferencialmente activo na normal versus cancro células. Este GC região rica falta p53 sítios de ligação, mas se liga KLF4 e SP3. Esta constatação é provável que seja de importância biológica, como KLF4 e, em menor grau, Sp3 são regulados positivamente em um número de células de cancro em que a expressão de Notch1 é baixo modulada, e KLF4 sobre-expressão em células normais é suficiente para baixo -modulate transcrição do gene de Notch1. O knock-down combinado de KLF4 e SP3 era necessário para o efeito inverso de aumentar a transcrição Notch1, consistente com os dois fatores exercendo uma função de repressor sobreposição através de sua ligação com o promotor Notch1

Citation:. Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) Controle Diferencial de Notch1 Gene Transcrição por KLF4 e SP3 dos fatores da transcrição em normal contra queratinócitos Cancer-Derived. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10.1371 /journal.pone.0010369

editor: Joanna Mary Bridger, Brunel University, Reino Unido

Recebido: 24 de novembro de 2009; Aceito: 22 de março de 2010; Publicação: 28 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Lambertini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional da Suíça, uma subvenção da União Europeia (Epistem, sexto programa-quadro, LSHB-CT-2005-019.067), e NIH Grants AR39190 e AR054856 e GPD Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sinalização Notch desempenha um papel chave no controlo da determinação do destino da célula, crescimento e diferenciação [1], [2]. É também um determinante de carcinogénese, quer com um papel positivo ou negativo dependendo do tipo de célula e contexto específico [3], [4]. A via mais bem caracterizado “canónica” de activação Notch envolve a clivagem proteolítica e a translocação do domínio citoplasmático do receptor para o núcleo, onde se associa com o CSL proteína de ligação de ADN convertê-lo a partir de um repressor para um activador da transcrição [1], [ ,,,0],2]. Muita atenção tem sido dada ao controlo da via de Notch ao nível pós-transcricional, incluindo o processamento e maturação de receptores Notch, a activação por ligandos na superfície celular, e a modificação de proteínas e degradação [1], [2]. No entanto, uma forma principal de regulação também pode ser ao nível da transcrição de genes. Expressão dos quatro genes de receptores de Notch e seus ligandos é regulada em contextos celulares específicas e podem ser alterados no desenvolvimento do cancro [3], [5]. Além disso, a activação de um receptor é susceptível de afectar a sua própria expressão, bem como de outros membros da família, e também pode interferir, de uma forma positiva ou negativa, sobre a expressão do ligando [1], [2].

um exemplo deste modo de complexo de regulação da expressão de Notch foi fornecida por estudos nos queratinócitos, onde esta via desempenha um papel-chave na promoção da diferenciação e suprimir tumorigenese [3]. Na camada basal da epiderme, a regulação negativa recíproca entre os ligandos da família dos receptores Notch e Delta foi proposta para controlar o equilíbrio entre as populações de células estaminais e células de queratinócitos putativo comprometidas com a diferenciação [6]. Por outro lado, a regulação feedback positivo entre receptores Notch e ligandos da família Jagged tem sido implicado como um possível mecanismo para a sincronização da transição de queratinócitos a partir da proliferação basal de camadas suprabasais da epiderme diferenciadoras [7]. Embora ambos os receptores Notch1 e Notch2 são expressas na epiderme interfolicular, a sua regulação e função são apenas parcialmente sobrepostos. Em particular, enquanto os níveis de Notch2 são uniformemente elevados nas camadas de diferenciação da epiderme, a expressão de Notch1 é desligada nas camadas mais externas [7]. Isso pode ser de importância funcional, desde que a atividade Notch1 elevada, enquanto necessário para o compromisso ea entrada em diferenciação, pode então suprimir as últimas etapas deste processo [7], [8]. Da mesma forma, em tumores derivados de queratinócitos, como carcinomas de células escamosas cutâneas (SCCs), carcinomas de células basais (BCC) [9], [10] e fase tardia carcinomas cervicais [11], expressão de Notch1 é reduzido até um substancialmente maior extensão do que Notch2 . Isto é de significado funcional provável dado que, mesmo na presença de Notch2, a deleção do gene de Notch1 é por si só suficiente para promover o desenvolvimento do tumor de queratinócitos [9], [11], [12].

