Abstract

Relatórios recentes têm indicado que

KRAS Comprar e

TP53

mutações prever a resposta à terapêutica no cancro colorectal. No entanto, pouco se sabe sobre a relação entre estas duas alterações genéticas comuns. Micro-RNAs (miRNAs), uma classe de RNA não-codificante implicados em processos celulares, têm sido cada vez mais ligada à

KRAS Comprar e

TP53

. Nossa hipótese é que letal-7a (deixe-7a) miRNA regula

KRAS

através de

TP53

. Para investigar a relação entre a

KRAS, TP53

, e deixe-7a, usamos HCT116

KRAS

mut

células de câncer colorretal humanos com quatro diferentes modificações genotípicas em

TP53

(

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

e

TP53

mut /-

). Usando essas células observamos que a atividade K-Ras foi maior em células com mutante ou nocauteado

TP53

alelos, o que sugere que o tipo selvagem

TP53

podem suprimir a atividade K-Ras. Deixe-7a estava presente em HCT116

KRAS

mut

células, porém não houve correlação entre o nível de deixá-7a e

TP53

estatuto genótipo. Para explorar como deixá-7a pode regular K-Ras nos diferentes

TP53

células de genótipos que usamos inibidor-7a deixe e demonstrou aumento da atividade K-Ras em todos os

TP53

, corroborando relatos prévios que deixe-7a regula K-Ras. Para avaliar potenciais implicações clínicas desta rede reguladora, examinamos a influência do

TP53

genótipo e deixe-7a inibição sobre a sobrevivência de células de câncer de cólon após quimioradioterapia (CRT). Observou-se que as células com a perda completa de tipo selvagem

TP53

alelos (

– /- ou

– /mut) eram resistentes a CRT após o tratamento com 5-fluorouracilo e radiação. Outras aumento na atividade K-Ras com a inibição let-7a não teve impacto sobrevivência nestas células. Em contraste, as células com o tipo selvagem simples ou dupla

TP53

alelos foram moderadamente sensível a CRT e exibiu resistência quando deixá-7a foi inibida. Em resumo, os nossos resultados mostram um sistema regulatório complexo envolvendo

TP53

,

KRAS

, e deixe-7a. Nossos resultados podem fornecer pistas para compreender e direcionar essas interações em câncer colorretal

Citation:. Luu C, Heinrich EL, Duldulao M, Arrington AK, Fakih M, Garcia-Aguilar J, et al. (2013)

TP53

e deixe-7a micro-RNA Regular K-Ras Atividade em células HCT116 câncer colorretal. PLoS ONE 8 (8): e70604. doi: 10.1371 /journal.pone.0070604

editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |

Recebido: 04 de março de 2013; Aceito: 21 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Luu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a 4

th câncer mais comum ea 2

nd causa mais comum de morte por câncer em os EUA [1]. Recentes avanços que melhoraram os resultados em CRC incluíram a identificação de biomarcadores moleculares prognósticos e preditivos precisos [2] – [4]. Estes incluíram alterações genéticas em

KRAS Comprar e

TP53

, que são frequentemente detectados em pacientes com CCR.

KRAS

mutações estão presentes em cerca de 30-50% de CRCs, mas também em 17-25% de todos os tumores humanos [2], [5] – [7]. Da mesma forma,

TP53

alterações são comuns em pacientes com CCR (quase 50%) [8]. Ambos os papéis prognósticos e preditivos foram identificados para ambos os genes [9]. Nosso próprio grupo e outros tem mostrado recentemente que a detecção do concorrente

KRAS Comprar e

TP53

mutações, com uma incidência de 5% a 20% em pacientes com CCR, correlacionada com a resistência à quimioradioterapia neoadjuvante ( CRT), em pacientes com câncer retal [10] – [12]. Apesar de a frequência dessas mutações no CRC, pouco se sabe sobre as interações entre os dois genes.

