Abstract

queratina 23 (KRT23) é fortemente expresso em adenocarcinomas do cólon, mas ausente na mucosa do cólon normal. Matriz com base de perfis de metilação de 40 amostras de cólon mostraram que o promotor de KRT23 foi metilada em mucosa de cólon normal, enquanto que na maior parte dos adenocarcinomas hypomethylated. Metilação do promotor correlacionada com a expressão ausente, enquanto que o aumento da expressão em amostras de tumor KRT23 correlacionada com a hipometilação do promotor, tal como foi confirmado por sequenciação de bissulfito. Desmetilação induzida expressão KRT23

in vitro.

Perfil de expressão shRNA mediada knockdown KRT23 estável em linhas celulares de cancro do cólon mostrou que a depleção KRT23 moléculas da replicação do ciclo celular e DNA, recombinação e reparação afetados.

In vitro

análises confirmado que a depleção KRT23 diminuíram significativamente a proliferação celular de células SW948 e LS1034 e diminuiu marcadamente a expressão de genes envolvidos na resposta a danos no ADN, principalmente moléculas de cadeia dupla via de reparação quebra de recombinação homóloga. KRT23 knockdown diminuiu a expressão transcrição e proteínas de moléculas fundamentais como, por exemplo MRE11A, E2F1, RAD51 e BRCA1. Knockdown de KRT23 prestados células cancerígenas do cólon mais sensíveis à irradiação e proliferação das células KRT23 empobrecido em comparação com células de controlo irradiados reduzidos

Citation:. Birkenkamp-Demtröder K, Hahn SA, Mansilla F, Thorsen K, Maghnouj A, Christensen R, et al. (2013) Keratin23 (KRT23) Knockdown diminui a proliferação e afeta o DNA danos resposta das células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 8 (9): e73593. doi: 10.1371 /journal.pone.0073593

editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 25 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Birkenkamp-Demtröder et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações da John e Birthe Meyer Foundation, a Fundação Lundbeck, o Nordisk Fundação Novo e do Conselho de Investigação dinamarquês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é responsável por aproximadamente 10% do total de casos de câncer em todo o mundo com um cinco anos de sobrevida global de cerca de 50% [1]. O diagnóstico precoce e um tratamento melhor do CRC exige a identificação de novos biomarcadores, bem como insights sobre os mecanismos moleculares da carcinogênese colorretal.

Existem dois principais subgrupos moleculares do cancro do cólon, microssatélite instável (MSI) e estável microssatélite (MSS ) [2], em que os tumores MSI representam aproximadamente 15% do total de incidência [3]. tumores instáveis ​​microssatélites mostrar mutações ou alterações epigenéticas nos genes de reparo que levam a alterações no DNA microssatélites (short sequências de DNA repetida). Evidências crescentes sugerem que os tumores MSI estão associados com melhor prognóstico [4] e que os pacientes com MSI não podem beneficiar de quimioterapia adjuvante com fluorouracil [5] [6].

Várias anormalidades epigenéticas foram descritas para CRC [ ,,,0],7]. metilação aberrante no cólon pode ser já observada em lesões pré-malignas precoces, bem como na mucosa aparência normal de tumor adjacentes. activação de genes com base em epigenética desmetilação de ADN ou hipometilação da região promotora está envolvido na iniciação e progressão do cancro [7].

queratinas do filamento intermediário proteínas formadoras de células epiteliais. Hoje, 54 queratinas de mamíferos são conhecidos, 28 do tipo I (ácido) e 26 do tipo II (básico-neutro) queratinas [8]. Vários estudos têm fornecido evidências para o envolvimento activo de queratina na proliferação de células de cancro, invasão e metástase, assim como na capacidade de resposta de tratamento. Além disso, tem sido sugerido para explorar ainda mais o papel de queratinas como reguladores multifuncionais de tumorigénese epitelial [9].