Surpreendentemente é pouco sabe sobre o controle da expressão do gene Notch1. Em queratinócitos, a p53 endógeno se liga ao promotor de Notch1, aumentar a sua transcrição, função de p53 e comprometido pode explicar, pelo menos em parte, o baixo-modulação associado a tumores de expressão de Notch1 [9], [13], [14]. De igual modo, a diminuição dos níveis de p53 através de degradação dependente de E6 viral pode explicar a já mencionada infra-regulação da expressão de Notch1 em células de carcinoma cervical positivo de HPV-14 []. Controle da expressão de Notch1 por p53 é também relevante para a resposta de queratinócitos à luz UV, um importante agente etiológico de envelhecimento da pele e câncer [13], [14]. Além disso os queratinócitos, e os seus homólogos malignos, a expressão de Notch1 está sob o controlo de p53 positiva em células do pulmão e cancro da próstata, outros tipos de células no qual o aumento Notch provoca a supressão de crescimento [15], bem como em células linfocíticas crónicas de células-B da leucemia, onde sinalização Notch aumenta a sobrevivência das células [16]. Em muitos destes casos, a p53 foi encontrada para ser especificamente envolvido no controlo do gene de Notch1 com poucos ou nenhuns efeitos sobre outros membros da família [9], [14], [15]. Interessantemente, nenhum desses regulamentos foi encontrado em células de carcinoma do cólon, apesar de se ligar de p53 ao promotor de Notch1 mesmo nestas células, que aponta para a interacção provavelmente entre p53 e outros como determinantes ainda não identificados da transcrição do gene de Notch1 [9].

A família Sp /KLF de factores de transcrição é constituído por proteínas com três domínios de dedo de zinco de ligação ao ADN altamente conservado, que reconhecem GC /caixas CACCC presentes em muitos promotores ricas em GC [17]. Estes factores desempenham um papel importante na transcrição dos genes de manutenção, bem como genes com funções específicas do tipo de células mais restritas [18]. Entre os membros da família Klf, KLF4 tem atraído a atenção recente por causa de sua capacidade de, em conjunto com outros fatores, para reprogramar especificação autônoma [19], bem como promover ou suprimir o desenvolvimento do câncer de uma maneira dependente do contexto [20]. Relatamos aqui que em queratinócitos KLF4 se liga ao promotor de Notch1 e, em conjunto com SP3, funciona como um regulador negativo da transcrição do gene de Notch1, afectando recrutamento do complexo de pré-iniciação polii através de um mecanismo separado do p53. A inibição da expressão de Notch1 por KLF4 é consistente com o papel essencial da KLF4 nos últimos estágios de diferenciação de queratinócitos [21], para que a expressão do gene de Notch1 necessita de ser desligado [7]. No entanto, o mesmo mecanismo regulatório também pode contribuir para down-modulação da expressão de Notch1 em tumores derivados de queratinócitos, onde KLF4 podem ser aberrante sobre-expresso.

Resultados

1. A transcrição do gene Notch1 de um “pico agudo ‘TATA menos promotor

Além do envolvimento de p53 [9], [13], [14], [22], pouco se sabe sobre o controle da transcrição do gene Notch1 . O gene de Notch1 humano está localizado no cromossoma 9 e estruturada em 34 exões, que codificam para uma grande proteína de cerca de 270 kDa. Por outras perspectivas sobre o controlo transcricional deste gene, comparou-se a sua sequência não codificante a montante no ser humano contra genomas do rato. Vários locais de ligação de p53 previu estão presentes nos 3,0 kb de sequência a montante do rato e promotores de Notch1 humanos, embora em diferentes posições relativamente ao codão de iniciação (Fig. 1A). Um gradiente de aumento de homologia de sequência foi encontrada para os codões de iniciação e de rato humanos, com 70% de identidade de sequência no domínio rico em GC a partir da posição -500 pb do ATG. análise de nucleotídeos ainda apontou para um sítio de ligação putativo TFIID em torno da posição -230 pb rodeado por elementos centrais distais, enquanto há caixas TATA puderam ser identificados (usando os programas TESS, Consite ou Genomatix; www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /tess /tess; asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite;. www.genomatix.de) (Fig 1B)

