Abstract

Fundo

variantes constitutivamente activa receptor de andrógeno (AR-V) sem o domínio de ligação ao ligando (LBD) pode promover o desenvolvimento do câncer de próstata resistente à castração (CRPC). A expressão de AR-Vs no clinicamente mais importante sítio metastático, do osso, tem, no entanto, não foi bem documentada. O nosso objectivo era, por conseguinte, para comparar os níveis de AR-Vs em hormona-ingénuo (HN) e metástases ósseas CRPC, em comparação com PC primário e no tecido da próstata não maligna, bem como em relação à AR expressão de proteínas, os perfis de transcrição de todo o genoma e amostras de sobrevivência do paciente.

Metodologia /Principais achados

Hormone-naïve (n = 10) e osso CRPC metástases (n = 30) foram obtidos de 40 pacientes de cirurgia de metástases. amostras da próstata não-malignas e malignas foram adquiridos a partir de 13 homens prostatectomizados. Níveis de AR comprimento completo (ARfl) e AR-AR-Vs denominado V1, AR-V7 e ARNm de AR-V567es foram medidos com os perfis de transcrição de todo o genoma de RT-PCR e com uma matriz Ilumina Beadchip. Os níveis de proteína foram analisados ​​por transferência de Western e imuno-histoquímica. Os transcritos para ARfl, AR-V1, e Ar-V7 foram detectados na maioria dos tumores primários e metástases, e os níveis estavam significativamente aumentados em metástases ósseas CRPC. A transcrição AR-V567es foi detectada em 23% de apenas as metástases ósseas CRPC. Um sub-grupo de metástases ósseas CRPC expressa proteínas LBD-AR truncada em níveis comparáveis ​​aos da ARfl. Detectável AR-V567es e /ou mRNA AR-V7 no quartil superior, visto em 1/3 de todas as metástases ósseas CRPC, foi associado com uma pontuação elevada AR imunocoloração nuclear, regulação do ciclo celular perturbado e sobrevivência curta.

Conclusões /Significado

a expressão de AR-Vs é aumentada em CRPC comparação com metástases ósseas HN e associada a um prognóstico particularmente ruim. Mais estudos são necessários para testar se os pacientes que expressam tais AR-Vs em suas metástases ósseas beneficiar mais de fármacos que actuam em ou a jusante destas AR-Vs do que de terapias que inibem a síntese de andrógenos

Citation:. HORNBERG E, Ylitalo EB, Crnalic S, Antti H, Stattin P, Widmark A, et al. (2011) Expressão do receptor andrógeno variantes de processamento em cancro da próstata metástases ósseas está associada a castração-resistência e baixa sobrevida. PLoS ONE 6 (4): e19059. doi: 10.1371 /journal.pone.0019059

Autor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2011; Aceito: 23 de março de 2011; Publicação: 28 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 HORNBERG et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Sociedade sueca de Câncer, do Conselho de Pesquisa sueco, a Fundação de Pesquisa Lions Câncer e da Fundação do Câncer norte da Suécia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os androgénios regular o crescimento de tecido da próstata normal e diferenciação, através da activação dos receptores de androgénio em células epiteliais e do estroma, e também desempenham um papel importante durante todas as fases do cancro da próstata (PC) de crescimento. A terapia padrão para pacientes com PC avançada é, consequentemente, para reduzir a androgénios, quer por castração cirúrgica ou médica. Depois de um período de remissão de tumores iniciais, eventualmente, recaída, predominantemente dentro do osso, e, em seguida, são denominados PC resistente à castração (CRPC). Os mecanismos que controlam o crescimento CRPC em metástases ósseas são, no entanto, em grande parte desconhecido e pouco explorada por realmente examinar essas metástases em pacientes.

