Abstract

Fundo

KRAS, BRAF

e

PIK3CA

mutações são freqüentemente observadas em câncer colorretal (CRC). Em particular,

KRAS

mutações são fortes preditores de desfechos clínicos de tratamentos direcionados-EGFR, tais como cetuximab e panitumumab em câncer colorretal metastático (mCRC). Para a análise de mutação, os métodos atuais são demorados, e não prontamente disponível para todos os oncologistas e patologistas. Nós desenvolvemos um romance, sistema simples, sensível e totalmente automatizado molecular de diagnóstico (AMDS) para o ponto de teste de cuidados (POCT). Aqui nós relatamos os resultados de um estudo de comparação entre AMDS e sequenciação directa (DS) na detecção de

KRAS, BRAF

e

PI3KCA

mutações somáticas.

Metodologia /Principais Encontrando

O DNA foi extraído a partir de uma fatia de quer congelados (n = 89) ou fixados em formalina e embebidos em parafina de tecido (FFPE) CRC (n = 70), e, em seguida, utilizado para a análise de mutações por AMDS e DS . Todas as mutações (n = 41 entre congelado e 27 entre as amostras FFPE) detectados por DS eram também com sucesso (100%) detectados pela alts. No entanto, 8 amostras congeladas e 6 FFPE detectados como de tipo selvagem na análise DS foram mostrados como mutantes na análise AMDS. Por ensaios de clonagem-sequenciação, estas amostras discordantes foram confirmados como verdadeiros mutantes. Uma amostra tinha simultâneas “hot spot” mutações de

KRAS Comprar e

PIK3CA

e ensaio de clonagem comfirmed que E542K e E545K não estavam no mesmo alelo. tarifas das chamadas de genotipagem para DS foram 100,0% (89/89) e 74,3% (52/70) em amostras congeladas e FFPE, respectivamente, para a primeira tentativa; enquanto que a AMDS foi 100,0% para ambos os conjuntos de amostras. Para a extração automatizada de DNA e detecção de mutações por AMDS, tecidos congelados (n = 41) foram sucesso detectado todas as mutações dentro de 70 minutos.

Conclusões /Significado

AMDS tem sensibilidade superior e precisão ao longo do DS, e é muito mais fácil de executar do que a análise de mutações trabalho manual intensivo convencional. AMDS tem um grande potencial para o equipamento POCT para análise de mutação

Citation:. Kitano S, Myers J, Nakamura J, Yamane A, Yamashita M, Nakayama M, et al. (2013) A Novel Fully Automated System Molecular Diagnostic (AMDS) para Colorectal Cancer Detecção de Mutação. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10.1371 /journal.pone.0062989

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 08 de janeiro de 2013; Aceito: 27 de março de 2013; Publicado em: 09 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kitano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pela empresa dos autores (Toppan Printing CO., LTD.). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Esta pesquisa foi financiada pela empresa dos autores (Toppan Printing CO., LTD. ). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O humano

KRAS

oncogene é mutado em mais de 30% CRC, e mais de 3.000 mutações pontuais têm sido relatados até à data [1]. As alterações mais freqüentes são detectados no códon 12 (~82% do total de

KRAS

mutações) e no códon 13 (~17%), que estão ambos no exão 2 do

KRAS

gene [2] e parecem desempenhar um papel importante na progressão da [3] CRC.

BRAF

codifica uma cinase serina /thereonine que activa a via de Ras-MAPK, e a sua mutação têm sido encontrados em 4-15% de CRC.

PIK3CA

codifica a subunidade alfa P110 catalítica de PI3K [4], e PIK3CA mutado estimula a Akt e promove o crescimento celular em vários tipos de cancro, incluindo CRC [5].

PIK3CA

mutações foram descritos em 10% -30% de CRC [6], e estão associados com

KRAS

mutação. Houve um relatório que a presença de mutações no

PIK3CA

,

KRAS

, ou

BRAF

no CRC mostraram pior resultado para o paciente [7], e entre os pacientes que se submetem uma ressecção curativa do CRC,

PIK3CA

mutação está associada à sobrevida específica para o câncer mais curto [8]. No entanto, o efeito adverso do

PIK3CA

mutação pode ser potencialmente limitado a pacientes com

KRAS

do tipo selvagem tumores [8].

