Sumário

peptídeo Latência-associado (LAP) – expressando células T reguladoras (Tregs) são importantes para a auto-tolerância imunológica e homeostase imunológica. Para investigar o papel de LAP em CD4 humano

+ Foxp3

+ Tregs, foi elaborado um estudo transversal que envolveu 42 pacientes com câncer colorretal (CRC). Os fenótipos, padrões de citocinas de libertação, e habilidade de supressão das Tregs isolado do sangue e tecidos tumorais periféricas foram analisados. Verificou-se que a população de LAP-positivas CD4

+ Foxp3

+ Tregs aumentou significativamente no sangue e tecidos de cancro periférico de pacientes de CRC, em comparação com a do sangue periférico e em tecidos de indivíduos saudáveis. Ambos LAP

+ e LAP

– Tregs tinha um fenótipo efetoras /memória similar. No entanto, LAP

+ Tregs expressa mais moléculas efetoras, incluindo receptor fator de necrose tumoral II, granzima B, perforina, Ki67 e CCR5, que o seu LAP

– contrapartes negativas. A actividade imunossupressora in vitro de LAP

+ Tregs, exercida por meio de um mecanismo de crescimento transformante-fator β-mediada, foi mais potente do que a de LAP

– Tregs. Além disso, o enriquecimento do LAP

+ Treg população em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes de CRC correlacionada com metástases cancerosas. Em conclusão, constatamos que LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ células Treg representou um subgrupo activado de Tregs tendo actividade de regulação mais potente em pacientes com CCR. O aumento da frequência de LAP

+ Tregs em PBMC de pacientes CRC sugere seu papel potencial no controle da resposta imune ao câncer e apresenta LAP como um marcador de Tregs específicas do tumor em pacientes com CCR

Citation:. Mahalingam J , Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. Cells (2014) CD4

+ T que expressam Latência-Associated Peptide e Foxp3 são um subgrupo activado de células T reguladoras enriquecido em pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 9 (9): e108554. doi: 10.1371 /journal.pone.0108554

editor: Derya Unutmaz, Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de abril de 2014; Aceito: 24 de agosto de 2014; Publicação: 30 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mahalingam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC Grant NSC 99-3112-B-182-011, 97-2314-B-182A-027) e CMRPG 380.362, 380.743, 392.087 de Chang Gung Memorial Hospital. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Todos os autores declararam que não há interesses concorrentes existem

Introdução

funções imunossupressores de um subconjunto especializado de células T são vitais para a regulação imune. As células T reguladoras (Tregs) desempenham um papel central na manutenção da auto-tolerância periférica e homeostase imune [1] – [3]. Diversas linhas de evidência sugerem que o fator de transcrição forkhead (Foxp3) -expressing CD4

+ Tregs são heterogêneos no seu desenvolvimento e funções. Assim, Tregs naturais referem-se CD4

+ Foxp3

+ Tregs de origem do timo, enquanto induzida Tregs (iTregs) são uma população de células T perifericamente convertido de CD4

+ Foxp3

– células T [4] – [6]. Huehn et ai. foram os primeiros a demonstrar a existência de subconjuntos distintos de Tregs, Tregs naive e de memória efectora Tregs, com base na expressão de CD103, um receptor de α

E integrina que orienta as células T a locais inflamados [7]. A função imunomodulatória de Tregs activado ou efectora relacionados com a expressão de uma variedade de moléculas, tais como os receptores de quimiocinas CCR6 e CCR5, de linfócitos T citotóxicos ao antigénio-4 (CTLA-4), e o receptor do factor de necrose tumoral (TNFR) II foi então investigada em doenças inflamatórias crónicas, doenças de enxerto-versus-hospedeiro, e tumores [8] – [15]. Sakaguchi et al. delineado ainda mais o papel de Foxp3

+ CD4

+ Tregs com base na expressão de CD45RA e Foxp3 e divididos CD4

+ Foxp3

+ Tregs em três fenotipicamente e funcionalmente subgrupos distintos, ou seja, não-supressiva, descanso, e activado Tregs; estes últimos são acreditados para actuar como supressores de resposta imune e mediadores de hemostasia imune [16]. O hotel tinha anteriormente adotado essa classificação e descobriu que, em pacientes com câncer de cólon, apenas o activado e não as Tregs ingênuos acumulados no local do tumor, suprimiu a proliferação de células efetoras T in vitro, e correlacionados com a progressão do tumor [17]. Sugerimos que, dada a actividade de regulação diferencial das Tregs humana, é necessário separar Foxp3

+ Tregs em subgrupos funcionais e para atingir uma subpopulação Treg específicas a fim de garantir a imunoterapia bem sucedida.