queratina 23 (

KRT23

) pertence ao Tipo I queratinas ácida [10] . A transcrição KRT23 verificou-se ser altamente induzida na linha celular de cancro pancreático humano AsPC-1 após tratamento com um inibidor da histona-desacetilase (HDACi) [11]. Além disso, K23 foi identificada como um antigénio associado a tumor em soros de pacientes com carcinoma hepatocelular [12]. Em estudos anteriores, foi identificada a transcrição e proteínas KRT23 K23 para ser fortemente regulada positivamente em adenocarcinomas de cólon em comparação com a mucosa normal [13] [14]. Nem a transcrição KRT23 nem a proteína K23 foi demonstrado ser um marcador de prognóstico no cancro do cólon; No entanto, observou-se uma tendência de que os pacientes com a fase II adenocarcinomas do cólon com níveis de transcrição elevados KRT23 parecia ter uma menor taxa de recorrência. A fosfoproteína K23 acumulado no Golgi da maioria dos tumores do MSS, enquanto a maioria dos tumores MSI mostraram expressão citoplasmática menor ou foram completamente negativos para a expressão da proteína K23 [14]. A sobre-expressão de KRT23 reduziu a viabilidade celular de linhas celulares de MSI enquanto ele não teve impacto significativo sobre as funcional linhas celulares MSS [14]. Promotor análise de ligação identificados vários genes que correlacionam com a expressão KRT23 em adenocarcinomas. Recentemente, a proteína induzível Smad4 K23 foi identificada para interagir com as queratinas K8 e K18, as proteínas de choque de calor 60 e 70, plectina 1, bem como 14-3-3epsilon e gama [15], sugerindo um papel importante para o K23 em processos reguladores . Seu papel regulador pode também ser suportado por muito recentes achados de Starman et al identificação KRT23 como um potencial biomarcador para esteatohepatite [16].

O objetivo deste estudo foi identificar um mecanismo regulador para a expressão KRT23. Além disso, pretendemos identificar genes alvo a jusante e vias associadas mediante KRT23 knockdown, para elucidar o impacto do esgotamento KRT23 sobre as funções celulares e moleculares das células cancerosas.

Materiais e Métodos

informado por escrito consentimento foi obtido de todos os pacientes e todos os estudos foram aprovados pelos Comitês Região Dinamarca Central sobre Ética Biomédica Research.

Whole Genome Analysis metilação

o DNA genômico de criosecções série foi extraído utilizando o kit de purificação de ADN Puregene (Gentra Systems, Plymouth, MN). Quando necessário, as biópsias tumorais foram macroscopicamente aparado para enriquecer a fracção de células neoplásicas para um mínimo de 60% antes do isolamento do ADN. a percentagem de células do cancro mediana foi de 80%. Um micrograma de DNA foi modificado com bissulfito utilizando EpiTect Bissulfito Kit (Qiagen, Copenhaga, Dinamarca) utilizando o EZ-96 Metilação de DNA D5004 (Zymo Research, Orange, CA) para sequenciação de microarranjos e bissulfito. Bissulfito de DNA modificado foi genoma inteiro amplificado e hibridado com Infinium HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) durante a noite, como descrito pelo fabricante. BeadChips foram digitalizados com um instrumento BeadXpress Reader (Ilumina) e os dados analisados ​​usando grânulo Estúdio A metilação Módulo de Software (Ilumina) como descrito em detalhe em [17]. níveis de metilação foram fornecidas em valores beta, com um valor beta de 0 correspondente à ausência de metilação e 1 corresponde a metilação completa. Para comparação de estado de metilação em função dos dados de expressão, as intensidades de expressão log2 foram obtidos pelo perfil das mesmas amostras de expressão de microarray, as amostras foram normalizadas por RMA e transcritos intensidades log2 5 foram considerados como “não expressa”

Sequenciação Bissulfito.

Bissulfito modificado DNA foi amplificado utilizando iniciadores desenhados com MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html). Os produtos de PCR foram purificados em gel e clonados utilizando TOPO TA Cloning Kit para ® Sequencing (Invitrogen, Taastrup, Dinamarca). A amplificação por PCR para a sequenciação foi realizada diretamente sobre as colónias com iniciadores M13 (Tecnologia DNA, Risskov, Dinamarca) e TEMPase DNA polimerase (Amplicon, Skovlunde, Dinamarca). Para cada gene, 10 clones foram seleccionados aleatoriamente e sequenciados utilizando Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit e um 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Em pormenor, analisou-se uma sequência compreendendo 253 pb do início da transcrição de sobreposição (1) e o primeiro exão KRT23. O ADN genómico foi isolado a partir de dois conjuntos diferentes, 23 de biopsia do tumor do doente (4 amostras de mucosa normal, adenomas 3, 5 e 12 MSI MSS) e as células tratadas AZA células HCT116 descritos acima utilizando o Puregene Gentra DNA Purification Kit (Qiagen). ADN foi convertido com bissulfito utilizando o Kit de ADN MethylEasy Bissulfito modificação (Diagenode)