O cetuximab e panitumumab são fator de crescimento epidérmico eficaz receptor (EGFR) agentes para câncer colorretal metastático (CCRm) alvo, mas os pacientes cujos tumores têm KRAS

mutações exceto G13D são geralmente acreditava

[9] para não beneficiar destes agentes [10], [11]. Além disso, as mutações em

BRAF

e

PIK3CA

também têm sido relatados para afectar a eficácia dos agentes alvo EGFR [12], [13]. Dado o valor importante destas mutações na previsão de resultados clínicos em pacientes com CCRm, uma técnica rápida, confiável e sensível ao mesmo tempo detectá-los seria essencial para a farmacoterapia informados. Até à data, embora muitas tecnologias foram desenvolvidas, que estão limitados pelo procedimento complicado, custo elevado, baixa taxa de transferência ou outras questões. Por exemplo, sequenciamento Sanger direta (DS) é actualmente considerado ainda como um padrão de ouro para detectar essas mutações. No entanto, o método DS requer múltiplos passos, falta uma capacidade de análise automatizado. Ele também tem um longo de rotação em tempo e é em geral relativamente caros em comparação com outros métodos. Outros métodos recém-desenvolvidos, incluindo as tecnologias relacionadas ao PCR [14] – [17], plataformas de sequenciamento [18], [19] e outros métodos, como HRM (análise de fusão alta resolução) [20] análise são mais sensíveis e conveniente do que DS , no entanto, eles também são tempo- e [21] que consome trabalho, e não está prontamente disponível para a maioria dos médicos, que muitas vezes requerem que a amostra de tumor ser enviado para um laboratório de referência, resultando potencialmente atrasos de tratamento.

Nós desenvolvemos um analisador totalmente automatizado genética AMDS que inclui processos para a extracção de ADN /purificação, a amplificação de DNA (PCR), a detecção de mutações por Invader® química [22], [23], e a interpretação genótipo. AMDS pode chamar um estado de mutação automaticamente em 70 minutos após a adição de uma amostra (

por exemplo.,

Extraído ADN ou amostra de tecido homogeneizado genómico) ao cartucho. Aqui, nós relatamos um estudo de viabilidade de AMDS para detectar somática

KRAS

,

BRAF

e

PI3KCA

mutações nos tecidos CRC por comparação com o DS de maneira duplo-cego. O primeiro avaliada a sensibilidade do AMDS utilizando um ensaio de titulação com ADN de plasmídeo construído artificialmente. Um estudo clínico desempenho foi, em seguida, conduzido para avaliar ainda mais a precisão, especificidade e sensibilidade do sistema em comparação com o DS. Além disso, a análise de clonagem-sequenciamento foi realizado a fim de validar o status mutacional discordantes entre AMDS e DS. A versatilidade do sistema de detecção de mutações a partir de tecidos com diferentes fixadores (congelado de fresco e FFPE) também foi avaliado. Além disso, testou-se a capacidade do sistema de um modo totalmente automático: de extracção de ADN para a detecção de mutações, usando uma quantidade mínima ( 1 mg) de tecido congelado CRC

Materiais e Métodos

.

o DNA do plasmídeo

as mutações alvo foram 7 mutações pontuais nonsynonymous (G12a, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V e G13D) no exão 2 do

KRAS

gene, um sinónimo ponto de mutação (V600E) no exão 15 do

BRAF

gene e 5 mutações pontuais nonsynonymous no domínio helicoidal exão 9 (E542K, E545K, E545G) e exão 20 domínio quinase (H1047L, H1047R) do

PIK3CA gene, todas as mutações comuns em CRC humano. Esses mutantes e selvagens-tipos foram amplificados por PCR e clonado no plasmídeo pCR®2.1 (Invitrogen, CA, EUA), e os modelos de mutantes e de tipo selvagem sintetizados foram verificadas por sequenciação. O comprimento de todo o ADN de plasmídeo, incluindo a sequência de 300 pb foi alvo de 4,2 kb. Os DNAs de plasmídeo sintetizados foram suspensas em tampão TE e guardado a -20 ° C antes da utilização.