Um número de estudos demonstraram que factor de crescimento transformante (TGF) -β desempenha um papel crítico na imunossupressão exercida por Foxp3

+ Tregs [18] – [22]. TGF-β em combinação com IL-2 induz a diferenciação de forma potente de Tregs naive em Foxp3 funcional

+ iTregs [19]. -Latência associada péptido (LAP) é o N-terminal pro-péptido de TGF-β precursoras que não covalentemente liga-se ao TGF-β, formando uma imagem latente de TGF-β complexo e facilitando a libertação de TGF-β1 na matriz extracelular [23]; subsequentemente, o TGF-β activado promove a conversão de Tregs virgens de iTregs e medeia imunossupressão Treg associada [24]. LAP é expressa na membrana celular de muitas células do sistema imunológico, incluindo Tregs, e participa na regulação imune. TGF-dependente β LAP-expressando Tregs demonstraram capacidade supressiva em ratos e seres humanos. Assim, um subconjunto de Foxp3 LAP-positiva indutível

-CD4

+ Tregs suprimiu a inflamação alérgica em ratinhos [25] – [27]. Gandhi et al. relataram que esta nova população Treg, isolado a partir de sangue periférico humano, suprimiu a proliferação de outras células T in vitro, o qual foi, em parte, mediada por TGF-β e IL-10 [28]. Nosso estudo anterior revelou que a população de CD4

+ LAP

+ células foi aumentado no sangue periférico de pacientes com câncer colorretal (CRC); Além disso, estas células demonstraram um fenótipo supressor dependente de TGF-β-[29]. Importante, observou-se um aumento modesto no CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T em pacientes com CCR, enquanto que estes Tregs foram raramente observada em indivíduos saudáveis. Chen et al. obtiveram resultados semelhantes em um modelo experimental murino encefalite auto-imune (EAE), onde um subconjunto único de CD4-expressar LAP

+ CD25

+ Tregs exibiu capacidade supressora mais potente do que Tregs LAP-negativas [30]. A existência de CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs com a atividade supressiva também foi observado na síndrome auto-imune de camundongos scurfy [31]. No entanto, em seres humanos, o papel imunomodulador do LAP-expressando CD4

+ Foxp3

+ Tregs não está bem caracterizado. Neste trabalho, nós demonstramos que CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ população Treg aumentou ligeiramente em sangue periférico de pacientes com CCR e apresentou um subconjunto distinto de Tregs ativadas que potencialmente suprimidos células efetoras através de um TGF mecanismo -β-relacionados. A percentagem mais elevada de LAP

+ Tregs correlacionada com a progressão do tumor, o que sugere que LAP

+ Tregs desempenhar um papel importante na tolerância imune a CRC.

Materiais e Métodos

Os pacientes

no total, 42 pacientes CRC e 21 doadores saudáveis ​​foram incluídos neste estudo. Os 42 pacientes com CCR foram recentemente diagnosticados com a doença e colectomia submetidos sem quimioterapia pré-operatória e /ou radioterapia no Chang Gung Memorial Hospital, ramo Linkou, Taoyuan, Taiwan. Amostras de sangue foram coletadas de pacientes por punção venosa antes da cirurgia. Doentes características clínicas, incluindo a patologia tumoral, estágio CRC, e os níveis de antígeno carcinoembrionário foram recuperados a partir dos registros médicos.

Amostras de sangue e tecidos

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas por Ficoll Paque Além disso densidade método de gradiente de centrifugação [12]. Os linfócitos foram também isoladas a partir de espécimes de tecidos ressecados tanto tumorais e não tumorais. tecidos não tumorais foram seleccionados a partir da margem de ressecção do espécime e confirmou-se que não canceroso por exame patológico. Os tecidos de tumor e não de tumor foram triturados finamente cortada e, incubou-se com 0,1% de colagenase D (Sigma-Aldrich, EUA) em HBSS durante 30 min a 37 ° C e filtrada através de uma malha de nylon. suspensão de células isoladas foi preparado com Ficoll (Pharmacia, EUA), e leucócitos foram separados a partir da interfase, como previamente descrito [29].