O amplicon de 253 pb foi amplificado por PCR KRT23 com TEMPase Hot Start DNA Polymerase (amplicon) utilizando uma mistura contendo os iniciadores F1 (C):. 5 ‘ – GTGGTTTTCGTTTTTAGATTGTTT-3 ‘e f1 (t) e 5′-GTGGTTTTTGTTTTTAGATTGTTT R1:5′- TCAAAACCAAACAACCCTAACCTA-3’. Os produtos de amplificação foram purificados em gel (gel de 11Band Purification Kit; GE Healthcare) e subclonado no vector pCR4-TOPO (Invitrogen) foram de 12-16 clones de cada experiência foram sequenciados utilizando os iniciadores M13 para frente. Para visualização do estado de metilação, foram utilizados os seguintes softwares:. https://quma.cdb.riken.jp/

Colon linhas celulares

Obtidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC-LGC normas, Borås, Suécia) ou obtido a partir do laboratório de Hahn foram re-autenticado através da análise STR [18] utilizando o ID do sistema celular (G9500, Promega, Nacka, Suécia), os produtos foram analisados ​​num Applied-Biosystems3130 Genetic Analyzer. Nenhuma contaminação por micoplasma foi detectada utilizando detecção de micoplasma baseada em PCR aninhada. linhas celulares de cancro do cólon neste estudo foram HCT116 (MSI), DLD1 (MSI), SW480 (MSS, p53 mutante), SW948 (MSS, Dukes ‘tipo C, grau III, tumorigénico, p53 mutante), LS1034 (MSS, Dukes C , mutações em p53 (G245S), a APC (E1309fs * 4) e KRAS (A146T). A linha celular de rim embrionário humano HEK293 utilizado para a sobre-expressão E2F1 também foi re-autenticado através de análise STR.

As células foram colhidas por raspando os frascos com 1 ml de tampão de lise e o ARN total foi extraído utilizando o kit de ARN total GenElute Mammalian Miniprep (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, N ° de Cat RTN350) de acordo com as instruções do fabricante e a integridade de ARN foi avaliada por um . Bioanalyzer (RIN = 9,9) RNA foi analisado em U133plus2.0 ou matrizes ExonST1.0 (Affymetrix), análise de comparação foi realizada utilizando software MAS5.0 Sondas acompanhados por uma chamada Inc /Dec e uma razão log2 | . 0,5 |. foram incluídos, mas excluída quando listado como ” ausentes ” Genes foram anotados usando a anotação Affymetrix NETAFFX (NCBI Construir 36,1, netaffx-build = 28). dados de matriz de exão foram quantil-normalizado usando o algoritmo Exon16 com transcrições do núcleo (17881 transcrição) e sondas fundo antigen�ico ou o console expressão iterPLIER. Toda a análise dos dados foi realizada por meio de 10 software GeneSpring GX (Agilent).

As amostras de tecido do cólon

O RNA total foi purificada a partir criosecções de série com conteúdo tumor mais de 75% o uso de colunas RNeasy MinElute após a fabricante de instruções (Qiagen). A boa qualidade do RNA (NIR 7) foi verificada por análise no Bioanalyzer 2100 (Agilent). Análise em U133A e U133plus2.0 GeneChips e a normalização dos dados foi realizada como previamente descrito (10). Expressão valores são dados em “log2”. Para Exão 1,0 ST matriz analisa amostras foram marcadas de acordo com o GeneChip Total Transcrição (WT) Sentido Alvo Ensaio de etiquetagem humano e hibridado com Exão 1,0 ST matrizes (Affymetrix) como previamente descrito (11). dados de matriz de exão foram quantil-normalizado usando o algoritmo ExonRMA16 com transcrições do núcleo (17881 transcrição) e sondas fundo antigen�ico. Toda a análise dos dados foi realizada por meio de 10 software GeneSpring GX (Agilent).