Espécime Secção CRC

tecidos CRC de secções congeladas de amostras (n = 89) e secções de amostra FFPE ( n = 70) usado neste estudo foram a partir do Human Tissue Resource Center da Universidade de Chicago. Todas as amostras foram diagnosticados como câncer de cólon ou reto por hematoxilina e eosina. Todos os tecidos foram CRC tecido primário removido cirurgicamente antes de outros tratamentos clínicos. Os tecidos foram cortados a um tamanho aproximado de 1,0 cm

2 × 10 um por micrótomo. As amostras cortadas de secção usados ​​para este estudo não foram realizadas por microdissecação manual (MMD). Nenhuma outra informação, incluindo dados demográficos e clínicos foram solicitados para estas amostras. O estudo foi analisado e aprovado pelo Conselho de Administração da Universidade de Chicago Institutional Review.

AMDS

AMDS é um sistema de análise genética totalmente automatizado com base em um DNA-chip, que tem 23 poços de reacção contendo os reagentes para ensaios de PCR e Invader® (Figura 1A e 1B). Quando um utilizador adiciona uma amostra (sangue completo, o ADN purificado ou homogenato de tecido) para o cartucho de purificação de ADN e inicia o software anexo, AMDS realiza a extracção do ADN, o ADN transfere para o chip, executa o ensaio de PCR e Invader®, lê os resultados e exibe julgando resultado em cerca de 70 minutos. fluxo Ensaio de detecção de mutações é mostrado na Figura 1C. No passo 1, o ADN é extraído e purificado pelo cartucho de purificação de ADN; no passo 2, a amostra de fluido de DNA purificado é transferido para o DNA-Chip; no passo 3, InvaderPlus® (PCR e Invader® reacção continuamente no mesmo tubo) é realizado; no último passo, AMDS reporta um resultado genotipagem da amostra. InvaderPlus® foi realizado sob as seguintes condições: desnaturação durante 2 minutos a 93 ° C, seguido de 30 ou 35 ciclos de 31 segundos a 93 ° C e 16 segundos a 66 ° C, e desactivação da polimerase de Taq durante 2 minutos a 97 ° C , seguido por 10 minutos de detecção de sinal a 61 ° C. sinal de fluorescência de FAM (fluorescência amino-hexil) foi monitorizada no canal F1 a 520 nm com excitação de 490 nm, e o sinal de fluorescência da RED (Redmond vermelho) foi monitorizada no canal F2 a 595 nm com excitação de 580 nm.

(A), (B) do sistema AMDS (DNA-chip, cartucho de purificação de ADN e invento) (C) Ensaio de fluxo de alts. (D) Princípio do algoritmo Invader® química (E) genotipagem de AMDS. tempo Ponto final, JP:: ​​EP tempo ponto de julgar, FNT: força de fluorescência de limiar negativo, F (EP): Intensidade de fluorescência na EP, F (JP): a força de fluorescência do JP, SR: Relação sinal, RPT: limiar relação positiva .

DNA-chip e purificação de DNA cartucho

Todos os chips de DNA e cartuchos de purificação de DNA foram fabricados em uma sala limpa ao nível da ISO mistura de classe 8. Necessário reagentes (1,99 mL ) para um chip de ADN que continha 0,1 mL de tampão de 1 M de MOPS (pH 7,7) (DOJINDO LABORATORIES, Kumamoto, Japão), 0,05 ul de 10 mM de cada trifosfato de desoxirribonucleótido (Roche, CA, EUA), 0,96 ul de 1 M de trealose (Hayashibara , Okayama, Japão) solução aquosa, 0,60 ul de 20 × mistura de oligo, 0,22 pi de 5,0 U /ul falcão polimerase Taq (Roche, CA, USA), 0,04 ul de 15000 U /ul Cleavase (Hologic, WI, EUA) foram dispensado e secou-se em cavidades de um chip de ADN. 20 × mistura de oligo foi preparado com 0,06 ul de 100 uM de iniciadores para a frente, 0,06 uL de 100 uM iniciador inverso, 0,06 ul de 50 uM de FAM-FRET (Fluorescence transferência de energia de ressonância) da cassete (Hologic, WI, USA), 0,06 ul de 50 uM de cassete de RED-FRET (Hologic, WI, EUA), 0,06 ul de DW (Água Destilada: Lonza, Basel-Stadt, Suíça), e um conjunto de 0,06 mL de 10 mM invasores oligonucleotídeo mais 0,06 mL de sonda alelo 100 mm para o tipo selvagem e tipo mutante. sequências de oligonucleotídicos utilizados neste estudo estão apresentados na Tabela S1.