(a) para comparação de sequências de nucleótidos do 3.0. KB região a montante dos genes de ratinho e de Notch1 humana, aumentando com homologia para a região de codificação ilustrado por um gradiente de intensidade de cinzento. A posição dos sítios de ligação putativos de p53, como previsto por um programa de bioinformática (MatInspector, https://www.genomatix.de) é indicado, em relação ao codão de iniciação. “Canonical” locais de ligação de p53 são compostos por dois semi-sítios com a sequência de nucleótidos RRRCA /t-T /AGYYY (com R = purina; e Y = pirimidina), separados por um espaçador de 0-21 nucleótidos. Quartas de sites (RRRCW e WGYYY) podem estar presentes em uma cabeça a cabeça, ou cabeça para orientação cauda, ​​como indicado pelas setas (→ ou ←). Números acima e abaixo referem-se a pontuação de correspondência entre a sequência de nucleotídeos de cada local e a matriz previsto, com uma combinação perfeita = 1,00, e um “bom” jogo 0,80. (B) elementos promotores núcleo do gene Notch1 humana com uma indicação da região proximal rico em GC, local putativo TFIID ligação e elementos centrais distais (DCE) [53] (conforme identificado pelo programa TESS) e locais de início da transcrição Notch1 ( TSS). (C) Determinação experimental do Notch1 TSS por 5 ‘RACE. queratinócitos primários humanos foram usados ​​como fonte de ARN total para a amplificação de 5 ‘RACE utilizando GeneRacer e um iniciador de sentido reverso específico localizado em 242 pb a partir do codão de iniciação. Clonagem e sequenciação do produto da reacção de amplificação (conforme mostrado depois de electroforese em gel) apontava para uma grande TSS na posição -262 e uma segunda na posição -259. A sequência de sobreposição de elementos de iniciador (Py Py A (+1) NT (+3) Py Py), no nosso caso TCA (1) CT (+3) AG para a maior TSS, e CTA (+1) GT ( +3) GC para o segundo TSS, é indicada a negrito, sendo os primeiros nucleotídeos dos dois TSS estão em itálico.

para estabelecer experimentalmente o local de início da transcrição (TSS) da transcrição Notch1 em queratinócitos humanos primários (HKC), que clonado e sequenciado os produtos de reacção a partir destas células de 5′-RACE (amplificação rápida de DNA complementar extremidades 5 ‘) (Fig. 1C). Os resultados apontaram para um dos principais TSS do gene Notch1 humana na posição -262 pb do ATG, com uma segunda menor TSS em -259 pb. Deste modo, a transcrição do gene de Notch1 é conduzido por um promotor ilha CpG, o qual, ao contrário da maioria dos promotores desta classe [23], tem as características de um promotor de “pico agudo ‘, com TSSs precisa provavelmente determinado por um iniciador de sobreposição (INR) elemento [24].

2. Mapeamento da região promotora Notch1 funcional normal versus células cancerosas

expressão de mRNA pode ser controlado em vários níveis, desde os primeiros passos de transcrição (iniciação /alongamento) para processamento do RNA e estabilidade [25]. análise em tempo real de RT-PCR com iniciadores específicos para a 5 ‘e 3’ da transcrição de Notch1 e o primeiro intrão mostrou que a expressão mais elevada de ARNm de Notch1 previamente relatada em HKC contra células cancerígenas derivadas de queratinócitos [9], [11] foi mantida independentemente das regiões específicas do transcrito de Notch1 que foram analisadas (Fig. 2).