cDNA síntese |

In vitro transcrição e rotulagem de cRNA, hibridação a GeneChips Affymetrix U133plus2.0 e digitalização destes foi realizada utilizando procedimentos padrão, ver a referência (12). Comparação análises dos dados da linha celular foram realizadas utilizando software MAS5.0 Affymetrix. Filtros aplicados: As sondas foram incluídos se a comparação listou uma chamada Inc /Dec acompanhado por uma razão log2 0,5 ou -0.5 (limiar de log 0,5 ou log2 -0.5 foi arbitrariamente definida). As sondas foram excluídos da análise, se eles foram listados como ” ‘ausente’ ‘e /ou tinham valores de expressão log2 4 em ambas as amostras comparadas. Genes foram anotados usando a anotação Affymetrix NETAFFX (NCBI Construir 36,1, netaffx-build = 28).

5-aza-2′-desoxicitidina Tratamento de células cancerígenas do cólon HCT116

negativo

KRT23 ou DLD1 células de cancro do cólon foram tratados com 2,5, 5 ou 7,5 uM 5′-aza-dC em DMSO ou CH3COOH (Sigma-Aldrich, Copenhaga, Dinamarca) a cada 24 horas durante 2 dias, seguido por um dia de reconstituição, tal como descrito na literatura.

transcrição reversa quantitativa PCR (RTqPCR) ARN

foi extraído a partir de células de cancro do cólon HCT116 tratados com diferentes concentrações de AZA utilizando colunas RNeasy de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). ADNc a partir destas amostras foi sintetizado tal como descrito (13), utilizando oligo-dT em vez de iniciadores aleatórios. RTqPCR análise foi realizada em triplicado em um Fast System ABI 7500 tempo real (Applied Biosystems) utilizando o ensaio de sonda TaqMan ® Ker23 ID Hs0021096_m1 como recomendado pelo fabricante. Os dados foram normalizados contra a ubiquitina C (UBC), como descrito anteriormente [19].

Preparação shRNA-vector, Lentivírus Produção e Lentivirus Infecção

preparação shRNA-vector, foi realizada a produção de lentivírus e infecção lentiviral como previamente descrito (9). Para cada uma das três linhas de células SW480, SW948 e LS1034, uma linha celular de controlo estável contendo um vector lentiviral vazio e cinco knockdowns estáveis ​​diferentes KRT23 específicas foram estabelecidas; os dois mais eficiente sh-sh 1010 e-1506 foram utilizadas para estudos posteriores. Em resumo, as construções de vector shRNA foram produzidos com Puro pLKO.1 (gentilmente fornecida por Sheila Stewart, Universidade de Washington, EUA) contendo uma sequência de enchimento de 1,8 kb no lugar da cassete shRNA. O plasmídeo foi duplamente digerido pLKO.1 por EcoRI e AgeI durante 1 hora para libertar o fragmento de 1,8 kb de enchimento. Os fragmentos de ADN foram em seguida separadas utilizando um gel de agarose a 1%. O 7,1 kb banda EcoRI /AgeI foi excisada e o ADN foi extraído utilizando Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Os pares de oligonucleótidos sentido e anti-sentido em gancho de cabelo foram obtidos a partir de Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha). Para formar o shRNA cassete de 5,4 ^ g de cada oligonucleótido foi recozido num volume de 100 ul. O tampão de recozimento foi 1x tampão de ligase de T4-ADN (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). A mistura de hibridação foi incubada num termociclador (ADN Motor Opticon®2 reciclador MJ Research, Waltham, MA, EUA), arrefecendo gradualmente a partir de 99 ° C a 16 ° C ao longo de 70 min. A ligação foi realizada em 20 uL de volume de reacção usando 1 unidade de ligase de ADN de T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 100 ng de ADN do vector em uma proporção de vector-inserção 01:04 molar e incubou-se a 16 ° C durante a noite. 2 ul de mistura de ligação foi usada para transformar 40 ul de células competentes TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) utilizando um procedimento de electroporação padrão. As células transformadas foram recuperados em 0,8 ml de LB durante 1 h a 37 ° C e semeados em ampicilina (100 jig /ml) contendo placas de agar. preparações de DNA de plasmídeo foram feitas a partir de culturas durante a noite de colónias individuais utilizando o puro Yield® plasmídeo Midiprep System (Promega, Mannheim, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante. A sequência correcta foi verificada através de sequenciação de ciclo padrão para cada cassete shRNA. Os lentivírus foram feitos por transfecção de células de empacotamento (HEK293T) com um sistema 3-plasmídeo. ADN para transfecções foi preparado por mistura de 12 ug, 1 ug pCMVΔRR8.2 phit G e 12 ug de ADN plasmídeo pLKO.1 com 62 ul de 2 M CaCl