Curiosamente, o receptor de andrógeno (AR) é comumente ativo no CRPC apesar níveis de castração de testosterona [1 circulantes ], [2] e imunocoloração intensa AR nuclear em metástases ósseas CRPC está relacionada com uma particularmente curta sobrevivência [3]. Diferentes mecanismos têm sido sugeridos para contribuir para a activação de AR em CRPC, incluindo a síntese intracrine de androgénios, alterações genéticas e epigenética da AR tornando-a mais sensível à activação por androgénios ou outros ligandos [1], [4], [5] e a expressão de constitutivamente activa variantes de AR (AR-V, ver abaixo). Estes achados sugerem que CRPC pode ser tratada com sucesso com os novos medicamentos agora em ensaios clínicos que bloqueiam a síntese de androgénio ou de AR nas metástases (revisto em [6]), mas que os receptores constitutivamente activos ainda poderia ser um problema. Os estudos são, portanto, necessários para explorar, se estes AR-Vs são comumente expressa em metástases ósseas CRPC ou não.

Estruturalmente o humano

AR

gene é composta por oito exons que codificam uma proteína de 110 kDa que consiste em

2 domínios de trans-activação do terminal NH (NTD), um domínio de ligação de DNA (DBD), uma região de charneira e o domínio COOH terminal (CTD), que também é o domínio de ligação ao ligando (LBD) [7]. O LBD, codificada pelos exões 4-8, não é essencial para a actividade de transcrição [8]. Truncado AR-Vs a que falta o LBD e proposto para ser constitutivamente receptores activos foram detectados em linhas celulares de PC, bem como em amostras clínicas, incluindo tecido benigno, maligna e metastática, como resultado de splicing alternativo ou não-sentido mutações do humano

gene AR

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Aumento dos níveis de variantes de splicing Ar têm sido detectados em CRPC quando comparado com (HN) do PC hormona-naïve [13], [14], [16]. Esses estudos incluíram amostras CRPC obtidos a partir de tumores primários no momento da cirurgia, ou metástases de tecidos moles e algumas metástases ósseas recolhidas na autópsia. A expressão de AR-Vs no local metastático clinicamente mais relevante, o osso, não tem sido bem documentada.

O objectivo deste estudo era, por conseguinte, para analisar a expressão do AR de comprimento completo (ARfl) e a sua clinicamente mais abundante variantes de processamento aqui denominado AR-V1, AR-V7 [14] (também referido como AR3 [13], [17], e AR-V567es [16] em HN e metástases ósseas CRPC em comparação a expressão em PC primário e no tecido da próstata não maligno. Além disso, os níveis de transcrição AR foram relacionados com AR expressão da proteína, os perfis de transcrição todo o genoma e evolução clínica.

Materiais e Métodos

declaração Ética

o estudo foi aprovado pelo comitê de ética local, da Universidade de Umeå e os participantes leram e assinaram ou consentimento verbal.

pacientes

as metástases ósseas foram obtidos a partir de uma série de fresco congelado e fixados em formalina embebidos em parafina de biópsias coletadas de pacientes com PC operado para a compressão da medula espinal metastático ou fraturas patológicas no Hospital da Universidade Umeå (2003-2009). Estes pacientes foram minuciosamente descrito em [3] e as características clínicas e terapias estão resumidos na Tabela 1. O estudo inclui também 13 pacientes que foram tratados com prostatectomia radical no Hospital da Universidade Umeå, entre fevereiro 2005 e setembro de 2006. A idade média dos pacientes foi de 60 anos (intervalo 48-68 anos) e PSA mediana era de 6,6 ng /ml (intervalo de 3,5-24 ng /ml). Onze dos pacientes tinham tumores classificados como escore de Gleason (GS) 7 e dois como GS 8. Quatro dos tumores estavam em T2 palco e nove em fase T3. Imediatamente após a remoção cirúrgica das próstatas foram trazidos para o departamento de Patologia e corte em fatias de 0,5 cm de espessura. A partir destas fatias de 20 amostras foram perfurados a partir de cada próstata usando um cilindro de aço 0,5 cm e congelados em -70 ° C dentro de 30 minutos após a cirurgia. As fatias de próstata foram então fixadas em 4% de formaldeído durante 24 horas, desidratados, embebidos em parafina, cortados em secções de 5 microns de espessura e corados com hematoxilina-eosina. A natureza das amostras de tecido congeladas (não-maligna ou maligna) foi determinada pela sua localização nas secções de toda a montagem, mas também verificada por meio de microscopia de luz de secção criostato hematoxilina /manchado-eosina de cada uma das amostras de tecido analisadas conforme descrito abaixo . Nessas seções a percentagem de tecido do tumor foi quantificada eo tumor GS determinado.