O ácido nucleico foi purificado utilizando um cartucho de purificação de ADN contendo um filtro de vidro. ADN é adsorvido para sílica na presença de um sal caotrópico [24], [25]. Após o processo de purificação, 270 ul de amostra de ADN contendo MgCl

2 (6,25 mM) e NaCl (15 mM) foi injectado no DNA-chip.

A Princípio da InvaderPlus® Ensaio para a detecção de mutações

InvaderPlus® ensaio é baseado Invader®-química (Figura 1D) de detecção de mutação, nos quais reacção de PCR e Invader são realizadas consecutivamente no tubo único. Após o passo de amplificação por PCR, ADN polimerase é inactivado pelo calor, e reacção Invader® detecta a mutação no produto de PCR. Invadindo nucleotídeo oligo e ligam sonda alelo ao produto PCR formando estrutura de clivagem invasiva (1). Se a sequência da sonda de alelo está totalmente combinado com o produto de PCR, a sonda Cleavase® corta a provocar a libertação do braço. O braço libertada liga-se à sequência complementar da cassete de FRET. Finalmente, Cleavase® corta uma cassete de FRET, e separa fluorescência corante nucleótido modificado (F) a partir da cassete de FRET residual que contém inibidor (Q) na extremidade 3 ‘. Estas reacções são reciclados, e amplificação de sinal causa. Pelo contrário, quando a sequência da sonda tem um desfasamento-base com o produto de PCR, na sua extremidade 5 ‘, onde o oligo nucleótido invadindo e sonda de alelo tem uma estrutura base sobrepostos, Cleavase® não pode cortar a sonda de alelo. Como resultado, a sequência reaccional não ocorre, e a cassete de FRET é intacta (2). Duas cassetes de FRET são distinguidos através da utilização de corantes fluorescentes diferentes.

Algoritmo de genotipagem

O princípio e o fluxograma de genotipagem por AMDS é mostrado na Figura 1E. Quando ensaio Invader® estiver concluída, o software genotipagem compara a força fluorescente sinal no EP (hora Ponto final) descreveu como F (EP) e FNT (força fluorescente de limiar negativo). Se F (PE) é menos de FNT, a amostra é considerada como negativa (

E, G

, Amostra D) para a mutação. Se F (PE) é não inferior a FNT, em seguida, a sua relação sinal (SR), que é designado pela seguinte equação, é calculada.

SR representa uma eficiência de reacção de ensaio Invader®. Se o SR de uma amostra é maior do que o RPT (Rácio de limiar positiva), a amostra é considerada positiva para a mutação específica (

por exemplo

. Amostra A e B), mas se não for, a amostra é considerada como negativa (

por exemplo

amostra C). Cada RPT para todas as mutações detectadas neste estudo clínico foi definida com o tipo selvagem DNA plasmídeo mistura de 5% mutante 95% (Tabela S2.).

Direto Sequencing (DS)

Para o DS , os seguintes iniciadores foram utilizados para amplificar o

KRAS

gene: 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 ‘(F: iniciador directo), 5′-GTGTGACATGTTCTAATATA GTCA-3’ (R: iniciador reverso),

BRAF

gene: 5′-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ‘(F), 5′-AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’ (R) e

PIK3CA gene: 5′-ATGATGCTTGGCTCTGG AAT-3 ‘(F), 5 ‘-GGTCTTTGCCTGCTGAGAGT-3’ (R). O comprimento de cada produto da PCR foi

KRAS

: 214 pb,

BRAF

: 228 pb,

PIK3CA

EX9: 269 pb e

PIK3CA

EX20: 273 pb. Os produtos de PCR foram utilizando o kit de corante terminador grande v1.1 /ciclo de sequenciação 3,0 (Life technologies, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante sequenciado-ciclo. reacções de sequência foram, em seguida, submetido a electroforese num Applied Biosystems 3730 x G de DNA Analyzer (Life Technologies, CA, EUA).

estudo de titulação usando DNA de plasmídeo e de ADN genómico

Para avaliar a detecção de mutações sensibilidade de AMDS, foi conduzido um estudo de titulação de ADN de plasmídeo. amostras de titulação (quantidade de DNA de plasmídeo: 1 fg /poço, 10 fg /poço e 100 fg /poço) foram preparados como se mostra na Figura 2A. As misturas das amostras continha 30 ul de ADN plasmídico, 12 ul de NaCl 500 mM, 18 ul de 100 mM MgCl

2, e 240 ul de D. W. Cada amostra de ADN plasmídeo contém 100 ng /poço de testículos de salmão de cadeia simples de ADN (Sigma-Aldrich, MO, EUA). Além disso, a contribuição de sinal de volta à terra foi verificado com Novagen® de ADN genómico humano do sexo feminino (biosiences EMD, CA, EUA) (1 ng /poço, 10 ng /poço e 100 ng /poço).