A ligação entre estes dois genes freqüentemente alterada em CRC pode estar em micro-RNA (miRNA), uma classe de não- codificação de ARN que funcionam na regulação da transcrição e, mais especificamente, pode influenciar a regulação da proliferação celular e apoptose [13], [14]. Relatórios recentes sugeriram que a actividade supressora do tumor de miARN 7a letal (let-7a) pode ser devido à sua associação com

KRAS e que a inibição do crescimento do tumor pode ocorrer por supressão da expressão K-Ras por let- 7a [15], [16]. Emergentes dados clínicos sugerem que a expressão intra-tumor let-7-A correlaciona-se com a resposta do tumor e sobrevida em pacientes com câncer colorretal metastático que receberam fator de crescimento epidérmico (EGFR) agentes segmentação tanto em

KRAS

de tipo selvagem e populações mutantes [17 ]. Estudos adicionais têm especulado que o papel da

TP53

no reparo do DNA e apoptose pode em parte ser regulados por miRNAs, incluindo deixá-7a [18], [19]. Portanto, uma rede de regulação complexo para

TP53

e

KRAS

podem ser ligados por deixá-7a.

Para investigar possíveis interações entre

TP53

,

KRAS

, e deixe-7a, analisamos uma família única de linhas celulares de cancro colorrectal com mutante

KRAS Comprar e modificações no

TP53

genótipo. Estas células nos permitiu analisar as mudanças na expressão e atividade K-Ras que correspondiam com variações em

TP53

genótipo. Além disso, fomos capazes de melhor interrogar o papel de deixá-7a no cenário da mutante

KRAS Comprar e vários

TP53

genótipos. Nossos resultados indicam novos aumentos na atividade K-Ras com diferentes

TP53

genótipos. No entanto, não encontramos uma clara relação entre o nível de deixá-7a e

TP53

genótipo. No entanto, mudanças na atividade K-Ras foram regulamentados através de let-7-A. Este primeiro relatório da

TP53

e deixe-7a regulação da atividade K-Ras fornece pistas para entender melhor a complexa interação entre

TP53

e

KRAS

.

Materiais e Métodos

Cultura de células

A linha de células CRC humano HCT116, abrigando um único mutante

KRAS

alelo e dê um duplo tipo selvagem

TP53

(

TP53

+ /+

) alelos, foi modificado em quatro linhas de células estáveis ​​com diferentes

TP53

genótipos (

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

e

TP53

mut /-

). O pai e linhas celulares modificadas foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [20]. Os alelos mutantes e knockout foram ambos utilizados para avaliar as diferenças de potencial entre os dois alelos, tal como sugerido em relatórios anteriores [21]. Todas as linhas celulares foram avaliadas por extração de DNA, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de

KRAS Comprar e

TP53

mutações genéticas para verificar genótipos. As células foram mantidas em meio McCoy 5A (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) com soro de bovino fetal a 10% (Omega Scientific; Tarzana, CA) e 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (Invitrogen; Carlsbad, CA) a 5% de CO

2 a 37 ° C

imunotransferência

Os lisados ​​celulares foram recolhidos usando tampão RIPA. (Invitrogen; Carlsbad, CA), mais os inibidores de protease (Thermo Scientific; Rockford, IL). Vinte microgramas de proteína foram separados em 12% de gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (Millipore; Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas durante 1 h com leite seco sem gordura 5% e sondadas durante a noite com anticorpos primários. Após a lavagem, as membranas foram marcadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (BioRad; Hercules, CA). As membranas foram reveladas utilizando um substrato quimioluminescente (Amersham Pharmacia; Piscataway, NJ) e fotografada. Os anticorpos utilizados foram: anti-K-Ras (Millipore) e anti-GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA):