Preparação do tecido e RNA extração

áreas representativas de metástases ósseas, PC primário e tecido da próstata não maligno foram crio-seccionados em tubos de extracção e o ARN foi isolado utilizando o protocolo de Trizol (Invitrogen, Estocolmo, Suécia). A percentagem de células tumorais nas amostras variou entre 25-95%. As concentrações de ARN foram quantificados por medições de absorvância, utilizando um espectrofotómetro (espectrofotómetro ND-1000; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). A qualidade RNA foi analisado com o 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e verificada a ter um número de integridade do RNA ≥6.

em tempo real RT-PCR

Two- cem (200) ng de ARN foram transcritas invertidas com Superscript II de transcriptase reversa (Invitrogen) num volume total de 10 ul. A amplificação por PCR subsequente foi realizada utilizando o Biorad IQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As reacções foram realizadas num volume de 20 ul usando o IQ SYBR Green Supermix (laboratórios Bio-Rad). Os seguintes conjuntos de iniciadores foram utilizados; ARfl: 5′-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘e 5′-AGCTTCTGGGTTGTCTCCTCAGTGG-3′, AR-V1: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘e 5′-CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT-3′, AR-V7: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘e 5’-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3 ‘, e Ar-V567es: 5′-CCAAGGCCTTGCCTGATTGC e 5′-TTGGGCACTTGCACAGAGAT-3′, resultando em fragmentos amplificados de 143, 145, respectivamente 125 pb, tal como descrito anteriormente [14], [16]. Os iniciadores para o gene de manutenção RPL13A (5’-GTACGCTGTGAAGGCATCAA-3 ‘e 5′-GTTGGTGTTCATCCGCTTG-3’) amplificou um fragmento de 125 pb. Cada amostra foi executado em duplicatas e ajustado para níveis RPL13A correspondente. Derreter análise da curva confirmou os produtos amplificados, que também foram analisadas por electroforese em gel de agarose a 1% para confirmar o tamanho esperado (dados não mostrados).

análise Western blot

metástases ósseas e de congelação fresca amostras de próstata foram crio-seccionados e as proteínas foram extraídas de 20 secções (10 uM cada) utilizando o AllPrep Mini kit, de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA Protein (Pierce Chemical Co., IL, EUA). 22RW1 células foram mantidas de acordo com as instruções do fabricante (ATCC) e as proteínas foram extraídas como descrito anteriormente [18].

As amostras (20 ug de proteína) foram separados por 7,5 SDS-PAGE sob condições redutoras e subsequentemente transferidos para membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). As membranas foram coradas com vermelho Ponceau para confirmar o carregamento da amostra igual e transferência (resultados não mostrados). As membranas foram então bloqueadas em leite 5% seguido de incubação de anticorpos anti-AR; N-20 (diluída 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou PG-21 (diluída 1:1000, Upstate, Lake Placid, NY), a fim de detectar a ARfl e AR-VS, e C-19 (Santa Cruz), a fim de detectar ARfl mas não AR-Vs sem a LBD. Os anticorpos primários foram diluídos em 1% de leite /PBST e incubadas em 4 ° C durante a noite. Aplicou-se o IgG anti-coelho secundário (Dako, Glostrup, Dinamarca) anticorpo (diluído 1:20 000 em leite 2,5%) após a lavagem em PBST e incubados durante 1 h em TA. A expressão proteica foi visualizado após lavagem exaustiva utilizando o kit de detecção ECL Avançada (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e quantificadas com um scanner ChemiDoc ea quantidade Um software 4 (Bio-Rad Laboratories).

A imuno-histoquímica

as metástases ósseas examinadas neste estudo foram previamente histoquímica para a AR, Ki67 (proliferação celular), caspase ativada 3 (células em apoptose) e antígenos de PSA (Tabela 2) seguindo os protocolos descritos anteriormente [3]. AR nuclear e citoplasmática imunocoloração PSA foram pontuados de acordo com a intensidade (0, 1, 2, ou 3) e a fracção de células coradas (0, 1, 2, 3, ou 4). A pontuação total (variando de 0-12) foi obtida multiplicando as pontuações de intensidade de coloração e de fração. Uma pontuação total de AR, de 8 ou superior (mediana e acima) foi previamente definida como alta e verificou-se estar associada com uma menor sobrevivência após a cirurgia ortopédica metástases do que uma pontuação total AR abaixo de 8 [3]. A pontuação de PSA de 8 e abaixo (mediana e abaixo) foi associado a um resultado desfavorável em pacientes CRPC [3]. As fracções (%) de Ki67 e células tumorais coradas ativos caspase 3 foram previamente determinada e verificou não estar associada com o resultado neste material paciente [3].

