Abstract

A contaminação de células normais é quase sempre presente em amostras de tumor e afeta suas análises moleculares. A metilação do DNA, uma modificação epigenética estável, é dependente do tipo de célula, e diferente entre o cancro e as células normais. Aqui, procurou-se demonstrar que a metilação de ADN pode ser utilizada para estimar a fracção de células cancerosas numa amostra de ADN de tumor, utilizando carcinoma do esófago de células escamosas (CICAc) como um exemplo. Em primeiro lugar, por uma série Infinium HumanMethylation450 BeadChip, foram isoladas três regiões genômicas (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, e

RAPGEFL1

) i) altamente metilado em quatro linhas celulares CICAc, ii) dificilmente metilado num grupo de amostras de mucosa não-cancerosas, uma amostra colectiva de mucosa esofágica normal, e leucócitos periféricos, e iii) frequentemente metilado em 28 ESCCs (

TFAP2B

, 24/28;

ARHGEF4

, 20/28, e

RAPGEFL1

, 19/28). Em segundo lugar, usando oito pares de amostras de células cancerosas e não cancerosas preparados por microdissecação de captura a laser, confirmou-se que, pelo menos, uma das três regiões foi quase completamente metilado em células CICAc, e todas as três regiões eram quase completamente não metilada em não-cancro células. Nós também confirmou que as alterações no número de cópias de ADN de três regiões em 15 amostras CICAc eram raras, e não afectou a estimativa da fracção de células cancerosas. Em seguida, a fracção de células cancerosas numa amostra de ADN do tumor foi definida como o nível mais alto de metilação das três regiões, e foi confirmada uma alta correlação entre a fracção avaliada pelo marcador fracção de metilação do DNA e a fracção avaliada por um patologista (R = 0,85; p 0,001). Finalmente, observamos que, pela correção do conteúdo da célula cancerosa, ilhas CpG em regiões promotoras dos genes supressores de tumores foram quase completamente metilado. Estes resultados demonstram que a metilação de ADN pode ser utilizada para estimar a fracção de células cancerosas numa amostra de ADN do tumor.

Citation: Takahashi T, Matsuda Y, Yamashita S, Hattori N, Kushima R, Lee Y-C, et al. (2013) estimativa da fração de células cancerosas em uma amostra de DNA tumoral utilizando DNA metilação. PLoS ONE 8 (12): e82302. doi: 10.1371 /journal.pone.0082302

editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 06 de junho de 2013; Aceito: 22 de outubro de 2013; Publicação: 02 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Takahashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Terceira prazo Estratégia de Controle Comprehensive Cancer do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão (https://www.mhlw.go.jp) e pelo Projeto de Desenvolvimento da Pesquisa inovativa em Cancer Therapeutics (P- DIRECT) do Ministério da Educação, Cultura Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão (https://p-direct.mext.go.jp). T. T. e Y.M. são destinatários de uma pesquisa Residente bolsa da Fundação para a Promoção da Pesquisa do Câncer (https://www.fpcr.or.jp). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a contaminação de células normais, tais como as células normais epiteliais, fibroblastos e leucócitos periféricos, é quase sempre presente em amostras de tumor. Esta contaminação influencia os resultados das análises do genoma do câncer [1-4] e análise de expressão do RNA [5,6]. Se a fracção de células cancerosas numa amostra de ADN de tumor pode ser avaliado prontamente, que pode conduzir uma análise mais precisa por exclusão de amostras com um teor extremamente baixo de células de tumor, e por normalizar os dados brutos com base na fracção de células cancerosas. Tradicionalmente, uma fracção de células cancerosas numa amostra do tumor foi avaliada por análise patológica utilizando secções vizinhas. No entanto, a preparação de tais secções, por vezes, é difícil ou impossível, devido à disponibilidade da amostra, e, acima de tudo, os patologistas peritos são necessárias para tais análises.