(a) organização de o gene de Notch1, com uma indicação da grelha de leitura aberta (ORF) que codifica com exões e intervir intrões (caixas pretas grossas e linhas, respectivamente) e 5 ‘e 3’ não traduzidas (UTR regiões). A posição dos diferentes conjuntos de iniciadores utilizados para a análise em tempo real de RT-PCR também é indicada (setas finas). (B) de ARN total a partir de queratinócitos primários humanos (HKC), células do carcinoma do colo do útero (HeLa, Caski e SiHa), e pele (SCC13) e células de carcinoma oral (SCCO28) escamosas foi analisada através de tempo real de RT-PCR com iniciadores correspondendo aos região diferente do gene de Notch1 como indicado em (a). Por esta e todas as outras figuras, os valores foram normalizados para 36B4 e /ou níveis de ARN de 18S, e expressa em relação aos dos queratinócitos primários.

Estes resultados sugerem que a transcrição do gene de Notch1 é diferencialmente controlada no normal versus células cancerosas já nos passos iniciais de transcrição. Para testar esta possibilidade, determinou-se a região funcional mínima do promotor Notch1 e avaliou se essa região é diferencialmente ativo no normal versus células cancerosas. Para este fim, a região de 2,4 kb do promotor de Notch1 a montante do codão de iniciação foi clonado num repórter de luciferase, seguida por ensaios de actividade de promotor em HKCs contra células HeLa. Testando uma série de fragmentos com comprimento progressivamente reduzido a partir da extremidade 5 ‘mostrou que uma região de 342 pb a partir do codão de iniciação retém actividade promotora completa em HKCs, enquanto ainda encurtamento do promotor de Notch1 para regiões -315 pb e -300 pb resultou em progressivamente actividade reduzida (Fig. 3A). regiões promotoras de Notch1 com actividade completa em HKCs foram significativamente menos activa em células HeLa, o que reflecte as diferenças na transcrição do gene de Notch1 endógeno, enquanto a diferença em actividade do promotor tornou-se menos com fragmentos do promotor de Notch1 mais curtos (Fig. 3a).

(a) diferentes fragmentos do promotor de Notch1 humana com a diminuição da extremidades 5 ‘foram clonados em um plasmídeo repórter de luciferase, seguindo-se a transfecção transiente em queratinócitos humanos primários e células HeLa (barras pretas e cinzentas, respectivamente) em conjunto com um repórter mínima de Renilla para normalização . A actividade do promotor foi medida 48 horas após a transfecção. A atividade relativa promotor dos vários repórteres em HKC contra HeLa também foi calculada (tabela à direita). (B) fragmentos do promotor de Notch1 humano com supressão parcial ou total da sequência do TSS para o codão de iniciação (falta nucleótidos -159 a -1, e -262 a -1, respectivamente) foram clonados em um plasmídeo repórter de luciferase, seguido por ensaios de /actividade de promotor de transfecção transiente em queratinócitos humanos primários e células HeLa como no painel anterior. atividade do promotor relativa no HKC contra HeLa também foi calculada. (C) ARN total a partir de ceratinócitos primários e várias linhas de células cancerosas, incluindo PC3, CaSki, e HeLa a partir de duas fontes diferentes (HeLa # 1 e 2), foi utilizado para amplificação RT-PCR da região a 5 ‘UTR do entalhe 1 gene (iniciador posição -262 /-174). Note-se a banda mais rápida migração obtidos com as amostras de HeLa. Clonagem e sequenciação da região genómica de sobreposição (a partir da posição -392 a -1 pb do promotor de Notch1) mostrou uma deleção desde a posição -215 a -202 em células HeLa. (D) A mesma região genómica de Notch1 mais /menos o apagamento acima foi clonado num plasmídeo repórter de luciferase, seguida por ensaios de actividade de promotor no HKC contra células HeLa, medidos como em (A) e (B).

as sequências de nucleótidos a jusante de locais de iniciação da transcrição (SST) desempenham também um papel importante no controlo da actividade do promotor, sendo necessário para a formação da transcrição e de iniciação pré-iniciação complexos [26]. Consistente com a importância desta região, a actividade do promotor foi substancialmente reduzida, quando a sequência do promotor de Notch1 jusante da SST para o codão de iniciação (a partir de -262 a -1) foi parcialmente ou totalmente eliminados (com o promotor constrói falta os nucleótidos -159 a -1 e -262 a -1, respectivamente) (Fig. 3B). Mesmo neste caso, a diminuição da actividade intrínseca promotor foi acompanhada por uma menor diferença entre células normais e cancerosas (Fig. 3B).