Análise

A expressão gênica

duzentos e cinquenta (250) ng de ARN total por amostra foi utilizada para a produção de cRNA por o estojo de amplificação de ARN Ilumina TotalPrep (Ambion Inc., St. Austin, TX, EUA) de acordo com o protocolo fornecido. A qualidade de cRNA foi avaliada utilizando o kit RNA 6000 Pico (Agilent Technologies) e o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Um total de 750 ng de cRNA foi utilizado para a hibridação de uma matriz de expressão de gene humano HT12-V3 Ilumina Beadchip (Illumina, San Diego, CA, EUA), incluindo 48803 e 37846 sondas de genes anotados, de acordo com o protocolo do fabricante. As matrizes foram digitalizados e sinais de fluorescência obtidos utilizando o Illumina grânulo matriz Reader (Illumina, San Diego, CA, EUA). análise de dados de matriz foi realizada com software GenomeStudio (versão 2009.1, Illumina). As amostras foram normalizadas pelo algoritmo de spline cúbica e sondas com todos os sinais inferiores e duas vezes a média dos níveis de fundo foram excluídos da análise. genes diferencialmente expressos foram identificados com o teste de Mann-Whitney diferencial algoritmo de expressão (

P

0,05) e definido para ter uma mudança na dobra-entre grupos maiores do que 1,5. análise do gene ontologia foi feito com o software MetaCore (GeneGoInc. St. Joseph, MI, EUA).

A análise estatística

As correlações entre variáveis ​​foram analisadas pelo teste de Spearman. Os grupos foram comparados utilizando o teste U Mann-Whitney para variáveis ​​contínuas eo teste do qui-quadrado para as variáveis ​​categóricas. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada com a morte do PC como um evento e tempo de acompanhamento como o tempo entre a cirurgia metástases e o mais recente exame de acompanhamento. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences, software SPSS 17.0 (SPSS, Inc, Chicago, EUA). A P-valor menor ou igual a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Altos níveis de mRNA de variantes AR emenda em metástases ósseas CRPC

Transcrições para o ARfl normal e as variantes de splicing AR mais abundantes conhecidos até agora [16]; AR-V1, AR-V7, e AR-V567es, foram detectados e quantificados os seus níveis em peças de tecido não-malignas e GS7-8 de tumores da próstata primários e metástases em ossos amostras, usando análises em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Tabela 3, a ARfl, AR-V1, e Ar-V7 transcritos foram detectados na maioria dos não-maligno, tumor primário, e as amostras de metástases examinadas, enquanto que o transcrito de AR-V567es foi detectado em sete (23%) de metástases ósseas CRPC somente.

Houve uma tendência para níveis mais elevados de ARfl, AR-V1, e AR-V7 mRNA em metástases ósseas HN do que no tecido PC primário, mas as diferenças eram não- significativo (Figura 1). Claramente elevada ARfl, AR-V1 e AR-V7 níveis de transcrição foram no entanto visto nas metástases ósseas CRPC, que mostrou 8, 44, respectivamente 120 vezes maiores níveis medianos do que as metástases HN (

P

≤0.001, Figura 1). O ARfl, AR-V1, e Ar-V7 níveis de mRNA nas amostras de próstata não malignas foram comparáveis ​​para os níveis dos tumores da próstata primários (Figura 1).

Todos os níveis de mRNA foram ajustados para o gene correspondente de arrumação ( RPL13a) os níveis de ARNm, normalizadas para o valor médio para as amostras de tumores primários, e transformadas pelo logaritmo natural. Níveis no tecido da próstata não maligno (

n

= 13), tumor de próstata primário (

n

= 13), metástases ósseas hormonais-naïve (

n

= 10) e metástases ósseas resistente à castração (

n

= 30) amostras são mostrados em branco, cinza claro, cinza escuro, e preto, respectivamente. níveis indetectáveis ​​não são indicados, mas representada por colunas que simbolizam o menor nível mensurável em análise de RT-PCR de cada variante de transcrito.