(A ) estudo de titulação de ADN de plasmídeo. O DNA de plasmídeo foi construído para o total de 13 mutantes diferentes e 6 do tipo selvagem (

KRAS

: 1,

BRAF

: 1,

PIK3CA

: 2). estudo de desempenho clínico (B). 70 FFPE cortado e tecidos 89 tecidos em fatias congeladas foram testados. O ADN genómico foi extraído de tecido FFPE cortado por Epicentre® QuickExtract ™. O ADN genómico foi purificado a partir de tecido cortado congelado por QIAamp® ADN Micro kit. Além disso, como rodeada por linhas tracejadas, cerca de 1 mg de tecido cortado congelado foi homogeneizado e utilizada para a análise de mutações totalmente automatizado. (C) estudo de titulação de

KRAS

detecção da mutação G13D por DS. Os electroferogramas foram tomadas para diferentes mistura mutante-selvagem de DNA de plasmídeo (10 fg /reacção). (D) estudo de titulação para

KRAS

detecção da mutação G13D por AMDS. O gráfico mostra os dados de reação InvaderPlus® mescladas (n = 3) para diferentes mistura mutante-selvagem para

KRAS

detecção G13D por AMDS (◊; mt 100%, ○; mt 50%, △; mt 25% , Υ; mt 5%, *; mt 1%, +; 0,5% e ×; mt 0%). Quantidade de DNA de plasmídeo foi de 10 fg /poço. (E) eletroferograma de frente e análise da mesma amostra (ID = 56754) reversa. reacção (F) InvaderPlus® de uma amostra (ID = 56754) por AMDS.

Desempenho Estudo Clínico

O delineamento experimental para o estudo de desempenho clínico de AMDS é mostrado na Figura 2B . O ADN genómico a partir de secções congeladas de amostras (n = 89) foi extraído e purificado pelo QIAmp® ADN Micro kit (Qiagen, CA, EUA), e ajustado para 10 ng /ul. A amostra carregada para o chip de ADN continha 30 ul de ADN genómico de 10 ng /ul, 12 ul de NaCl 500 mM e 18 ul de 100 mM MgCl

2, e 240 ul de D. W. O ADN genómico a partir de FFPE secções (n = 70) foi extraído utilizando o QuickExtract ™ DNA Extraction Kit FFPE [Epicentre® (uma empresa Illumina®), WI, EUA], de acordo com as instruções do fabricante, e preparado como uma amostra de 50 × diluição. Carregando para o chip de DNA continha 30 ul de DNA extraído (× 50 diluição), 12 mL de NaCl 500 mM, 18 mL de MgCl 100 mM

2, 240 mL de DW

Análise Clonagem

análise de clonagem foi realizada para as amostras (n = 14) que tinha estado mutacional discordantes entre AMDS e DS. Inserir comprimentos de produtos de PCR foram 214 pb (

KRAS

), 228 pb (

BRAF

), 269 pb (

PIK3CA

EX9) e 273 pb (

PIK3CA

EX20). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S3. Os produtos de PCR foram preparadas usando ADN-polimerase e polimerase GoTaq® PrimeSTAR® GXL ADN. Os produtos de PCR foram digeridos por enzimas de restrição, e os fragmentos foram inseridos para pUC118 /HincII e pMD19 /EcoRV. clones inseridos foram reconhecidos pela triagem azul-branco. O ADN plasmídico foi amplificado por Kit ILUSTRAÇÕES TempliPhi DNA Amplification (GE Healthcare, Buckinghamshire, Inglaterra). DS foi realizada pela Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer.