2 em um volume final de 500 ul. Subsequentemente, 500 ul de tampão de fosfato 2 × HBS foi adicionado gota a gota à mistura e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. A mistura de 1 ml de transfecção foi adicionado a células confluentes HEK293T 50% semeadas no dia anterior em uma placa de 10 centímetros. As células foram incubadas durante 16 h (37 ° C e 10% de CO

2), e o meio foi mudado para remover o restante reagente de transfecção. Os sobrenadantes lentivirais foram recolhidos a 36 horas pós-transfecção e para cada infecção 3 sobrenadante ml contendo 4 ug /ml de polibreno foi imediatamente utilizado para infectar células alvo semeadas no dia anterior em placas de 6 cm bem para atingir 70% de confluência no dia da infecção. As células foram incubadas durante 24 h, e o meio foi mudado para remover partículas de vírus. Para controlar a taxa de infecção uma infecção paralelo sob as condições idênticas de segmentação da mesma linha celular foi preparada utilizando um vector lentiviral de controlo da expressão de GFP (pRRLU6-cPPT-pSK-GFP, gentilmente fornecida por S. Stewart). 6 dias após a infecção de 2 ug /ml de puromicina foi adicionado ao meio de cultura de células. RT-PCR quantitativa foi usada para validar knockdown eficiente e os dados foram normalizados contra a GAPDH, HPRT1 ou PPIA. O ARN total a partir de linhas de células transfectadas de forma estável foi isolado por extracção com fenol ácido. O ADNc foi sintetizado utilizando 2 ug de ARN total, oligo (dT)

18 iniciadores e SuperScript ™ II RNase H

– transcriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) reversa seguindo o protocolo do fabricante e diluídas até um volume final de 50 ul com tampão 1x primeira cadeia. Intron conjuntos de iniciadores abrangendo de qRT-PCR foram desenhados utilizando o iniciador expresso software 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). qRT-PCR foi realizada utilizando uma mistura reaccional de SYBR Green I contendo Tris-HCl 75 (pH 8,8), sulfato de amónio 20 mM, 0,01% (v /v) de Tween 20, cloreto de magnésio 2 mM (todos da Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha), 1 ul de uma diluição de 600 vezes de SYBR Green I (BioWhittaker, Rockland, mE, EUA), 2,5 U de Taq polimerase (NEB, Frankfurt am, Alemanha), dNTP 0,2 mM (Promega, Mannheim, Alemanha) e 0,2 uM de iniciador directo e inverso (Qiagen, Hilden, Alemanha) num volume de reacção final de 20 ul. As reacções foram realizadas num termociclador de ADN Motor Opticon®2 (MJ Research, Waltham, MA, EUA). As condições de ciclo consistiu de 3 min de desnaturação inicial a 94 ° C e 40 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg e 80 ° C durante 3 seg. A fluorescência foi medida no último passo de cada ciclo. curvas de fusão foram obtidos após cada ensaio de PCR e mostrou produtos de PCR individuais. cDNAs foram executados em triplicado, non-RT (sem transcriptase reversa) e no-modelo controles foram executados em duplicata. eficiências de PCR foram determinados utilizando diluições em série de um ADNc derivado da linha de células SW480 níveis de expressão para os genes de interesse e para arrumação genes foram medidos no PCR independente é executado. rácios de expressão foram calculados como descrito por M. Pfaffl [20] usando a média geométrica expressão dos genes housekeeping GAPD, HPRT1 e PPIA para normalizar os dados de expressão para o gene de interesse.