A expressão de variantes da proteína truncada AR-LBD em metástases ósseas CRPC

níveis de proteínas do AR-Vs foram examinadas utilizando análise Western blot de 13 amostras de metástases ósseas CRPC selecionados aleatoriamente para representar casos com altos níveis de AR V7-mRNA (níveis no quartil superior, Q4), casos com níveis baixos e intermediários de ARNm de AR-V7 (níveis no menor; Q1, e do composto intermédio; Q2-Q3, quartis, respectivamente), bem como níveis detectáveis ​​/não-detectáveis ​​de ARNm de AR-V567es (Figura 2). A linha 22Rv1 celular que se sabe expressar a variante AR-V7 [13], mas também variantes de processamento adicionais [15] serviu como um controlo positivo. Uma amostra da próstata primário com ARNm indetectável AR-V7 serviu como um controlo negativo (Figura 2). As bandas de proteína com os pesos moleculares esperados de cerca de 110 kDa (ARfl) e 80 kDa (presumindo-V1 AR, AR-V7 ou -V567es) foram detectados nas metástases ósseas CRPC, por anticorpos dirigidos contra o domínio N-terminal de AR, ao passo que a 80 kDa AR-Vs não foram detectados usando o anticorpo alvo o domínio C-terminal de LBD (Figura 2A). Os mais intensos 80 kDa foram detectadas em amostras com níveis de ARNm de AR Q4-V7, enquanto metástases ósseas CRPC com níveis mais baixos de ARNm de AR-V7 apresentaram menor a níveis indetectáveis, independentemente dos níveis de ARNm de AR V567es-(Figura 2b) correspondente. Com base em intensidades blot, as proteínas variantes AR constituídas em média 32% do nível de proteína ARfl (intervalo de 0 a 95%,

N

= 13, dados não mostrados). Isto estava em contraste com os rácios correspondentes sobre o nível de ARN onde os transcritos AR-V7 e AR-V567 representados em média apenas 0,4% (gama de 0,03-7%, dados não mostrados) e 1,0% (gama de 0,3 a 1,2%, os dados não mostrado), respectivamente, o nível de ARNm ARfl, de acordo com a diferença dos níveis de CT de RT-PCR. Os nossos resultados indicam portanto que a RA-Vs sem o domínio de LBD são possíveis pós-transcricionalmente estabilizado em metástases ósseas CRPC em relação ao ARfl.

A) Os anticorpos (N-20 e PG-21) o N- segmentação domínio do terminal (NTD) da AR detectado as variantes ARfl e AR (AR-V; presumindo AR-V1, AR-V7, e /ou AR-V567es). O anticorpo C-19 de segmentação LBD detectado o ARfl de ~110 kDa, mas não as variantes de AR-LBD truncado de cerca de ~ 80 kDa. B) Análise de metástases ósseas CRPC que representam amostras com níveis elevados de ARNm de AR-V7 (níveis no quartil mais alto, Q4, de acordo com a análise de RT-PCR), assim como amostras com níveis AR V7-mRNA em Q1, Q2, e Q3, usando o anticorpo N-20. 22Rv1 extrato celular serviu como controlo positivo para ARfl e ~ 80 kDa variantes AR e uma amostra de câncer de próstata primário (P) serviu como controle negativo para as variantes AR.

A expressão de AR-V7 e AR- mRNA V567es está associada a um mau prognóstico

Os AR-V1, AR-V7, e mRNA ARfl níveis foram correlacionados em todas as amostras analisadas (dados não mostrados,

n

= 66) e em o sub-grupo de metástases ósseas CRPC (AR-V1 vs. AR-V7;

Rs

= 0,91, P

Restaurant 0,001, AR-V1 vs. ARfl;

Rs

= 0,47,

P Art 0,01, e AR-V7 vs. ARfl;

Rs

= 0,58,

P Art 0,001,

n

= 30). metástases ósseas com AR-V567es detectável mRNA tinha cerca de 3 vezes mais elevados ARfl mRNA nível médio do que as outras metástases CRPC (

P

= 0,004).