Fully Automated Somatic Detecção de mutações por AMDS

Aproximadamente 1 mg de secções de amostras congeladas (n = 41) foram homogeneizadas durante 20 segundos por vidro homogeneizador, e 200 ul de DW foi adicionado. O homogeneizado foi transferido para o cartucho de purificação de ADN de AMDS, e o processo de detecção de mutações totalmente automatizado para

KRAS

e

PIK3CA

mutações foram conduzidos. As amostras congeladas que abrigavam

BRAF V600E

mutação não foram incluídos neste estudo, devido à quantidade limitada de DNA.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada para poder estatístico e os testes de coeficiente κ [26], que foram utilizados para comparar a ocorrência e grau de concordância na detecção de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

entre DS e AMDS.

Resultados

Comparando Mutation sensibilidade de Detecção entre AMDS e DS no DNA estudo de titulação plasmídeo

DNAs de plasmídeos Para avaliar a sensibilidade da AMDS, usamos serialmente diluídas contendo diferentes proporções do tipo mutante e selvagem de

KRAS

,

BRAF Comprar e

PIK3CA

genes. Quando a amostra continha menos do que 25% do ADN mutante, o pico mutação no electroferograma DS não foi capaz de ser distinguido do fundo (Figura 2C). Em contraste, AMDS claramente detectado

KRAS

mutações G13D a um nível de 5% (máximo de 0,5%) como mostrado na Figura 2D.

Comparando sensibilidade de detecção da mutação entre AMDS e DS no Estudo de Desempenho Clínico

O desempenho da detecção de mutação foi comparada entre AMDS e DS com dois conjuntos de amostras; tecidos congelados frescos (n = 89) e amostras de FFPE (n = 70) a partir de doentes (n = 153) com o CRC. as amostras congeladas e FFPE pares estavam disponíveis para seis pacientes, e o resto das amostras eram de pacientes independentes. A comparação foi realizada de um modo duplamente cego. Como mostrado na Tabela 1-3, todos os

KRAS

,

BRAF

e

PI3KCA

mutações detectadas pelo DS em qualquer congelado (número total de mutação, n = 41, 46,0 %) ou FFPE (n = 27; 38,5%) amostras foram também com êxito (100%) detectados pela alts. Não houve amostras que foram determinadas como mutantes em DS enquanto detectado como do tipo selvagem em AMDS. Nas amostras detectadas como selvagens-tipos de DS, no entanto, AMDS foi capaz de detectar mutantes adicionais nas amostras congeladas (n = 8, 9,0%) e FFPE (n = 6, 8,6%). Como mostrado na Tabela 4, as mutações em ambos

KRAS

e

PIK3CA

foram detectados por AMDS em 6 pacientes (6/153; 3,9%). Notavelmente, entre estas mutações que coexistem, tudo

PI3KCA

mutações foram especificamente E545K, enquanto o

KRAS

variadas mutações.

Resultados de DS e AMDS para um exemplo discordante são mostrados na Figura 2E e 2F. Esta amostra foi determinada plausivelmente como um mutante de acordo com o DS só com análise iniciador directo. Devido ao sinal de sequenciação pobre em análise iniciador inverso, esta amostra foi considerada como um tipo selvagem. Em contraste, AMDS tinha um sinal claro mutação. Todos os outros resultados discordantes (8 em tecido congelado, 6 em tecidos FFPE) tinham padrões muito semelhantes (dados não mostrados).

A validação de dados discordantes por clonagem e sequenciação

Todas as amostras que tinham discordante estado mutacional entre AMDS e DS foram validados por clonagem de análise (Figura 3A, B). A precisão da clonagem também foi avaliada com taxa de erro (ER) definida como a frequência de alterações de base na região inserida entre as colônias escolhido como seguinte equação; ER = o número de alterações /[(comprimento de inserção) x (número de sequência do clone bem sucedido)] x 100. As regiões clonados analisados ​​não têm um ponto quente para mutação diferente de pontos segmentados. Portanto as alterações de bases da sequência de consenso foram consideradas leituras erróneas pela polimerase de DNA. ER de PrimeSTAR® GXL (0,03-0,06%), que tem ‘→ 5’ actividade de nuclease exo 3, era consideravelmente menor do que a de GoTaq® (0,16-0,29%). A frequência de todas as mutações de interesse (Figura 3A, B) era muito maior do que ER (

P

= 1,04 × 10

-6), o que indica que as mutações nestas amostras eram verdadeiros mutações, eo discordância entre os dois métodos foi atribuída à menor sensibilidade do DS. Neste estudo, tamanho da amostra era bom o suficiente, uma vez elevado grau de poder no

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

detecção de mutações (

P

= 0,96, 0,97 e 0,94, respectivamente) por AMDS (Tabela 1-3). k testes de coeficiente de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

(κ = 0,91, 0,67 e 0,70, respectivamente) mutações indicadas baixo grau de coincidência entre AMDS e DS.