K Ras-Activity

actividade

K-Ras foi medida usando as Ras. Activação Ensaio ELISA Kit (Millipore). Em resumo, os lisados ​​celulares foram incubados com Raf-1 Ras domínio de ligação agarose (RBD). Raf-1-RBD foi usada para capturar a proteína K-Ras ligada a GTP activo, o qual foi então detectado pela adição de um anti-K-Ras-anticorpo (Millipore). Foi então adicionado um anticorpo secundário conjugado com HRP. Um luminómetro foi utilizado para medir os sinais após a adição de um reagente quimioluminescente (Perkin-Elmer; Shelton, CT). Desde os ensaios foram realizados para avaliar as mudanças relativas de actividade K-Ras entre os diferentes

TP53

genótipos, atividade K-Ras do parental

TP53

+ /+ linha foi definido como 1. Para os ensaios com inibidor de let-7a, cada genótipo atuou como seu próprio controle. Três ensaios independentes foram realizadas para cada linha celular, e a absorvância ± o desvio padrão (SD) significa foi representada graficamente para cada linha.

Transcrição Reversa

RT-PCR foi realizada utilizando o Taqman ® ensaio de miARN (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, a transcrição reversa foi realizada utilizando o mestre Mix Plus celulares lisados ​​MultiScribe RT ™ de reagentes fornecidos e os primers específicos deixá-7A (Invitrogen). As reacções foram realizadas num termociclador a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, e 85 ° C durante 5 min.

PCR em tempo real

RT-PCR foi realizada utilizando as células Taqman® miARN de KIT CT ™ (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o produto de RT foi adicionado ao cocktail de PCR (reagente de ensaio de Taqman® miARN fornecida mais mistura principal Taqman®) e as reacções de RT-PCR foram corridos a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C no Applied Biosystems 7500 rápido sistema de RT-PCR (Foster City, CA). Cada amostra foi ensaiada em triplicado

Deixa-7a Inibidor

Deixe-7a foi inibida pelos inibidores de miARN miRIDIAN (Dharmacon; Lafeyette, CO). Seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células HCT116 (3 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite. Eles foram, em seguida, transfectadas com 100 nM de inibidor de miARN miRIDIAN durante 24 h. As células foram incubadas durante mais 48 h antes de serem utilizados em ensaios.

chemoradiation Terapia

células HCT116 foram tratadas com CRT de acordo com um protocolo estabelecido [22]. Após um total de 72 h de incubação com inibidor let-7a, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite. As células foram, em seguida, tratada com 4 nM de 5-fluorouracilo (5-FU) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante 16 h após o que foram expostas a 4 Gy de radiação. exposição à droga foi interrompida 6 h depois do tratamento por troca de meio. As células que não tinham sido tratados com inibidor let-7a foram tratados de modo semelhante com a CRT

Determinação da Viabilidade Celular

A viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio à base de ATP (Cell Titer-Glo;. Promega ; Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células HCT116 (5 × 10

3) foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. reagente celular Titer-Glo foi adicionado e induziu lise celular. Luminescência foi gravado com um luminómetro. Três experimentos independentes foram realizados. Os dados apresentados representam a viabilidade média, como uma percentagem da viabilidade das células não tratadas

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada no software Microsoft Excel. (Microsoft; Redmond, WA). Cada ponto de dados representa o valor médio de três experiências independentes. As condições de controlo e de tratamento foram comparados pelo teste t de Student e diferenças entre as linhas celulares foram comparadas por análise de variância (ANOVA). valor de P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

K-Ras Protein Nível não é dependente de

TP53

Mutation Estado

Para determinar o efeito de diferentes

TP53

genótipos na expressão K-Ras, ensaio western blot foi realizada para comparar os níveis de proteína. Nossos resultados mostram que os níveis de expressão K-RAS não foram influenciados pelos diferentes

TP53

genótipos (Figura 1A), sugerindo que

TP53

não regula a expressão da proteína K-Ras.

a) células HCT116 com as variações observadas em

TP53

estado de mutação foram recolhidas e lisadas por western blot para expressão K-Ras. GAPDH foi usada como um controlo de carga. B) Actividade de K-Ras foi medido em todas as linhas de células utilizando um ensaio ELISA suspenso Raf. Os resultados apresentados representam a média de 3 experiências independentes realizadas em triplicado em relação a

TP53

+ /+ células, p 0,05. As barras de erro mostram o desvio padrão (SD).