Pacientes com níveis AR V7-mRNA em Q4 tinha sobrevivência específico do cancro significativamente mais curto após a cirurgia metástases do que os outros pacientes CRPC e um resultado semelhante foi observado para os pacientes com níveis detectáveis ​​de AR-V567es em comparação com o repouso (Figura 3A-B). Dez pacientes com metástases ósseas CRPC ou foram incluídas no sub-grupo Q4 AR-V7 e /ou tinham níveis detectáveis ​​de AR-V567es, e são ainda referidos como doentes de alto AR-V. Os pacientes de alto AR-V tinha um tempo médio de sobrevivência após a cirurgia metástase de apenas 2 meses em comparação com 8 meses para o resto dos pacientes CRPC (Figura 3C). Não foi encontrada associação entre os níveis e sobrevida após a cirurgia metástases (dados não mostrados) ARfl ou AR-V1 mRNA.

Os pacientes com A) AR-V7 [14] níveis de mRNA no quartil mais elevado (Q4), B ) detectáveis ​​AR-V567es [16] níveis de mRNA e C) detectável AR-V567 e /ou AR-V7 Q4 (AR-V alta) os níveis de mRNA apresentaram sobrevida mais curta do que outros pacientes com doença CRPC.

metástases com altos níveis de variantes AR emenda mostrar intensa imunomarcação AR nuclear

Como já encontrado anteriormente que as pontuações de positividade alta AR foram associados com uma particularmente baixa sobrevida após a cirurgia metástases e agora que AR-V pacientes de alto teve um mau prognóstico, que queria examinar se a pontuação coloração alta AR foi associada com níveis de AR-Vs. Os altos metástases AR-V todos tinham pontuações de coloração alta AR em comparação com outras metástases ósseas CRPC que mostraram coloração variável que varia de fraco a forte (Tabela 2,

P

= 0,02).

Além disso , AR-V altos metástases mostrou significativamente menor pontuação PSA imunocoloração (Tabela 2,

P

= 0,038) e tendências de ter frações mais elevados de proliferação e células epiteliais tumorais por apoptose (

P

= 0,12 e

P

= 0,085, respectivamente) do que outras CRPC metástases (Tabela 2).

A expressão de variantes de splicing AR está associada com perturbadas

de controlo do ciclo celular

O perfil de expressão do gene o sub-grupo de AR-V metástases ósseas foi elevada em comparação com o perfil de outras CRPC metástases ósseas, utilizando uma matriz de ADNc baseada Ilumina 48803 incluindo sondas de genes. Cerca de 17.700 sondas foram definidos a dar sinais acima do fundo nas metástases ósseas PC. Cento e noventa e cinco (195) sondas foram diferencialmente expressos entre as metástases ósseas alta RA-V e outras CRPC metástases ósseas de acordo com uma dobra de mudanças de pelo menos 1,5 em-entre os grupos (

P

0,05) e mais incluídos na análise ontologia para a avaliação dos processos enriquecidos. Muitos (60) dos produtos do gene de diferenciação foram propostos para interagir directamente através da AR, C-MYC, e proteínas CDK1 (Figura 4 e Tabela S1). C-MYC e CDK1 são dois principais reguladores do ciclo celular e, consequentemente, os 5 principais redes de processo enriquecido encontrados nas metástases AR-V alta óssea foram; Celular Núcleo ciclo, a fase do ciclo celular S, ciclo celular mitose, Citoesqueleto microtúbulos do fuso e do ciclo celular G2-M. C-MYC e CDK1 são também factores pró-sobrevivência inibem a apoptose e, além disso, encontramos um aumento níveis de transcrição de proteínas anti-apoptóticas survivina e BCL2L12 na RA-V elevado em comparação com as outras CRPC metástases ósseas (Figura 4). Notavelmente, no entanto, os níveis de outros reguladores chave da apoptose, tais como receptores de morte, Bax, caspases BCL2, e não foram significativamente alteradas e, além disso, as redes de processos relacionados com a apoptose não foram significativamente enriquecida em nossos dados (dados não mostrados). Várias transcrições gene conhecido por ser regulada positivamente pela AR foram encontrados em níveis elevados nas metástases altas AR-V, como o CDK1, CYCLINA2, HSP27, C-MYC, UGT2B17, CDC20, UBE2C, enquanto outros, como KLK3 (PSA) , KLK2, NKX3-1, FKBP5 TMPRSS2 e não foram (Figura 4).

círculos vermelhas indicam maior e círculos indicam os níveis de transcritos azul inferiores na RA-V elevada do que em outras CRPC metástases ósseas. Note-se que muitos dos produtos de genes de diferenciação estão interagindo diretamente via AR, C-MYC e CDK1.