A amplificação por PCR de ADN genómico, destinado a avaliar o seu estado de metilação, como mostrado mais adiante, revelou a existência de uma pequena deleção na região do promotor de Notch1 de duas estirpes diferentes de células HeLa, o que não estava presente nas outras células cancerosas como PC3 e CaSki (Fig. 3C). Por clonagem e sequenciação desta região, que mapeou a eliminação para a posição -215 a -202 pb, imediatamente a jusante do TSS. Funcionais ensaios do promotor região promotora clonada no HKC contra células HeLa atividade do promotor mostraram que este 10 nucleotídeos exclusão não afetou a atividade do promotor nem a sua regulação diferencial em normal versus células cancerosas (Fig. 3D).

3. O controlo negativo de Notch1 transcrição do gene por KLF4 e SP3

A actividade diferencial de transcrição da região rica em GC proximal do promotor de Notch1 pode ser ligada a um estado de metilação diferente em HKCs contra células HeLa. Puxar para baixo ensaios com anticorpos contra o ADN metilado seguido por amplificação por PCR indicou a um nível substancial de metilação da primeira região intrónica (entre os nucleótidos + 1168 /+ 1798) em células Hela, mas não em HKCs, o que poderia contribuir para diferentes transcrição do Notch1 gene (Fig. 4A). No entanto, não metilação detectável foi encontrado na região do promotor de Notch1 que podem ser responsáveis ​​por seus diferentes níveis de atividade em duas células. Outra possibilidade é que a actividade do promotor de Notch1 diferencial está ligada a factores de transcrição que se ligam a esta região e controlar a sua actividade. Os fatores de transcrição com a maior probabilidade de se ligar ao GC domínios ricos como o presente em Notch1 promotor região proximal são proteínas de dedos de zinco das SP- e KLF famílias [27]. Um ou mais destes factores podem ser diferencialmente expressos em normais versus células cancerosas. Na verdade, em tempo real de RT-PCR de HKCs contra um painel de carcinoma cervical e células SCC derivadas de queratinócitos mostraram que, dos vários membros da família Sp /KLF que foram examinados, KLF4 foi fortemente e de forma consistente supra-regulados em células de cancro (Fig . 4B). Sp1 e SP3 foram também regulado para cima nestas células, se bem que em menor grau do que KLF4, enquanto que a expressão de outros membros da família, como KLF5, ou KLF10a foi apenas ligeiramente afectada e /ou para baixo modulada (Fig. 4B). Foram observadas diferenças menores no nível da proteína, provavelmente como resultado da pós-transcrição e /ou da proteína de desestabilização eventos (Fig. 4C).

(A) a partir de extractos nucleares queratinócitos primários humanos (HKC) e as células HeLa foram imunoprecipitados com anticorpos contra o ADN desnaturado, seguido por análise por PCR do DNA precipitado com primers específicos para as regiões indicadas do promotor de Notch1 e primeira região intrónica. PCR com iniciadores específicos para um gene conhecido metilado foi utilizado como controlo positivo. As amostras (B) ARN total a partir de queratinócitos primários humanos (HKC) e as linhas celulares de cancro indicados foram analisados ​​por tempo real de RT-PCR com iniciadores específicos para o SP1, SP3, KLF4, KLF5 e KLF10a. queratinócitos primários, células HeLa e SCC13 (C) foram analisadas por immunoblotting com anticorpos contra o SP1, SP3 e KLF4, com β-actina de controle de carga como iguais.

Para avaliar as consequências funcionais da expressão aumentada KLF4 em Notch1 de transcrição, foram realizadas duas abordagens complementares. No primeiro, HKCs foram transfectadas transitoriamente com um repórter de Notch1; a actividade do promotor foi suprimida por transfecção concomitante com um vector de expressão KLF4 (Fig. 5A). Numa segunda abordagem, HKC foram infectadas com um retrovírus que expressam KLF4. em tempo real de RT-PCR, assim como análise de imunotransferência mostrou que a expressão endógena de Notch1 foi significativamente reduzida nestas células como uma consequência da KLF4 sobre-expressão (Fig. 5B e C).