Western Blotting

transferência de Western foi realizada como previamente descrito [21]. O anti-K23 anticorpo policlonal de coelho, descrito em pormenor em [14], foi utilizado numa diluição 1:500 e 1:1000. Um anticorpo monoespecífico foi gerado por afinidade de purificação contra os CKWHQQRDPGSKKDYS peptídicos, posição 106-120 na sequência proteica NP_056330.3 (Eurogentec, Bélgica). O anticorpo monoespecif ico, anti-K23 foi usado numa diluição 1:150 por western blotting. foi utilizado BioRad “All azul”, como marcador de peso molecular, o anticorpo monoclonal da beta-actina (# A-1978, clone AC-15, Sigma-Aldrich Denmark A /S) diluído para 0.05μg /ml foi usado como controlo de carga. anticorpo monoclonal de rato anti-humano MRE11A (ab214, Abcam, Reino Unido, lote 912394) foi usado em diluições 1:500-1:1000, RAD51 monoclonal de ratinho anti-humano (H-92) (sc-8349, Santa Cruz, EUA, muito E0610) num 1:100 diluição, rato monoclonal BRCA1 anti-humana (MS110) (ab16780, Abcam, Reino Unido, muito GR3646-1) em uma diluição 1:200. O rato monoclonal anti-E2F1 era uma simpática oferta do Prof. Kristian Helin, BRIC, Copenhagen, Dinamarca e foi utilizado em uma diluição de 1:05. Extractos de células HEK293 que sobre-expressam-E2F1 recombinante marcada com HA a partir do vector de expressão pCMVHA-E2F1 foram usadas como controlo [22].

Microscopia de imunofluorescência

As células foram semeadas em lâminas de câmara 16 poços ( . Nunc, vidro gato No. 178.599; nenhuma fluorescência endógena), fixadas em metanol frio (-20 ° C) e coradas com os seguintes anticorpos: anticorpo anti-K23 policlonal de coelho (1:500) (11), anticorpo monoclonal de ratinho anti-Ki67 (1:100, DAKO Cytomation), anti-E2F1 não diluído, anti-MRE11A 1:1000, anti-RAD51 01:50 e anti-BRCA1 1: 200. Os anticorpos secundários utilizados foram AlexaFlour 488 IgG de cabra anti-coelho altamente cruzada adsorvido (1:2,000;. Mol Probes Inc., Eugene, OR) ou AlexaFlour 488 IgG de cabra anti-ratinho altamente cruzada adsorvido (1:2,000; Mol. Probes Inc., Eugene, OR). Hoechst 33342 foi usado para manchas nucleares e lâminas foram montadas com fluorescência de montagem Médio (DakoCytomation) e uma lamela (Nunc, Cat No. 171080). As imagens foram adquiridas com um Axiovert 200 M (Zeiss MicroImaging, Inc.).

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

dados de expressão Microarray normalizados com RMA (Robust Multichip Médio) foram submetidos ao IPA, versão 8.8. Dados abaixo desse limiar arbitrariamente conjunto de lt log2 4.0 foram excluídos da análise, intensidades log2 de log2 5 foram considerados como expressão ausente. Expressão valores foram normalizados em torno de zero. relações normalizadas dadas como (-Inf, -1] e [1, + INF) foram submetidos ao IPA.

Proliferação Estudos

A viabilidade e proliferação de linhas de células do cólon estavelmente transfectadas com sh-RNA contra KRT23 foi avaliada por um ensaio MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] brometo de 2,5-difeniltetrazólio) como uma função de metabolismo celular de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). A absorvância a 550 nm /690 nm foi medida em diferentes pontos de tempo. A proliferação de células de cancro do cólon foi avaliada pelo ensaio de CyQUANT® NF de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). intensidades de fluorescência foram medidos com um Leitor de Microplacas ™ HT Sinergia (Biotek, Alemanha), utilizando excitação a 485/20 nm e detecção de fluorescência a 528/20 nm. citotoxicidade celular foi avaliada por um ensaio de LDH-(lactato desidrogenase) de acordo com as instruções do fabricante (Kit de Detecção de Citotoxicidade, Cat. No. 11644 793001, Roche Diagnostics, Hvidovre, Dinamarca). monitoramento sem rótulo de proliferação e viabilidade ao longo de um intervalo de vários dias foi realizada em 96 poços E-placas em um RTCA (monitoramento em tempo real das células) SP único instrumento Placa ou 16 poços E-chapas ou placas CIM (invasão celular e migração) num instrumento Placa DP dupla (Roche). Adesão foi monitorada através de e-chapas em intervalos de 1-5 minutos nas primeiras 1-6 horas após a semeadura. A proliferação foi monitorado usando E-chapas em intervalos de 15 min dentro de períodos de 1-120 horas, semeando 4000-16000 células por poço, respectivamente. As análises foram realizadas em triplicado e os resultados foram validados por ensaios convencionais. A migração celular em placas de CIM foi monitorizada em duplicados em intervalos de 1 hora, dentro de períodos de 2-48 h horas, semeando 40.000-60.000 células por poço. Utilizando o software RTCA intrínseca, o tempo de duplicação (TD) foi calculada de acordo com DT = log2 /inclinação publicada por Zhang et ai [23], https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RTCA. html. O cálculo do DT é o Índice celular tempo de duplicação, o qual não é igual ao momento em que o número de células dobra, porque os valores de índice de células são uma combinação de a medida de viabilidade celular, número de células, a morfologia das células, e o grau de adesão celular.