Ética declaração

consentimento informado assinado foi obtido de todos os participantes antes da inscrição. O protocolo do estudo foi projetado de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinki de 2008 e foi aprovado pelo Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan.

Anticorpos e reagentes

recentemente obtido linfócitos humanos foram coradas com os seguintes anticorpos fluorescentes contra marcadores de superfície de leucócitos humana: peridinina clorofila-CD4-cianina-5 (PerCP-Cy5.5), CD25-ficoeritrina (PE) ou -allophycocyanin (APC), isotiocianato de CD45RA-fluoresceína (FITC ), CCR7-PE, CCR5-FITC, CCR4-PE-Cy7, CD62L-PE, Ki67-PE ou -APC a partir de (BD Biosciences, EUA), e LAP (PE e APC) a partir de (R D Systems, EUA) . coloração intracelular com anticorpos CTLA-4-APC-Foxp3 APC ou -FITC e foi realizado após o tratamento com tampões de fixação e permeabilização (eBiosciences, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. coloração intracelular para a granzima B, perforina, e TGF-β foi realizada após a estimulação com PMA e ionomicina durante 5 h, com paragem de Golgi. As células estimuladas foram feitos reagir primeiro com os anticorpos contra os marcadores de superfície CD4 e LAP, então fixadas e permeabilizadas com tampão Cytofix /Cytoperm (BD Biosciences, EUA), e, finalmente, coradas com TGF-ß-PE, a granzima B-FITC, ou perforina anticorpos PE. A intensidade de fluorescência foi analisada utilizando BD FACSCalibur (BD Biosciences, EUA) e software FlowJo (árvore da estrela, EUA).

CD4

+ CD25

+ LAP

+ ensaio de supressão de células T

CD4

+ CD25

+ LAP

+, CD4

+ CD25

+ LAP

– e CD4

> + CD25 – células T CRC de pacientes foram isoladas com mais do que 90% de pureza por separação de células, usando FACS Aria (BD Biosciences, EUA). CD4

+ CD25

+ LAP

+ e CD4

+ CD25

+ LAP

– as células T foram misturados com células T de resposta (CD4

+ CD25

– ) numa proporção de 01:01 e activadas com anticorpos anti-CD28 durante 96 horas com anti-CD3 e. As células foram pulsadas com timidina [

3H] durante 16 horas após a estimulação.

A análise estatística

As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Mann-Whitney U,

t

-teste, emparelhado

t

-teste, ou one-way ANOVA. Os valores de P inferiores a 0,05 (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001) foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, EUA).

Resultados

Um grupo de CD4

+ Foxp3

+ Tregs expressa preferencialmente LAP em pacientes CRC

em primeiro lugar, investigou a expressão de LAP superfície sobre CD4

+ Foxp3

+ Tregs isoladas de pacientes de CRC. A fiabilidade de coloração LAP foi confirmada por monoclonal de controlo de isotipo e os anticorpos monoclonais LAP recombinante (rLAP). (Figura S1) A comparação entre pacientes com CCR e doadores saudáveis ​​(HD) revelou que a expressão LAP em CD4

+ Foxp3

+ T células isoladas de PBMC foi significativamente aumentada em doentes com cancro (CRC: 18,8% ± 9,2% vs . HD:. 7,8% ± 3,3%; Figura 1A e B). Além disso, a Figura 1C mostra que a percentagem de células CD4

+ Foxp3

+ + LAP células

T foi significativamente mais elevada nos tecidos de tumor do que em tecidos não tumorais de pacientes de CRC (12,4% ± 8,8% vs 5.5 % ± 3,8%, P = 0,02). Os resultados sugerem que o aumento da população de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs no CRC podem desempenhar um papel importante na regulação da resposta imune anti-tumor.