(A) queratinócitos primários foram co -transfected com um repórter contendo o promotor mínimo de Notch1 funcional (de -392pGL4) em conjunto com um vector de expressão para KLF4 humano ou de controlo de vector vazio. Renilla repórter mínima foi usada para normalização interna, e a actividade do promotor foi medida 48 horas após a transfecção. São mostrados os resultados de duas experiências diferentes. (B) queratinócitos primários foram infectados com um vector retroviral expressando KlfF4 (pMSKlf4) ou um controlo de vector vazio e colhido após 48 horas, seguido de determinação da expressão de ARNm de Notch1 e KLF4 por PCR em tempo real. Eficiência de infecção com o vírus pMSKlf4 foi também avaliada pelas alterações morfológicas generalizadas com achatamento das células (painéis superiores). (C) queratinócitos primários foram infectadas com um retrovírus que expressa KlfF4 versus um controlo de vector vazio como no painel anterior, seguido por análise de imunotransf erência com anticorpos contra Notch1, KLF4 e γ-tubulina como controlo de carga igual. Painel da direita: os dados foram quantificados por varrimento densitométrico das autorradiograf ia e expressos como unidades arbitrárias após a normalização para a expressão γ-tubulina. Resultados semelhantes foram obtidos numa segunda experiência independente.

Por outro lado, para testar se a supressão KLF4 leva à sobre-regulação de Notch1, HKC, bem como células HeLa foram transfectadas com ARNsi para KLF4. Eficiente para baixo-modulação deste gene não teve efeitos sobre a transcrição de genes de Notch1, e semelhante falta de efeitos foi observada após knock-down do SP3 e Sp1 (Fig. 6A e dados não mostrados). No entanto, o knockdown mediada por siARN combinada de KLF4 e SP3 resultou na consistente sobre-regulação da expressão de Notch1 em ambos os HKCs e células cancerosas (células HeLa e SCC13), com a concomitante knock-down de Sp1 sem efeitos adicionais (Fig. 6B , C e dados não mostrados).

(a) queratinócitos primários foram transfectadas com dois conjuntos de siRNAs para KLF4, Sp1 ou SP3 em paralelo com controlos siRNA mexidos durante 48 horas, seguido por análise dos genes alvo expressão por tempo real de RT-PCR e imunotransferência (painel esquerdo e do meio, respectivamente) As mesmas amostras de ARN foram também analisadas para os níveis de expressão de Notch1 (painel da direita). (B) queratinócitos primários, foram transfectadas como no painel anterior com dois conjuntos diferentes de siRNAs para KLF4 e SP3 (siARN-1, siARN-2) (à esquerda colunas) ou com ARNsi para KLF4, Sp1 e SP3 (colunas da direita), seguido por análise em tempo real de RT-PCR da expressão de Notch1. É mostrada a média calculada de quatro experiências diferentes, utilizando 36β4 e 18S RNA para a normalização interna. células HeLa e SCC13 (C) foram transfectadas com dois conjuntos diferentes de siRNAs para KLF4 e SP3 (siARN-1, siARN-2) seguido por determinação da expressão de Notch1 por em tempo real de RT-PCR, como no painel anterior. queratinócitos primários e células SCC13 foram transfectadas com ARNsi contra os genes indicados, seguido por análise de imunotransferência da expressão da proteína de Notch1 com γ-tubulina como controlo de carga igual. Painel da direita: os dados foram quantificados por varrimento densitométrico da auto-radiografia e expressos como unidades arbitrárias após a normalização para a expressão γ-tubulina