Para superar esses problemas, tecnologias para estimar uma fração de células cancerosas foram recentemente desenvolvidos usando single nucleotide polymorphism microarray (SNP) e sequenciamento de próxima geração (NGS) [7-10]. Com SNP microarranjo, a fracção de células cancerosas pode ser calculada através da detecção de regiões genómicas com alterações no número de cópias e a medição do grau de desequilíbrio alélico utilizando os SNPs nas regiões genómicas [7-9]. Com NGS, mutações específicas do tumor podem ser identificados, e a fracção de células cancerosas pode ser calculada com base na frequência do alelo mutante [10]. Uma vez que estas tecnologias foram desenvolvidas originalmente para a análise de SNPs ou mutações, eles sofrem de fórmulas de cálculo complicadas, reagentes dispendiosos, e a necessidade de se analisar amostras normais emparelhadas.

metilação do ADN é uma modificação epigenética estável, e algumas regiões genómicas são metilada de um modo dependente do tipo de célula [11-13]. Entre o cancro e as células normais, muitas regiões genómicas são relatados para ser diferencialmente metilada em muitos tipos de cancros, e alguns deles estão envolvidos causalmente no desenvolvimento e progressão [14-18] cancro. Entre tais regiões genómicas diferencialmente metilados, algumas regiões genómicas específicas podem ser completamente metilado em células cancerosas, mas ainda completamente não metilada em células normais, tais como as células normais epiteliais, fibroblastos e leucócitos periféricos. Se assim for, os níveis de metilação do DNA das regiões genómicas específicas pode reflectir a fracção de células cancerosas numa amostra (Figura 1A), e como estimativa da fracção de células cancerosas, utilizando a metilação do DNA pode tornar-se um método útil para estudos do cancro.

(A) O conceito de estimativa da fracção de células cancerosas numa amostra de ADN de tumor utilizando a metilação de DNA. (B) Selecção de regiões genómicas específicas, que foram completamente metilado em células CICAc e completamente não metilada em várias células normais, por análise de metilação do genoma usando uma matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Quatorze locais CpG foram finalmente selecionados, e aqueles foram derivadas de 11 regiões genômicas. (C) Três regiões genômicas (TFAP2B,

ARHGEF4, e

RAPGEFL1

) selecionados como componentes de um marcador fração. estrutura do gene e da localização de uma ilha CpG são mostradas na parte superior, e os valores de p dos locais de CpG analisadas por a matriz do grânulo Infinium são mostrados. O sítio CpG identificado pela matriz do grânulo Infinium é embalado por um rectângulo com uma linha pontilhada. Um mapa de CpG em torno do local do CpG (s) identificado é mostrado na parte inferior. As linhas verticais (cheio e a tracejado) mostram locais de CpG e as linhas a tracejado mostram locais CpG cujos valores β foram medidos por a matriz do grânulo. setas fechadas mostrar primers para MS-HRMA.

Neste estudo, buscou-se demonstrar que a metilação do DNA poderia ser usado como um marcador fração para a estimativa de uma fração de células cancerosas em uma amostra de DNA do tumor, usando carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) amostras como um exemplo. Para este fim, foi realizada uma análise de metilação do genoma para procurar regiões genômicas específicas completamente metilados nas células CICAc e completamente não metiladas em várias células normais.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional do Hospital National Cancer Center, do Hospital da Universidade de Osaka City, ea National Taiwan University Hospital. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os indivíduos.

amostras e linhas celulares CICAc

Um total de 160 amostras CICAc foram coletadas no Hospital National Cancer Center, do Hospital da Universidade de Osaka City, eo National Taiwan University Hospital. As 160 amostras CICAc consistiu de 39 amostras de biópsia e 121 espécimes cirúrgicos. As amostras de biópsia foram derivadas de 39 pacientes que foram submetidos a biópsia endoscópica e foram diagnosticados para ter uma ESCC (33 do sexo masculino e 6 do sexo feminino; idade média = 63, range = 30-78). As amostras foram armazenadas em RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) a -80 ° C. Os espécimes cirúrgicos foram derivadas de 121 pacientes que foram diagnosticados para ter um CICAc invasiva histológica e tinham sido submetidos a esofagectomia (98 do sexo masculino e 23 do sexo feminino, idade média = 65, range = 41-82). Entre os 121 espécimes cirúrgicos, 25 espécimes foram obtidos a partir de amostras embebidas em parafina bloco depois de fixação com formalina ou 70% de etanol, e as outras 96 amostras foram obtidas a partir de amostras armazenadas em RNAlater (Applied Biosystems) após ressecção. Além disso, microdissecção de captura de laser (LCM) foi realizada por oito espécimes cirúrgicos incorporados no bloco de cera de parafina usando LM200 (Arcturus, Mount View, CA, EUA), como descrito [19].