(A) A clonagem resultado da análise de tecidos congelados. (B) A clonagem resultado da análise de tecidos FFPE .; PCR foi realizada para ID congelada = 56756, ID = 63440 e FFPE ID = 41947, ID = 7053306 amostras com polimerase PrimeSTAR® GXL DNA. Outras amostras foram realizadas por PCR com ADN-polimerase GoTaq®. frequência de mutação potencial em uma amostra = (número de sequência mutante) /(número de sequência bem sucedida). Se a frequência era maior do que ER, a amostra foi considerada como positiva mutação. Nota: não foi confirmado se a taxa de mutação de uma amostra foi capaz de ser quantificados pela análise de clonagem. (C) Diagrama de Venn do

KRAS

,

BRAF Comprar e

PIK3CA

mutações. Neste gráfico, estas frequências de mutação não são calculados para amostras, mas para os pacientes. 6 amostras foram tomadas a partir mesmos tecidos e preparado para a fatia congelada e ambos FFPE. O AMDS análises para estes 6 amostras apresentaram mesmos resultados para ambos congelado e fatia FFPE.

Figura 3C resumem a frequência de mutações em todos os pacientes (n = 153) com base na detecção de AMDS. taxas de mutação de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

eram 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) e 10,1% (16/153) , respectivamente. A frequência de coexistindo mutações no

KRAS

ou

PIK3CA

foi de 3,9% (6/153).

AMDS e DS foram comparados pela sua robustez na detecção de mutação de amostras de DNA preparados utilizando métodos diferentes. O kit de purificação de DNA comercial Qiagen (QIAmp® DNA Micro kit) foi utilizado com tecidos congelados, e outro kit de extração de DNA comercial (Quick Extract ™) foi usado com tecidos FFPE. tarifas das chamadas de genotipagem para DS foram 100,0% (89/89) e 74,3% (52/70) em amostras congeladas e FFPE, respectivamente, para a primeira tentativa; enquanto que a AMDS foi 100,0% para ambos os conjuntos de amostras. A Figura 4A apresenta um caso de detecção de mutação G13D, em que a amostra foi colhida a partir do mesmo paciente e processado em ambas as fatias congeladas e FFPE. Enquanto a amostra congelada tem um electrofograma claro, a amostra FFPE mostrou sinais ruidosos. Dezoito amostras foram testadas novamente para DS, e 10 deles conseguiram. No entanto, 8 amostras não foram capazes de ser analisados ​​tanto na frente e direções depois de várias tentativas inverter. Fora destes 8 amostras, 7 amostras não puderam ser analisados ​​para o

BRAF

mutações, e uma amostra não puderam ser analisados ​​tanto para

KRAS Comprar e

PIK3CA

mutações. Em contraste, AMDS perfeitamente chamou essas amostras como tipo selvagem para o

KRAS

,

BRAF Comprar e

PIK3CA

genes.

tecidos CRC foram preparados para ambos formato congelado e FFPE. Estas amostras foram analisadas por ambos os DS e alts. DS falhou ao chamar o genótipo do tecido FFPE devido à electrophenogram barulhento. A mesma amostra foi re-sequenciados, e chamou como

KRAS

de tipo selvagem. os resultados da análise (B) amdS com diferente valor total de ADN de plasmídeo. símbolos sólidos (•; 100 fg /bem, ▪; 10 fg /poço, ▴; 1fg /poço) indicam sinal de amostras contendo 5% mutante, e símbolos vazios (○; 100 fg /bem, □, 10 fg /bem, △; 1 fg /poço) indicam g de ADN plasmídico aproximadamente 210 cópias contêm. os resultados da análise (C) amdS com diferentes quantidades de ADN genómico do tipo selvagem. (○; 100 ng /cavidade, □; 10 ng /poço, △; 1 ng /poço).