O knockdown combinada necessário de KLF4 e SP3 para up-regulação da expressão de Notch1 pode. ser explicados pela ligação destes factores para o promotor de Notch1 concomitante. Na verdade, a cromatina imunoprecipitação (chip) ensaios mostraram, em células HeLa e HKCs, que ambos se ligam e SP3 KLF4 rica em GC a região proximal do entalhe de um promotor (Fig. 7A-D). Curiosamente, em HKCs, Sp1 também foi encontrada para se ligarem a esta região, mas a um grau muito menor do que a região proximal do promotor p21WAF1 /Cip1, um alvo Sp1 bem estabelecida [28]. Sem se ligar ao promotor de Notch1 Sp1 foi encontrado em células HeLa (Fig. 7B). Chip ensaios semelhantes foram também realizados com anticorpos contra um factor de transcrição de ligação a GC não relacionado, Maz [29]. Enquanto Maz1 foi encontrado para se ligar ao promotor de p21 semelhante a SP1, SP3 e KLF4, houve pouca ou nenhuma ligação de proteína a esta região proximal do promotor de Notch1 (Fig. 7B, C).

( a) Previsto sítios de ligação Klf4- eo SP1 /SP3 na região promotora Notch1 a -340 /-300 pb. É mostrada a sequência de nucleótidos desta região, com, na parte superior, os locais de ligação previstos para Klf4- e Sp1 /SP3. (B e C) queratinócitos primários (HKC) e as células HeLa foram processadas para imunoprecipitação da cromatina (ChIP) análise com anticorpos contra SP1, Sp3 (B), KLF4 (C) ou Maz, como indicado, seguindo-se a amplificação de duas regiões promotoras de Notch1 localizado entre bp -740 /-262 (Chip 1) e cerca de -6600 pb (Chip 2), que contêm e falta, respectivamente, os locais putativos Sp1 /SP3 e KLF4 ligação. A amplificação da região do promotor proximal do p21

gene WAF1 /Cip1 (Chip p21) foi utilizado como controlo positivo. preparações cromatina Un-precipitadas foram utilizados para reacções de amplificação paralelos como controles de DNA “INPUT”. Os ensaios (D) chip com anticorpos anti-SP3 e KLF4 e IgGs não imunes como nos painéis anteriores foram seguidos em tempo real por amplificação por PCR de região1 do promotor de Notch1. A quantidade de ADN precipitado foi calculada em relação à cromatina entrada total e expressa como uma percentagem do total de acordo com a seguinte fórmula geral [54]: percentagem total = 2ΔCt × 5, onde ΔCt = Ct (de entrada) – Ct (imunoprecipitação), e Ct é o limiar de ciclo.

4. controle oposto de Notch1 transcrição por p53 contra KLF4 /Sp3

Uma questão importante é se p53 e controle KLF4 /Sp3 Notch1 transcrição do gene através de mecanismos separados ou convergentes. Um passo regulador chave é recrutamento dependente de factores de transcrição do complexo de pré-iniciação da transcrição, contendo RNA polimerase II (polii), para alvejar promotores [30]. Para avaliar se este passo inicial de Notch1 transcrição está sob p53 e controle KLF4 /SP3, foram realizadas duas abordagens complementares. Em células HeLa, onde os níveis de p53 são muito baixos devido a degradação E6-dependente, foram avaliados os efeitos do aumento da expressão de p53 por sobre-adenoviral-mediada. Em células HeLa de controlo, ensaios ChIP mostrou pouca ou nenhuma ligação de polii ao promotor e 3? UTR do gene de Notch1, enquanto que a ligação era tal prontamente detectável em células com um aumento da expressão de p53 (Fig. 8A). Em HKC, onde os níveis de KLF4 são normalmente baixos, foi avaliado o efeito de expressão aumentada KLF4 através de infecção retroviral. ChIP ensaios mostraram ligação de polii para o promotor e a 3 ‘UTR do gene de Notch1 em HKCs de controlo, enquanto que não foi detectável tal ligação em células com a expressão aumentada KLF4 (Fig. 8B).