Discussão

Este documento descreve, pela primeira vez, o padrão da expressão LBD-truncado splicing AR variantes de AR-V1, AR-V7 [14] e AR-V567es [16] em metástases ósseas de PC em pacientes e, além disso, que os níveis dessas variantes são aumentados em metástases ósseas CRPC e que a expressão do AR -V567es e /ou níveis muito elevados de AR-V7 é encontrado em indivíduos com prognóstico particularmente ruim.

Vários estruturalmente diferentes, constitutivamente ativa AR-Vs foram identificados até agora em amostras de PC clínicos [10], [11], [13], [14], [16], [17], e nós aqui mostram o enriquecimento de variantes AR emenda truncado-LBD em metástases ósseas PC. Em contraste com a Sun e colegas de trabalho, que encontraram o AR-V567es ser a variante de processamento mais abundante examinou [16], encontramos o AR-V7 a ser mais comumente expressa do que o AR-V567es no CRPC. Esta disparidade poderia ser tecnicamente explicado por diferentes sensibilidades das técnicas de RT-PCR utilizados, mas poderia também refletem heterogeneidades na expressão variante AR emenda entre as diferentes origens de tecidos como nós examinamos CRPC no osso, enquanto Sun et al incluiu CRPC de vários sites. Nós também importante notar-se que várias das metástases ósseas CRPC examinados (Ar-V casos elevados) expressa proteínas AR LBD-truncado em níveis comparáveis ​​aos níveis de proteína ARfl, embora os correspondentes transcritos de variantes de AR foram encontradas em níveis relativamente muito mais baixas do que o mRNA ARfl. A estabilização pós-transcricional de variantes AR emenda em relação ao ARfl em metástases ósseas CRPC seletivos, é plausível, embora o mecanismo para este não é conhecido.

O mau prognóstico de pacientes com metástases CRPC expressando o AR- V567es e /ou níveis elevados de transcritos de AR-V7 provavelmente está relacionada com a actividade constitutiva postulado destas variantes. O AR-V567es contém a sequência de núcleo de localização (NLS) da região de charneira no exão 4 [16] e o AR-V7, em contraste com AR-V1, têm sido postuladas para conter um NLS no seu exão críptica [14]. Por conseguinte, o AR-AR-V7 e V567es foram mostrados para translocar para o núcleo, ligam-se a elementos responsivos AR, e activar /suprimir a transcrição do gene

In vitro

sem a necessidade de ligação do ligando [14], [ ,,,0],16], [17]. Curiosamente, Watson e colega de trabalho mostrou recentemente um aumento instantâneo de níveis AR-V7 e Ar-V1 ARNm em modelos de xenoenxerto para PC após a castração, bem como um decréscimo após a suplementação de androgénio, indicando que alguns AR-Vs pode ser directamente regulada pela androgénios e, portanto, provavelmente induzida em pacientes logo após terapia castração [17]. É tentador especular que essas e outras AR-Vs serão selecionados para também durante o desenvolvimento da doença resistente à castração e, assim, contribuir para a recaída de terapias destinadas a reduzir os níveis de esteróides ou ligando de ligação ao AR normal. Assim, encontramos níveis mais elevados das variantes AR emenda em CRPC do que em metástases ósseas HN. Os transcritos de AR-V1 e AR-V7 foram no entanto detectados também numa parte substancial dos espécimes de prostatectomia radical não-malignas e malignas, embora a um nível inferior do que nas metástases ósseas, e outros mostraram que os níveis de AR-V7 ( AR3) em tumores de próstata primários eram previsíveis para o resultado após a prostatectomia radical, com um tempo mais curto para a recaída química em indivíduos com níveis mais elevados [13], [14]. A razão para isto não é conhecida, mas indica que constitutivamente activa AR-Vs poderia ser parte da fisiologia normal da próstata e que uma selecção das variantes ocorre durante a progressão do PC.