Quatro linhas celulares CICAc KYSE30, KYSE50, KYSE220 e KYSE270 [20] foram comprados de Ciências da Saúde Research Resources Bank (Osaka, Japão). O ADN genómico foi extraído utilizando o método do fenol /clorofórmio.

Genome-wide DNA metilação Análise

-wide Genome

triagem de locais CpG diferencialmente metilados foi realizada utilizando uma matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip, que cobriu 482,421 locais CpG (Illumina, San Diego, CA, EUA ), tal como descrito anteriormente [21]. 11.551 locais CpG nos cromossomas sexuais foram excluídos e os restantes locais de CpG 470,870 foram utilizados para a análise. O nível de metilação de cada sítio CpG foi representada por um valor β, que variou de 0 (totalmente não metilado) a 1 (totalmente metilado).

sensível à metilação de alta resolução de fusão Análise (MS-HRMA)

Para MS-HRMA, em primeiro lugar, 1 mg de DNA digerido com

Bam

HI foi tratada com bissulfito de sódio e suspenso em 40 ul de tampão TE como descrito [22]. Em segundo lugar, a PCR foi conduzida utilizando alíquota de 1 ul do ADN tratado com bissulfito de sódio, iniciadores capazes de amplificar tanto ADN metilado e não metilado (quadro S1) [23], SYBR Green I (Aplicações BioWhittaker moleculares, Rockland, MD, EUA), e um iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Em terceiro lugar, HRMA do produto de PCR foi realizada para se obter o perfil de fusão do produto da PCR através da representação gráfica da derivada negativa da fluorescência em relação à temperatura (-dF /d

T

vs

T

), utilizando o software iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Ver. 2.1). Finalmente, o nível de metilação de uma amostra foi avaliada por comparação do seu perfil de fusão com os dos controlos não metilados e completamente metilados, juntamente com misturas de 0, 20, 40, 60, 80, e 100% dos controles metilados. Como um controlo totalmente metilada, o ADN genómico tratados com

Sss I metilase (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) foi utilizado. Como um controlo totalmente não metilado, foi utilizado ADN de sódio modificado com bissulfito obtidos a partir de mucosa esofágica não-cancerosas sem metilação das regiões analisadas.

DNA Análise Copy Number Genomic

Copiar alterações número de regiões genômicas foram analisados ​​por quantitativa PCR em tempo real utilizando um Termociclador iCycler (Bio-Rad Laboratories) com SYBR Green I (BioWhittaker Molecular aplicativos). O número de moléculas de DNA de uma amostra foi medido por três regiões que flanqueiam os genes candidatos e os genes de controlo [

ALB

(4q13.3),

GAPDH

(12p13) e

(12p13.32)], localizado em regiões cromossômicas com alterações no número de cópias raras. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S2. O número de moléculas de DNA dos três genes candidatos foi normalizada para os dos genes de controlo. O número normalizado de moléculas de DNA de uma amostra foi comparada com a de ADN de leucócitos humanos para obter alterações no número de cópias. Toda a análise foi realizada em triplicado. alterações no número de cópias significativa (ganho ou perda) foram definidos como mais do que um aumento de 1,5 vezes ou inferior a um decréscimo de 0,67 vezes.

análise patológica da Fracção de células cancerosas

De espécimes cirúrgicos embebidos em parafina, foram preparadas

seções fatia de série com espessura de 3 mm. Uma seção foi corado com hematoxilina-eosina, e as restantes secções foram utilizadas para extração de DNA. Um patologista experimentado (R. K.) estimativa da fracção de células cancerosas por exame microscópico.

Análises Estatísticas

A correlação entre a fração de células de câncer estimados pelo marcador fracção e que avaliou pelo patologista foi analisada utilizando coeficientes de correlação produto-momento de Pearson. A diferença nas frações médias de células cancerosas foram analisados ​​pelo teste t de Student, ea diferença nas variações da fração de células cancerígenas foi analisada pelo teste de Levene. Todas as análises foram realizadas com o PASW Statistics versão 18.0 (SPSS Inc. Japão, Tóquio, Japão), e os resultados foram considerados significativos quando p valores 0,05 foram obtidos por um teste de dois lados.