(A) células HeLa as células foram infectadas com um adenovirus recombinante que expressa a p53 selvagem (Adp53) ou controlo de GFP (AdGFP) e processadas para ensaios de chip com anticorpos contra a ARN-polimerase II (α-polii) e as IgGs não-imunes como controlo. A amplificação por PCR das regiões indicadas do gene de Notch1 foi realizada, em paralelo com a amplificação de ADN semelhante da entrada da cromatina. Os painéis à direita: Para a quantificação dos resultados, o material da cromatina imunoprecipitada foi também analisado por tempo real a amplificação por PCR das regiões indicadas do promotor de Notch1, em paralelo com o ADN da cromatina de entrada, seguido por um cálculo de ligação de acordo com a mesma fórmula utilizada no FIG. 7D. (B) queratinócitos primários (HKC) foram infectados com um vector retroviral que sobre-expressam KLF4 (pMSKlf4) ou controlo de vector vazio (Ctrl) durante 48 horas seguido por ensaios de chip para polii de ligação como no painel anterior, incluindo a quantificação dos resultados pelos PCR em tempo real (painéis da direita).

Funcionalmente, para avaliar se o aumento da expressão da p53 e KLF4 /Sp3 down-modulação pode sinergia, duas abordagens complementares foram realizados. No primeiro, as células HeLa foram infectadas com um adenovirus expressando p53 mais /menos knock-down KLF4 de expressão e SP3. Na segunda, as células HeLa foram transfectadas com ARNsi específicos para a proteína UBE3A, um regulador negativo da estabilidade de p53, como um método para aumentar a expressão de p53 endógeno [14]. Aumento dos níveis de p53 por tanto abordagens causou a indução esperado de expressão Notch1. O knockdown combinada de KLF4 e SP3 também causou um aumento de expressão de Notch1, mas sem efeitos aditivos ou sinérgicos foram observados pelo aumento concomitante da p53 e o knock-down de KLF4 e SP3 (Fig. 9A e B).

células HeLa (a) foram transfectadas com ARNsi para SP3 e KLF4 em paralelo com controlos siRNA mexidos seguido, 48 horas após a transfecção, por infecção com um adenovirus expressando p53 (Adp53) ou controlo de GFP (AdGFP), durante 24 horas. Níveis de expressão de ARNm de Notch1 foram determinados por em tempo real de RT-PCR. As alterações esperadas de p53, SP3 e expressão KLF4 também foram confirmadas por tempo real de RT-PCR, com resultados semelhantes aos mostrados nas figuras anteriores. células (B) HeLa foram transfectadas com ARNsi para UBE3A, KLF4 e SP3 sozinho ou em combinações, como indicado, em paralelo com controlos siRNA mexidos. UBE3A e expressão de Notch1 foi avaliada por em tempo real de RT-PCR. (C e D) queratinócitos primários (HKC) (C) e HeLa e SCC13 células (D foram infectadas com um retrovírus que expressam KLF4 ou controlo de vector vazio durante 48 horas, seguido de infecção com os vírus Adp53 ou AdGFP durante 24 horas. ARNm de Notch1 níveis foram avaliados por real-time RT-PCR.

Para avaliar se KLF4 pode suprimir os efeitos indutivos de células p53, HKCs, HeLa e SCC13 foram infectadas com o retrovírus KLF4 expressam ou controle do vetor vazio, seguido por infecção com o p53 expressando adenovírus ou GFP de controlo. níveis de p53 acrescidos devido a indução da expressão de Notch1 em HKCs controlo, bem como em HKCs onde o gene de Notch1 foi baixo modulada como consequência do aumento da expressão KLF4 (Fig. 9C). a indução mais substancial da expressão de Notch1 foi causada por uma infecção do Ad-p53 de células cancerosas, como células HeLa e SCC13, que partilham uma via p53 mutado ou silenciosa e baixos níveis de Notch1 endógenos [9], [11]. nestas células, os quais expressam alto nível de KLF4 endógena, mais uma expressão de KLF4 não diminuiu a expressão de Notch1 e não interferiu com a sua indução por p53 (Fig. 9D).

Assim, p53 e KLF4 convergem para o controle de transcrição do gene Notch1 na etapa inicial de recrutamento polii, com indução de p53 ocorre através de um mecanismo separado de KLF4 /Sp3 repressão.

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