O enriquecimento de estruturalmente diferente, constitutivamente activa AR-Vs durante o desenvolvimento de metástases CRPC assinala eventos moleculares complexos e heterogêneos que por diferença significa parecem garantir a ativação AR na ausência de andrógenos testiculares. Os pacientes que expressam constitutivamente activa AR-Vs, a longo prazo, provavelmente não beneficiar de terapias anti-andrógeno com o objectivo de reduzir a síntese de esteróides, tais como a castração cirúrgica, os análogos de LHRH, ou o abiraterona agente recentemente introduzida que inibe a síntese de CYP17 e, assim, esteróides não apenas no testículo, mas também nas glândulas supra-renais e no tecido do tumor [19], [20]. Surpreendentemente, o MDV3100 antagonista romance AR visando o LBD do ARfl e actualmente em ensaios clínicos para CRPC [21], [22] foram encontrados para inibir o crescimento resistente à castração induzida pela expressão de constitutiva AR-V7 em um modelo animal para PC [17]. Isso é encorajador como antagonistas romance AR inibir a translocação do receptor para o núcleo, portanto, pode ter efeitos terapêuticos também em pacientes que expressam constitutivamente ativa AR-Vs. Nem todos os pacientes CRPC, contudo, responder às abiraterona e MDV3100 drogas, e até mesmo aqueles que posteriormente recaída dentro de poucos meses [20], [22]. Se este tipo de terapia é a resistência relacionada com a expressão de constitutivamente activa AR-Vs em metástases ósseas (o principal alvo para a terapia) não é actualmente conhecida e não pode ser determinado até que estudos clínicos começa a incluem biópsias de metástases ósseas. Além disso, os agentes terapêuticos que inibem os seus efeitos a jusante AR-Vs ou a necessidade de ser desenvolvida [23], [24]. Outra explicação possível para a resistência à terapia de castração, é a presença de células tumorais negativas AR, AR e, portanto, de by-pass durante a progressão tumoral [25]. Completa falta de expressão AR é encontrado apenas em uma pequena sub-população de metástases ósseas CRPC, mas AR células tumorais negativas espalhadas entre o positivo são encontrados na maioria das metástases CRPC osso [3] e, portanto, a ênfase da necessidade também para terapias não confiando apenas numa AR funcional.

nas amostras clínicas examinados no presente estudo, os níveis detectáveis ​​de AR-V567es e /ou níveis elevados de transcritos AR-V7 foram associados com níveis desregulados de genes controlados por AR conhecidos , mas não especificamente de cerca de androgénio genes regulados clássicos tais como KLK3 (PSA), TMPRSS2, e FKBP5 que foram induzidas pela sobre-expressão do AR-AR-V7 ou V567es em células LNCaP

in vitro

[14] , [16]. Assim, os casos de alto AR-V apresentaram menor imunocoloração PSA do que outras metástases CRPC. Em vez disso, descobrimos que os níveis de transcrito do gene diferenciadas AR-V metástases ósseas de alta outras CRPC metástases ósseas, indicando uma elevada actividade de C-MYC e CDK1, e um controlo do ciclo celular perturbado relativamente G1-S, bem como a transição G2-M, apesar de um não- aumento significativo na rotulagem Ki67. O desenvolvimento de CRPC foi caracterizada por uma proliferação desequilibrada a proporção de apoptose e a resistência a estímulos apoptóticos [26], [27]. Na fase tardia da doença examinados neste estudo, não no entanto, com algumas exceções, encontrar quaisquer sinais claros de expressão alterada de genes reguladoras da apoptose ou uma maior desregulamentação do processo de apoptose em AR-V alta em comparação com outros CRPC metástases ósseas. Com base nos nossos dados, que não são capazes de discriminar se o controlo do ciclo celular perturbado encontrados nas metástases óssea elevada AR-V é realmente relacionado com a expressão do AR-VS, o ARfl, ou apenas associada com a doença particularmente avançada nesses casos CRPC.