a irradiação de células cancerígenas do cólon

Para verificar se a irradiação pode ter um impacto sobre as células SW948 ou LS1034 com um knockdown KRT23 foi realizada uma otimização de dosagem irradiação com 0-10 Gy de raios y usando um

137Cs radiador Gammacelle 2000RH (AEK Riso, Dinamarca) como descrito anteriormente [24].

análise estatística

a análise estatística foi realizada usando STATA 10 (StataCorp, Texas, EUA). valores de transcritos foram expressos em mediana ± log2 desvio padrão (DP). um teste t de Student bicaudal foi aplicada e valores de p p . 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos

Resultados

KRT23 metilação do promotor

O estado de metilação do promotor KRT23 foi avaliada em 40 amostras de tecido do cólon (seis mucosa normal, seis adenoma, cinco MSI e 23 tecidos de adenocarcinoma MSS) usando matrizes Illumina missanga interrogar CG-sites na posição cg06378617 e cg22392708 localizado no promotor KRT23 (Figura a na Figura S1 S1 arquivo). Uma diminuição altamente significativa nos níveis de metilação de adenocarcinomas MSS poderia ser observado para ambos os CG-sites interrogados, quando em comparação com seis amostras de mucosa normal (Mann-Whitney U-test, p-valor para 1.9E-04 5.3E-cg06378617 e 04 para cg22392708). adenocarcinomas MSI, bem como adenomas mostrou metilação reduzida significativa para o local CG cg06378617 única (teste-U de Mann-Whitney, p-valor 1.7e-02 e 2,2E-03, respectivamente). Paralelo perfis das mesmas amostras utilizando matrizes Exão 1,0 ST expressão transcrição mostrou que a transcrição KRT23 estava ausente em mucosa normal, confirmando os resultados anteriores (8). No entanto, os níveis de transcrição foram identificados sem ambiguidades em 4/6 adenomas e na maioria de adenocarcinomas. Uma correlação negativa foi identificada entre metilação do promotor e expressão transcrição KRT23 em posições tanto interrogado locais CG, cg06378617 posição e cg22392708 com coeficiente de correlação de Spearman de -0,64 e -0,74, respectivamente (Figura 1). dados de matriz Illumina foram validados por seqüenciamento bissulfito utilizando amostras com diferentes níveis de expressão KRT23 variando de baixo a alto de uma amostra independente criado não previamente analisado em matrizes Illumina, e onde amostras de DNA e dados de microarranjos de expressão estavam disponíveis. Uma vez que não foi possível obter os iniciadores específicos para o cg06378617 Ilumina CpG local, analisamos metilação do promotor em cg22392708 (posição 116 na Figura 2A) e em cinco CpG-locais adjacentes adicionais (posições 152, 167, 174, 189 e 228) . sequenciação de bissulfito de pelo menos 10 clones por amostra foi realizada em ADN extraído de amostras de 23 tecido compreendendo mucosa normal (n = 3), um pool normal (n = 10), adenomas (n = 3) e os adenocarcinomas (MSI n = 5 e MSS n = 11) (Figura 2A). Em seguida, o estado de metilação foi comparado com os dados de perfil de microarray transcrição. Em todas as posições, excepto na posição 116, elevado nível de metilação foi acompanhada por uma baixa expressão KRT23 em 87% dos casos. O promotor KRT23 de mucosa normal apresentou 50-75% de metilação acompanhada por expressão KRT23 ausente (níveis de transcrição de log2 5). Em contraste, a maioria dos tumores MSS mostraram menos de 25% de metilação acompanhada por elevados níveis de expressão de log2 KRT23 9 em 7/11 tumores MSS analisados ​​(Figura 2A)

a comparação dos dados de transcrição KRT23 de Exon. 1.0 matrizes ST (- • -) para dados de metilação de 2 sondas, cg22392708 e cg06378617 das matrizes Illumina missanga (D) mostrou uma correlação negativa entre a metilação e transcrição nas amostras de 40 tecidos analisados ​​(Spearman coeficiente de correlação de -0.64 e – 0,74, respectivamente).