Resultados

Seleção de regiões específicas, em todo o Genoma Rastreio

análise de metilação

ampla Genome-foi realizada utilizando DNA de i) 28 ESCCs obtido por biópsia endoscópica, ii) quatro linhas celulares CICAc (KYSE30, KYSE50, KYSE220 e KYSE270), iii) leucócitos periféricos de um voluntário saudável, iv) um pool de mucosa esofágica normal dos quatro voluntários saudáveis, e v) um pool de mucosa esofágica não cancerosos de oito CICAc pacientes. Temos procurado por locais CpG que foram altamente metilados (valor β 0,8) em todas as quatro linhas celulares CICAc e quase não metilado (valor de β 0,1) em leucócitos periféricos, a piscina da mucosa normal, ea piscina de não-cancerosas mucosas, e isoladas 2.752 locais de CpG de 470,870 sítios informativos CpG. Dos 2.752 locais de CpG, foram selecionados 14 locais de CpG, em que a incidência de hipermetilação (valor β 0,5) em 28 dos ESCCs foi mais do que 50% (Figura 1B).

Os 14 locais de CpG foram derivadas de 11 regiões genômicas, que definimos como regiões de 500pb por conveniência (Tabela 1). A partir das 11 regiões genômicas, excluímos

SOX2OT

, que foi relatada a ser altamente amplificado em células CICAc [24], e três regiões sem genes conhecidos. Para os sete restantes regiões, tentamos projetar primers para MS-HRMA, que é conhecido como um método sensível e específico para avaliar os níveis de metilação do DNA [25]. Fomos capazes de projetar primers para três regiões (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, e

RAPGEFL1

) (Figura 1C).

No. símbolo

Gene

do gene

Chr

nt, número

Probe ID

Relação com CpG Island of Posição para gene

Incidência

a

1

TFAP2B

** fator de transcrição AP-2 beta650791202cg27260772IslandBody2450791419cg22248052IslandBody142

SOX2OT

SOX2 sobreposição transcript3181438216cg05513806S_ShoreBody223

ARHGEF4

** Rho fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) 42131792772cg13024709IslandBody204

RAPGEFL1

** fator de troca de nucleotídeos Rap guanina (GEF) -como 11738347603cg20668644IslandBody1938347968cg24903006S_ShoreBody1938347710cg00129651IslandBody145

GRK7

*G cinase de receptor acoplado a proteína 73141516705cg25640519S_ShoreBody186

–

2200327334cg07835424Island-187

–

2119607885cg09385093Island-188

KCNA3

*Potassium voltagem-canal, subfamília relacionados com o agitador, membro do 31111217194cg20302133Island1stExon159

BCAT1

* de cadeia ramificada de aminoácidos transaminase 1, cytosolic1225055967cg20399616IslandBody1410

KLF16

* factor Kruppel-like 16191857004cg04998634IslandBody1411

–

1170630558cg23089825Island -14Table 1. regiões genômicas identificadas por beadchip análise

NOTA:

um Incidência de frequência de hipermetilação (βvalue 0,5) em 28 ESCCs.. ** Primers para HRMA foram concebidos com sucesso. * Os iniciadores para HRMA não poderia ser concebido. CSV Baixar CSV

Qualificação das três regiões como uma fração marcador

Para confirmar que as três regiões foram completamente não metilado em células não-cancerosas, e completamente metilado nas células cancerosas, foram analisados ​​seus níveis de metilação no i ) oito amostras de células não-cancerosas purificados por LCM de oito ESCCs, ii) oito amostras de células de câncer purificado-LCM dos oito ESCCs, iii) os oito ESCCs antes LCM, iv) leucócitos periféricos de um voluntário saudável, e v) os quatro CICAc linhas celulares (Figura 2A).

(A), os níveis de metilação dos três regiões foram analisados ​​em i) oito amostras de células não-cancerosas Purificou-LCM de três ESCCs, ii) oito amostras de células de cancro Purificou-LCM dos três ESCCs, iii) o oito ESCCs antes LCM, iv) leucócitos periféricos de um voluntário saudável, e v) quatro linhas celulares CICAc. Uma ou mais das três regiões foram quase completamente metilado em células cancerosas purificadas e linhas celulares de cancro, e todos foram dificilmente metilado em células não-cancerosas. numéricas (B) Cópia alterações das três regiões foram analisadas por PCR quantitativa utilizando 15 ESCCs.