(A) A percentagem de LAP

+ células do CD4 fechado

+ Foxp3

+ subpopulações de pacientes de câncer colorretal (CRC) e os doadores saudáveis. Em comparação com dadores saudáveis, pacientes com CCR mostrou um aumento da frequência de LAP

células CD4 +

+ Foxp3

+ T em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e linfócitos infiltrantes de tumor (TIL). (B). PBMC de pacientes com CCR e doadores saudáveis ​​foram isolados, e a percentagem de LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs foi calculada pela análise FACS. A diferença entre as amostras foi analisado por Student

t

-test (*** P 0,001). (C). Os linfócitos foram isolados a partir tumorais e não tumorais de tecidos de pacientes de CRC, e a percentagem de células LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ T foi calculada por análise de FACS. CRC-TIL, linfócitos infiltrantes tumorais; CRC-NIL, linfócitos infiltrantes de tecidos não tumorais. A diferença na proporção de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T entre as populações CRC-Nil e CRC-TIL foi analisada por Estudante de

t

-test (* P 0,05 , ** P 0,01 e *** P . 0.001)

o fenótipo de CD4

+ Foxp3

+ Tregs de pacientes CRC foi analisada com base na expressão de superfície marcadores de células de memória CD45RA e CCR7 (Fig. 2A). CD45RA e padrões de expressão CCR7 indicaram que tanto LAP

+ e LAP

– subconjuntos de Foxp3

+ CD4

+ células T na maior parte tinha um fenótipo efetoras /memória no sangue periférico, bem como em locais de tumor de CRC pacientes (Fig. 2B) [17]. Assim, Tregs LAP-positivos em CRC não diferiram entre os seus homólogos LAP-negativos na expressão do fenótipo efetoras /memória.

Foram analisados ​​PBMC e TIL suspensões para a expressão de marcadores fenotípicos CCR7 e CD45RA para avaliar o estágio de diferenciação de células CD4

+ Foxp3

+ LAP

células + T. (A) Dot blot representa o naïve (N, CD45RA

+ CCR7

+), a memória central (CM, CD45RA

-CCR7

+), memória efetoras (EM, CD45RA

– CCR7

-) e efetoras terminal (TE, CD45RA

+ CCR7

-) CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs. (B) os estágios de diferenciação de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs no sangue periférico, tecidos tumorais e não tumorais tecidos de pacientes com CCR foram determinadas por citometria de fluxo. Cada ponto representa a média ± SD de uma amostra individual.

expressão elevada de marcadores relacionados ativados-Treg em CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T

Foi examinada a expressão de moléculas de ativação /efetoras Treg-associados, incluindo os membros TNFR super-família, granzima B, perforina, Ki67, CTLA-4, e Tim-3, em CD4

+ Foxp3

+ T células. Em comparação com CD4

+ Foxp3

+ LAP

– as células T, CD4

+ Foxp3

+ LAP células

+ T apresentou maior expressão de TNFRII, granzima B, perforina, Ki67 , e Tim-3 e uma menor expressão de CTLA-4 (Fig. 3A). Estes dados indicam que, em CRC, um aumento da proporção de LAP-positivas CD4

+ Foxp3

+ Tregs tem um fenótipo proliferação activado.

(A) PBMC de pacientes com CCR foram analisados ​​para a expressão de marcadores Treg TNFR II, granzima B, perforina, Ki67, CTLA-4, e Tim-3 por FACS. O histograma representa a expressão de marcadores Treg em CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs e CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs; a diferença entre a expressão de populações de células T foi analisada por emparelhado

t

-test (* P 0,05, ** P 0,01, *** e P 0,001). (B) histogramas típicos representam a porcentagem de CD62L-, CCR4- e CCR5-positivas CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs e CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs; os níveis de CD62L, CCR4, CCR5 e expressão foram comparados entre as duas populações de células T. Os dados foram analisados ​​por emparelhado

t

-test (* P 0,05, ** P 0,01, *** e P 0,001).