Posição 116 corresponde a Cg22392708. • metilado, ○ não metilado; MSI e MSS adenocarcinomas de cólon. A) de metilação de biópsias de cólon foi comparado a transcrever dados de expressão de Exon 1.0 matrizes ST. Para a maioria das amostras, valores elevados de metilação estão em concordância com os valores baixos de expressão e vice-versa. intensidades LOG2 são mostrados no painel à direita, valores abaixo de log2 = 5 foram considerados como expressão ausente. B) Tratamento das células HCT116 (MSI) não expressando KRT23 com 5′-aza-dC mostraram que a diminuição da metilação resultou num aumento da expressão do transcrito KRT23.

Expressão KRT23 é induzida por desmetilação

Duas linhas de células do cólon MSI, HCT116 e DLD1 sem expressão KRT23, foram tratadas com concentrações crescentes de 5-aza-2′-desoxicitidina (5′-aza-dC) e DMSO ou CH3COOH como controlos e a viabilidade celular foi monitorada pelo ensaio de MTT (não mostrado). RTqPCR análise quer através de uma sonda de SYBR verde ou uma sonda Taqman contra KRT23 mostrou que 2.5μM 5′-aza-dC foi suficiente para induzir uma forte regulação positiva de KRT23 resultando num 18-vezes (células HCT116) ou 120 vezes (DLD1 células) aumento, respectivamente, em relação a zombar células tratadas (Figura B na Figura S1 S1 arquivo). perfil de expressão do genoma utilizando Exão 1.0 matrizes ST confirmou a forte regulação positiva de KRT23 em HCT116 e células DLD1 mediante tratamento 5’AZA-DC e mostraram a re-expressão de vários genes como por exemplo MAEL e UCHL1 (dados não mostrados), genes previamente relatado para ser indutível com um agente de desmetilação [25]. sequenciação de bissulfito em seis posições na promotora KRT23 da 5′-aza-dC tratada células HCT116 confirmou um 80% -100% de metilação na CH3COOH tratados controlos, enquanto que a metilação foi diminuída para 25% -50% de metilação por tratamento com 2.5- 5,0 uM 5′-aza-dC (Figura 2B). Em conclusão, a expressão transcrição KRT23 é 5′-AZA-dC inducible sugerindo uma regulação epigenética potencial para KRT23.

Lentivirus knockdown mediado estável de KRT23 em linhas celulares de cancro do cólon

Como adenocarcinomas em estágio inicial já expressam níveis moderados a elevados de KRT23

in vivo

[14], que queria saber se o esgotamento de KRT23 pode afetar as funções moleculares e celulares de células cancerígenas do cólon. Numa primeira abordagem, de lentivírus mediada knockdown de KRT23 foi aplicada à linha celular de cancro do cólon humano SW480. Cinco sequências shRNA diferentes segmentação KRT23 foram analisados, onde as construções mais eficientes foram sh-sh 1010 e-1506 (Figura A na Figura S2 em S1 Arquivo). perfis de transcrição usando matrizes 2.0plus U133 foi realizado com extractos de células SW480 transfectadas estavelmente com SH-1506 ou SH-1010, e em comparação com células de controlo transfectadas estavelmente com um vector vazio. Construir SH-1010 resultou em 3968 genes diferencialmente expressos (log2 | 0,5 |) após depleção KRT23, enquanto construto SH-1506 com uma eficiência de knockdown de cerca de 90% resultou em 7156 genes alterados, do presente documento 3145 (log2 | 0,5 |) alvo genes em comum para ambos os construtos de knockdown, aumentada ou diminuída em ambas as análises no mesmo sentido. Construir sh-1506 foi ainda utilizado para estudar o efeito de KRT23 knockdown em três linhas celulares de cancro do cólon diferentes.

Perfil de expressão KRT23 depleção de células Lines

Em uma abordagem alargada que usamos três diferentes MSS