Nas amostras de células oito purificado-LCM não-cancerosas e os leucócitos periféricos, todas as três regiões eram quase completamente não metilado, e nas quatro linhas celulares CICAc, todos eles eram completamente metilado. Nas amostras de células de cancro Purificou-LCM oito, pelo menos, uma das três regiões foi quase completamente metilado. No entanto,

TFAP2B

em Et5T amostra,

ARHGEF4

em Et1T, Et2T, Et4T e Et5T, e

RAPGEFL1

em Et2T não foram completamente metilado, possivelmente devido à heterogeneidade entre células cancerosas. Tais regiões não eram adequados como um marcador fracção para algumas amostras específicas. Ao mesmo tempo, a região com o mais alto nível de metilação em amostras de células de cancro Purificou-LCM também apresentaram o maior nível de metilação nas ESCCs antes LCM. Por conseguinte, o maior nível de metilação das três regiões foi considerada como reflectindo a fracção de células cancerosas no ESCCs.

O nível de metilação de uma região numa amostra pode ser afectada por uma alteração do número de cópias da região. Assim, analisamos as alterações no número de cópias das três regiões 15, utilizando ESCCs (Figura 2B). Para

ARHGEF4

, não foram observadas alterações no número de cópias significativo. Em contraste, para

TFAP2B

e

RAPGEFL1

foram observadas alterações no número de cópias significativa em baixas frequências (

TFAP2B

, 1.64-1.65 mudanças dobra em três dos 15 ESCCs;

RAPGEFL1

, mudança 0,60 vezes em um dos 15 ESCCs). Partindo do princípio de que as alterações no número de cópias de 2 vezes ou 0,5-dobra-se presentes nas células de cancro, um desvio do nível de metilação do medido a partir da verdadeira fracção de células cancerosas foi calculada como sendo de menos de 17,2% (Figura S1). Além disso, a incidência do número de cópias significativa alterações de

TFAP2B

e

RAPGEFL1

foi baixa (

TFAP2B

, 20%;

RAPGEFL1

, 6,7%) . Portanto, o efeito das alterações no número de cópias de

TFAP2B

, e

RAPGEFL1

foi considerado mínimo na estimativa de uma fração de células cancerosas. Finalmente, definimos a fracção de células de cancro, como o nível mais alto de metilação das três regiões.

Análise da Precisão do Fraction marcador

Em seguida, analisamos se a fração de células de câncer estimado pelo marcador fração realmente refletiu a fração de células de câncer estimados por exame microscópico. Medimos níveis de metilação das três regiões em 20 ESCCs (Figura 3A), e estima a fracção de células de cancro em cada amostra, utilizando o maior valor das três regiões. Nos 20 ESCCs,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, e

RAPGEFL1

apresentaram os maiores valores em nove, nove e duas amostras, respectivamente. Independentemente, a fracção de células cancerosas foi estimada por exame microscópico de cortes seriados. Fomos capazes de observar uma boa correlação entre os dois métodos (r = 0,85; p 0,001) (Figura 3B). Este resultado confirmou que a fracção de células cancerosas estimados pelo marcador fracção reflectida de forma adequada a verdadeira fracção de células cancerosas numa amostra de tumor.

(A), os níveis de metilação das três regiões foram analisados ​​em 20 ESCCs por MS-HRMA. A fracção de células cancerosas em cada amostra foi definida como o nível mais alto de metilação das três regiões. (B) A correlação entre a fracção de células cancerosas estimados pelo marcador e que fracção avaliada por exame microscópico. A correlação entre os dois métodos, calculada pelo coeficiente de correlação produto-momento de Pearson, era suficientemente alta (r = 0,85).

Aplicação da Fracção marcador

Nós aplicamos o marcador fração para comparar as frações de células de câncer entre as amostras de biópsia e espécimes cirúrgicos. As frações de células cancerosas em 39 amostras de biópsia e 96 espécimes cirúrgicos foram avaliados utilizando o marcador fração. Entre as 135 amostras,

TFAP2B

,

ARHGEF4

, e

RAPGEFL1

teve os maiores valores em 60, 37 e 38 amostras, respectivamente, e os maiores valores foram definidos como as fracções de células cancerosas nas amostras. A fração média de células cancerosas em amostras de biópsia (média ± SD, 53,5 ± 17,1%; gama, 7,3-86,7%) não foi significativamente diferente do que nas peças cirúrgicas (56,7 ± 18,9%; 14,0-87,3%) (p = 0,377) (Figura 4A). Os desvios eram grandes em ambas as amostras de biópsia e nas peças cirúrgicas, e não houve diferença significativa entre as amostras de biópsia e espécimes cirúrgicos (p = 0,076). Isto confirmou que a contaminação de células normais deve ser tomado cuidado para análise de amostras de ADN do tumor com o conteúdo das células de câncer desconhecidos.