Várias linhas de evidência de rato e estudos em seres humanos sugerem que a expressão de determinados receptores de quimioquinas, incluindo a CCR4 e CCR5, é característico para um subgrupo de células T CD4 activadas

+ Foxp3

+ Tregs. A análise de CCR4, CCR5, e L-selectina (CD62L), a expressão indicou que CD62L foi significativamente regulada negativamente em células CD4

+ Foxp3

+ LAP células

+ T em comparação com a sua LAP

– contrapartidas negativas ( intensidade de fluorescência média (MFI), 594 ± 41,9 vs 684 ± 70,9, P = 0,006); a expressão de CCR4 foi semelhante, enquanto a de CCR5 aumentou em CD4

+ Foxp3

+ + células T

LAP comparação com CD4

+ Foxp3

+ LAP

– as células T ( R4CC: 40,7% ± 5,9% vs. 37,7% ± 6,2%, P = 0,2; CCR5: 13,2% ± 1,9% vs. 6,2% ± 1,7%, P = 0,001). Estes resultados indicam que CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs têm um fenótipo ativado.

CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs exibem potente TGF -β-dependente capacidade supressão

TGF-β é uma citoquina imunossupressora conhecida por desempenhar um papel crítico na geração e actividade funcional de Tregs. Membrana de TGF-β é mantida sob uma forma latente de ligação a LAP não-covalente. Para examinar a associação do LAP-positiva fenótipo Treg com TGF-β, analisamos a produção de TGF-β no CRC Foxp3

+ LAP

+ Tregs estimuladas com PMA /ionomicina. Como mostrado na Fig. 4A, os níveis de TGF-p foram maiores no Treg subconjunto LAP-positivo do que no Treg subconjunto LAP-negativa (7,50% ± 1,1% vs. 2,8% ± 1,1%, P = 0,001), o que sugere que CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células exercem a sua função reguladora através da via TGF-β.

(a) a expressão de TGF-β em células CD4

+ Foxp3

+ LAP

+, CD4

+ Foxp3

+ LAP

– e CD4

+ Foxp3

+ Tregs foi analisada por FACS. As células T foram estimulados in vitro, tal como descrito nos Materiais e Métodos, e expressão de TGF-β foi comparada entre estes três grupos emparelhados por

t

-test (** P 0,01). (B) CD4

+ CD25

+ LAP

+ células T e CD4

+ CD25

+ LAP

– as células T foram separados por separação de células usando FACSAria e estimuladas com anti- anticorpos CD3 e anti-CD28 durante 96 horas. proliferação de células T foi avaliada através da timidina [

3H] incorporação e expressos como a média ± DP de três experiências independentes; os dados foram analisados ​​por emparelhado

t

-test (* P 0,05). (C) de anticorpo anti-TGF-β (10 ug /mL) foi adicionado ao CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs co-cultivadas com células CD4

+ CD25

-LAP

+ células T (razão de 1:01) e activada por anti-CD3 e anti-CD28 mAb. A percentagem de supressão na presença ou ausência de anti-TGF-β mAb é expressa como a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 por emparelhado

t

-test

Em seguida, avaliamos a expressão de LAP entre CD4

+ CD25

-, CD4

+. CD25

lo, e CD4

+ CD25

subpopulações hi de CD4

+ Tregs e descobriu que, em CRC pacientes, LAP-positivas CD4

+ Foxp3

+ Tregs foram predominantemente observados dentro o CD4

+ CD25

oi compartimento. Então, CD4

+ CD25

+, CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

+ LAP

+ e CD4

+ CD25

+ LAP

– populações Treg foram separados por separação de células, e sua capacidade de inibir a proliferação de recém isolado CD4

+

CD25 – células T foi avaliado pelo [H

3] ensaio de incorporação de timidina . Entre essas subpopulações Treg, CD4

+ CD25

+ LAP

+ células exibido a capacidade supressora mais potente (P 0,03; A Fig. 4B), que foi inibido in vitro pela administração de anti-TGF β anticorpo (Fig. 4C). Enriquecimento no sangue periférico CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T correlacionados com a progressão da CRC.

A relevância clínica de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T em CRC foi analisado em 42 pacientes de CRC (as suas características demográficas e clínicos são apresentados na Tabela 1). Apenas 9 pacientes tinham câncer ou progressão da doença recorrente. A percentagem de CD4

+ Foxp3

+ LAP + células

T na CD4

+ Foxp3

+ população de células T não se correlacionou com a de CD4

+ Foxp3

+ células T CD4 no

+ população de células T no sangue periférico. In (TIL) população de linfócitos que se infiltram no tumor, a percentagem de CD4

+ Foxp3

+ células LAP

+ T correlacionada com a de CD4

+ Foxp3

+ T células (r

2 = 0,1, P = 0,04).