A robustez de detecção de mutação para uma vasta gama de concentrações das amostras foi também testada para alts. A Figura 4B mostra o resultado da experiência de ADN de plasmídeo. 5% de sinal de ADN mutante tinha clara separação de fundos para a gama de 1 fg /poço para 100 fg /poço de plasmídeo ADN total, o que corresponde a 10 cópias a 1000 cópias de ADN alvo mutante por reacção. número de cópias de um fg /poço de DNA de plasmídeo (210 cópias) é equivalente a 0,63 ng /poço de ADN genómico. A quantidade de ADN genómico (de tecidos congelados extraída) utilizados no estudo clínico desempenho foi de 10 ng /cavidade, e que cai na gama da experiência acima. No entanto, a fim de verificar o nível de sinal de fundo, foram realizadas experiências adicionais com várias quantidades de ADN genómico humano. A Figura 4C indica que os sinais de fundo são estáveis ​​e quase idêntico àquele do experimento DNA de plasmídeo (Figura 4B) para a gama de 1 ng a 100 ng por cavidade.

estudo de viabilidade de uma totalmente automatizada

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

detecção de mutações por AMDS

neste experimento, a extração de petróleo bruto de amostras de tecidos congelados (n = 41) foi realizada por esmagamento manual do , e o homogenato bruto foi então utilizado como uma amostra para a análise de mutações totalmente automatizado por alts.

os resultados da análise de mutação eram totalmente automatizado perfeitamente concordantes com os estudos anteriores de desempenho clínicos (Tabela 5). Além disso, AMDS foi capaz de detectar todos os mutantes (3/41) que DS não conseguiu detectar. Assim, AMDS poderia detectar todos

KRAS

(14/41, 34,1%) e

mutações mesmo a partir dessas amostras homogeneizado PIK3CA

(8/41, 19,5%) (~ 1 mg de tecido).

Discussão

Este estudo avaliou AMDS em duas séries (Congelados e FFPE) de tecidos primários CRC, totalizando 159 amostras. Nossos dados sugerem AMDS tem maior sensibilidade e versatilidade do que DS. A superior capacidade do nosso sistema pode ser atribuída à alta sensibilidade ( 0,5%) e a fidelidade da química Invader® que contêm a capacidade de amplificação do sinal [22], [23]. Isto é de particular importância para a detecção de mutações quando o nível mutante é extremamente baixo. Os resultados apresentados na Figura 4B e 4C sugerem AMDS pode manter uma sensibilidade de detecção de mutação de 5% com uma gama muito ampla (100 detém) da concentração da amostra. Além disso, Kotoura

et al

. relatado anteriormente que a eficiência da PCR de DS e em tempo real de ensaio baseado em PCR em amostras FFPE-DNA são sofridos por fragmentação de ADN [27]. Como mostrado na Figura 3 e na Figura 4A, os resultados da análise de mutações via AMDS foram suportadas pelos resultados de clonagem, e a AMDS mostraram uma superioridade significativa para o DS na sua sensibilidade através da vasta gama de quantidade de ADN e a variedade de condições de fixação.

Além disso, o sistema AMDS conseguiu uma detecção totalmente automatizado de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

mutações com amostras de CRC congelados homogeneizadas, o que é vantajoso para analisar amostras valiosos, tais como tecidos de biópsia. O procedimento de detecção de mutações de AMDS é muito simples e não requer técnica experimental e experiência.

Uma das coisas principais é que, na análise de clonagem, observamos que comumente usado Taq DNA polimerase comercial tem um não- so-baixo ER, enquanto DNA polimerase PrimeSTAR® GXL com um ‘→ 5’ actividade exo-nuclease 3 (revisão) tem menos ER. Portanto, quando uma sensibilidade ultra elevada é necessária para um ensaio, tal como a detecção de mutações de ADN isento de células em amostras de sangue (soro ou plasma), polimerase de DNA de alta fidelidade deve ser usado.

Como resultado da avaliação para o clínico tecidos de CRC (n = 159) utilizando AMDS, os padrões de mutação detectadas nas nossas amostras são muito consistentes com o que têm relatado anteriormente [28] – [30]. Observou-se a co-existência muito interessante de mutações múltiplas entre os três genes. Por exemplo, em 6º de 153 amostras (3,9%) possuía dupla (uma para triple) mutações, apoiando a hipótese de tumorigênese sinérgico entre

KRAS Comprar e

PIK3CA

[29], [31] . Além disso, havia duas amostras que possuíam ambos

KRAS

G13D e

PIK3CA

mutações (E542K E545K e /ou).