(A) Aplicação do marcador fração para comparação da fração de células de câncer entre as amostras de biópsia e espécimes cirúrgicos. Frações de células cancerosas em 39 amostras de biópsia e 96 espécimes cirúrgicos foram estimados pelo marcador fração, e não foi observada diferença significativa. (B) Aplicação do marcador fracção para análise de metilação do DNA. valores beta-primas de dois locais CpG [cg22879515 (MIR34B), cg23180938 (CDO1)] foram corrigidas pelo conteúdo da célula de câncer em 28 ESCCs. Alguns ESCCs teve metilação quase completa (valor de β ≥ 0,8).

O marcador fracção foi também aplicado para excluir o efeito de contaminação das células normais na análise de metilação do DNA. Para este efeito, foram selecionados locais CpG dentro de 200 pb a partir de sites de início da transcrição (TSS200) por dois genes supressores de tumores (cg22879515 (

MIR34B

) [26], e cg23180938 (

CDO1

) [27]), e avaliadas distribuições de seus valores p obtidos na análise de metilação do genoma inicial. locais de CpG em TSS200 de genes supressores de tumores foram usados, uma vez que se esperava que não têm nenhuma ou metilação completa em amostras de cancro por causa da vantagem de crescimento conferida pela sua metilação. Os βvalues ​​dos dois locais de CpG foram menos do que 0,1 nos leucócitos periféricos, o pool de mucosas normais, e o conjunto de mucosas não-cancerosa, e os dois locais de CpG foram considerados quase completamente não metilada em células normais. valores de p em bruto dos dois locais de CpG e βvalues ​​corrigidos para o teor de células de cancro [Valor corrigido β valor β = /(uma fracção de células CICAc na amostra (%) /100)] foram então comparadas (Figura 4B). Utilizando os valores p corrigidos pelo marcador fracção, algumas amostras mostraram a metilação completa (β valor ≥ 0,8), algumas amostras mostraram quase nenhuma metilação (valor β 0,2). Este resultado sugeriu que, usando o marcador fracção, fomos capazes de minimizar o efeito de contaminação de ADN de células normais nas amostras tumorais de ADN para análise de metilação.

Discussão

Neste estudo, a fração de células cancerosas em uma amostra CICAc foi estimado com sucesso usando os níveis de metilação do DNA como um marcador de fração. Para alcançar este objectivo, foram isoladas três regiões genômicas (

TFAP2B

,

ARHGEF4

, e

RAPGEFL1

) que foram altamente e frequentemente metilado em células CICAc, mas não em células normais , por meio de análise de metilação do genoma. Este é o primeiro estudo em que uma fracção de células cancerosas numa amostra de ADN do tumor foi estimada utilizando a metilação de DNA. Recentemente, as regiões genómicas diferencialmente metilados entre o cancro e as células normais foram identificados em muitos tipos de cancros [14-18]. Portanto, podemos esperar para identificar regiões genômicas específicas altamente metilados e frequentemente em nos outros tipos de células cancerosas, mas não em células normais. Medindo os níveis de metilação do DNA de tais regiões genómicas específicas, a fracção de células cancerosas pode ser também estimada em amostras de DNA de outros tipos de cancros.