+ células T a proporção de CD4

+ Foxp3

+ LAP inversamente correlacionada com a de CD8

+ T células no sangue periférico (r

2 = 0,2, P = 0,01); em TIL, uma tendência de correlação inversa entre CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ e CD8 foi observada células

+ T; No entanto, não era estatisticamente significativa (r

2 = 0,08, P = 0,18). Além disso, nós não encontraram correlação entre CD4 circulantes

+ Foxp3

+ LAP + células

T e outras células inflamatórias, como neutrófilos, linfócitos e monócitos (Fig. 5A). O estudo incluiu 26 pacientes com câncer de cólon e 16 pacientes com câncer retal; no entanto, a percentagem de circular ou tumor infiltrando CD4

+ Foxp3

+

+ células LAP T no CD4

+ Foxp3

+ população de células T não diferiu entre os dois grupos de CRC pacientes (Fig 5B).

(A) Correlação entre LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ células T e CD4

+ Foxp3

+ células T, CD8

+ células T, linfócitos totais, monócitos e neutrófilos (R

2 e os valores de p) foi avaliado através do método de correlação de Pearson. (B) A percentagem de LAP

+ Tregs em populações PBMC e TIL foi comparada entre pacientes com CCR com tumores reto e cólon; os dados foram analisados ​​por emparelhado

t

-test (* P 0,05). pacientes (C) CRC foram agrupados com base na presença ou ausência de nódulo linfático ou metástases distantes. A percentagem de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs em populações PBMC e TIL foi comparado entre os grupos de pacientes com diferentes estágios CRC e os doadores saudáveis. A análise estatística foi realizada por ANOVA one-way (** P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001).

Finalmente, foi investigada a associação de CD4

+ Foxp3

+ LAP

células + T com o estágio do tumor. Como mostrado na Fig. 5C, a percentagem de células CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ células T no sangue periférico de pacientes metastáticos era significativamente maior do que em pacientes com CCR sem metástases e em dadores saudáveis. Além disso, o tamanho das células T CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ população Treg foi aumentada em tecidos tumorais em comparação com tecidos não tumorais (Figura 5C). Assim, o aumento de LAP

+ Tregs no sangue periférico de pacientes de CRC poderá reflectir o aumento de LAP

+ Tregs em tecidos tumorais e pode ser correlacionada com a fase do cancro, o que sugere que o tamanho do regaço de sangue periférico positivo CD4

+ Foxp3

subpopulação + células T pode servir como um marcador substituto para o processo de imunossupressão no CRC.

Discussão

os resultados de nosso estudo indicam que as marcas de expressão LAP uma subpopulação de CD4

+ Foxp3

+ Tregs com capacidade supressiva potente. Embora a maioria de CD4

+ Foxp3

+ Tregs em pacientes de CRC são classificados como ativado, entre eles, Tregs LAP-positivas têm funções ainda mais potentes supressores. Isto se manifesta por uma maior expressão de marcadores celulares ativados, o aumento da produção de imunossupressora de TGF-β, e habilidade de supressão mais potente in vitro em Tregs LAP-positivos em comparação com Tregs LAP-negativo. Os nossos resultados sugerem que LAP pode ser um marcador potencial para identificar um subgrupo de Tregs que exibem funções supressoras relacionadas com TGF-β. Esta subpopulação Treg foi enriquecido no sangue periférico de pacientes de CRC, que se correlacionou com a progressão do tumor, o que sugere que CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs podem ter aplicação clínica como marcadores de Tregs específicas do tumor em CRC pacientes.