A precisão do marcador fracção foi verificada comparando a fracção de células cancerosas estimados pelo marcador fracção com que a estimada por exame microscópico. A alta precisão foi apoiada por uma boa correlação entre as frações de células de câncer estimados pelos dois métodos (r = 0,85). Além disso, os níveis de metilação de dois locais CpG em TSS200 de dois genes supressores de tumores (

MIR34B

e

CDO1

) foram corrigidos, e algumas amostras de cancro mostrou metilação quase completa. Scatter análise trama dos valores p antes e depois da correcção mostrou que algumas das amostras com valores baixos de p teve grandes aumentos (Figura S2). Praticamente, a fracção de marcador tem a vantagem sobre o exame microscópico, porque pode ser utilizado para amostras de ADN e única com a dedicação de patologistas experientes não é necessário. O nosso marcador fracção também tem uma vantagem sobre abordagens utilizando microarrays de SNP e NGS porque pode ser utilizada mesmo sem amostras emparelhadas normais, e podem ser analisadas de forma relativamente fácil e barata. Portanto, a utilização de um marcador fracção tem uma precisão razoável, e vantagens práticas sobre os outros métodos.

Uma limitação do nosso marcador fracção é que a estimativa pode ser influenciado pela heterogeneidade entre as células cancerosas, porque as três regiões não são sempre completamente metilado em células cancerosas. Uma vez que as células cancerosas são teoricamente clonal, a heterogeneidade foi considerado como sendo devido a metilação ou desmetilação durante a progressão do cancro. Para minimizar o efeito da heterogeneidade entre as células cancerosas, três regiões foram seleccionados como aqueles com a maior incidência de hipermetilação (βvalue 0,5) entre os 28 ESCCs. Nós também confirmaram que, usando oito amostras de cancro e de célula não cancerosa Purificou-LCM emparelhados, pelo menos, uma das três regiões foi quase completamente metilado em todas as células cancerosas. Outra limitação é que as alterações no número de cópias pode influenciar a dosagem. Para excluir os efeitos das alterações no número de cópias na estimação, também investigado no número de cópias alterações das três regiões em 15 ESCCs, e confirmou que as alterações no número de cópias que poderiam causar um grande desvio da estimativa da fração de células cancerosas não foram observados nas três regiões. Devido a estas características, o marcador fracção feito das três regiões pode ser utilizado para a grande maioria dos ESCCs. Finalmente, em Et3N amostra, uma amostra de células não-cancro Purificou-LCM, as três regiões foram ligeiramente metilado. Isto foi considerado como sendo devido a purificação incompleta pelo GCV, porque os limites entre os agrupamentos de células de cancro e de agregados de células não-cancerosas foram extremamente claro nesta amostra.

Em conclusão, a metilação de ADN pode ser utilizada para a estimativa da fracção de células cancerosas numa amostra de ADN do tumor. A estimativa é considerada como sendo um método prático e preciso para análise molecular de tecidos de cancro em que as células normais são quase sempre contaminados. O marcador fração de metilação do DNA é esperado para ser altamente vantajoso em muitos aspectos da pesquisa sobre o câncer.

Informações de Apoio

Figura S1.

nível de metilação Medido e verdadeiro fração de células cancerosas. Assumindo um ganho de 2 vezes do número de cópias estava presente em células de cancro, a verdadeira fracção de células cancerosas foi calculada como a [metilação nível medido (%) /(nível de metilação-200 medido (%))] x100. Assumindo um 0,5 vezes a perda do número de cópias estava presente nas células cancerosas, o verdadeiro fração de células cancerosas foi calculado como o [nível 2xMeasured metilação (%) /(100 + nível de metilação medido (%))] x100. Um desvio do nível de metilação do medido a partir da verdadeira fracção de células cancerosas foi calculado ser inferior a 17,2%, tanto no ganho de 2 vezes na perda e 0,5 vezes.

doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s001

(TIF)

Figura S2.

Comparação dos valores beta antes e depois da correção. valores beta-primas de dois locais CpG [cg22879515 (

MIR34B

), cg23180938 (

CDO1

)] foram corrigidos pelo conteúdo de células de câncer nos 28 ESCCs. O eixo dos X mostra os valores de p em bruto, e o eixo y mostra os valores de p depois da correcção.

doi: 10.1371 /journal.pone.0082302.s002

(TIF)

Tabela S1.

Primers e condições para MS-HRMA

doi: 10.1371. /journal.pone.0082302.s003

(DOCX)

Tabela S2.

Primers e condições para a PCR quantitativa

doi: 10.1371. /journal.pone.0082302.s004

(DOCX)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Sr. Mark Glaire para à prova de leitura do nosso manuscrito e National Cancer Research Center Núcleo Facilidade para a preparação de secções de espécimes cirúrgicos embebidos em parafina neste estudo.