O papel funcional do LAP no Tregs não é clara. LAP permanece associada de forma não covalente com o TGF-β após a clivagem do péptido precursor e formar o complexo de TGF-β latente inactiva; por conseguinte, contribui para a prevenção da activação descontrolada dos receptores de TGF-p. Nakaruma et ai. foram os primeiros a demonstrar que tanto murino e humano CD4

+ CD25

+ Tregs poderia exercer supressão de TGF-β-dependente de células efetoras, que foi revertida pela LAP recombinante. Eles também demonstraram que LAP-positivas CD4

+ células T poderia suprimir colite in vivo, sugerindo que, pela primeira vez, que LAP pode ser considerada como um marcador de regulamentação [24]. Qida et ai. ainda demonstrado que a expressão de LAP murino CD4

+ células T foi induzida por TGF-β independentemente de Foxp3 [25]. Shevach et ai. observou-se a expressão de complexos de TGF-β-LAP sobre a Tregs activado, mas não sobre a Tregs descansando induzida através de estimulação não-antigénio [21], [31], [32]. LAP

+ Tregs suprimiu a proliferação de células T activadas, mas não de células T naive em uma maneira dependente de TGF-β-infecção e tolerância mediada por conversão de Foxp3-negativo para Tregs funcionalmente activas Tregs Foxp3-positivos [32]. Acredita-se que o complexo de TGF-LAP-β representa um importante mecanismo de Tregs para manter a homeostase imune via de sinalização de TGF-β.

Chen et al. ter mais funcionalmente caracterizada CD4

+ CD25

modelo + LAP

+ Tregs em um modelo de encefalite auto-imune (EAE) [30]. CD4

+ CD25

+ LAP

população + Treg apresentaram maior frequência de expressão Foxp3 e produziu aumento dos níveis de moléculas efetoras e citocinas do que suas contrapartes LAP-negativo. Tregs expressando volta foram anérgicas e supressora in vitro; No entanto, a sua actividade supressora foi mais potente em comparação com a de outros tipos Treg. Estas células expressaram tanto o TGF-β e seus receptores; a capacidade de supressão de LAP

+ Tregs foi revertida pela neutralização de TGF-β, indicando que CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs foram, pelo menos em parte, regulada de TGF-β- forma dependente. Além disso, in vivo a transferência adoptiva de células CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs melhorados EAE, confirmando a potência imunossupressora desta população Treg. Com base nestas descobertas, LAP pode ser considerada como um marcador para a identificação de um subgrupo de células T CD4

+ CD25

+ Tregs com capacidade supressiva potente [30]. Nos seres humanos, Shevach et ai. mostraram que a presença da superfície de TGF-β complexado com LAP induzidos Foxp3 e resultou na supressão de células de resposta, indicando a possibilidade de que tanto Foxp3 e LAP pode conferir actividade supressora mais potente sobre a população de células Treg humana [31].

Mesmo que o papel de Tregs LAP-positivo não foi completamente esclarecida, os dados disponíveis sugerem que LAP pode ser um biomarcador útil para identificar activado Tregs em ratos e seres humanos. Em ratinhos, LAP pode ser aplicado para a selecção in vitro de expandido CD4

+ Foxp3

+ Tregs supressoras [33], enquanto que em seres humanos, tem sido sugerido como um marcador para monitorizar Tregs depois de anti-CTLA-4 imunoterapia [34]. O nosso estudo reforça ainda mais a noção de que a expressão LAP pode distinguir activado Tregs, especialmente os que circulam no sangue periférico de pacientes de CRC. Mais importante ainda, a progressão do tumor correlacionado com o aumento da proporção de LAP

+ Tregs. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que circula LAP-positivas CD4

+ Foxp3

+ Tregs, em vez do que a população em geral de CD4

+ Foxp3

+ células T, pode ser utilizado como uma forma mais precisa e marcador específico para monitorar o estado imunológico de pacientes com câncer.

Em conclusão, CD4

+ Tregs que expressam tanto Foxp3 e exposições LAP maior actividade imunossupressora do que outras subpopulações de células Treg. O LAP supressiva

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs regular as respostas imunes, pelo menos em parte, através de sinalização TGF-β. O enriquecimento de CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs no sangue periférico de pacientes de CRC pode ser potencialmente utilizado para imunoterapia de câncer de monitoramento em ambientes clínicos.

Informações de Apoio

Figura S1.

expressão de LAP. (UMA). O anticorpo monoclonal de controlo de isotipo (IC) e LAP recombinante (rLAP) confirmou-se a fiabilidade de coloração. (B). Identificação de CD4

+ Foxp3

células + T. Utilizou-se o anticorpo monoclonal de controlo de isotipo (IC) para confirmar a LAP

+ T células coloração

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108554.s001

(TIF)