Efeito da

TP53

estado de mutação de K-Ras Atividade

O efeito da

TP53

genótipo sobre a actividade K-ras foi medida utilizando um ensaio de pull-down Raf. Descobrimos que a atividade K-Ras foi mais baixo em

TP53

+ /+

células. O aumento da atividade K-Ras foi mais pronunciado no

TP53

mut /-, seguido de

TP53

– /-,

TP53

+ /Mut, e TP53

– /+ (44%, 32%, 20%, e 10% de aumento, respectivamente, p 0,05) (Figura 1B). Estes resultados mostram que a actividade K-ras foi mais baixa em células de tipo selvagem com

TP53

alelos; e os níveis mais elevados foram identificados em células com deficiência homozigota do tipo selvagem TP53 alelos.

Deixa-7a é expressa em todas as linhas HCT116

Deixe-7a expressão em linhas celulares HCT116 foi medido por qPCR. Deixe-7a expressão foi detectada em todas as linhas celulares (Figura 2A). Não houve padrão de mudança nos níveis de let-7A que correspondeu a alterações no

TP53

genótipo.

A) expressão Deixe-7a foi medida através de qRT-PCR. Os dados mostrados representam um único qRT-PCR realizado em triplicado. B) As células foram transfectadas com 100 nM de inibidor de let-7a, durante 24 h. Proteína para controle e para as células inibidas deixá-7A foram coletadas para immunoblotting para a expressão K-Ras. GAPDH serviu como um controlo de carga

Deixe-7a não regular os níveis de proteína K-Ras

Deixe-7a expressão do gene foi inibida . 90% por qPCR. Os níveis de proteína K-Ras foram avaliadas através das

TP53

genótipos na presença ou ausência de inibição let-7. Os níveis de proteína K-Ras não foram alterados pela inibição deixá-7a (Figura 2B).

Deixe-7A Negativamente Regula K Ras-Activity

O efeito de inibição de deixá-7a em K-Ras também se determinou a actividade. Com a inibição let-7a, atividade K-Ras aumentaram em todos os

TP53

genótipos (Figura 3). Descobrimos que a actividade K-ras aumentada em 50% a 112% em comparação com let-7a células que expressam (p 0,05). O aumento percentual da atividade K-Ras em todas as linhas celulares não estava claramente associada a

TP53

genótipo e se nocaute ou mutantes alelos estavam presentes.

Os lisados ​​celulares foram recolhidos seguinte 72 h de incubação e submetidas para um ensaio de down-puxar Raf que mede a atividade K-Ras. Os dados apresentados representam três experimentos foram realizados em triplicado. As barras de erro mostram SD. * P . 0,05

Células com o tipo selvagem

TP53

alelos são sensíveis a CRT e deixe-7a inibição diminui a resposta à TRC

Células abrigar diferentes

TP53

genótipos foram tratados com CRT e a viabilidade celular foi medida (Figura 4). Células sem qualquer TP53 do tipo selvagem

alelo eram resistentes a CRT, enquanto que as células abrigando um TP53 do tipo selvagem única

alelo exibiram morte celular de aproximadamente 50%. CRT tratamento foi realizada novamente com let-7a inibição, que diminuiu a morte celular induzida por CRT em cerca de 20% em células portadoras de pelo menos um de tipo selvagem

TP53

alelo (p 0,05). As células com a perda de homozigoto de tipo selvagem

TP53

alelos (

– /- e

mut /-), o que se correlacionou com a actividade mais elevada do K-Ras (ver Figura 1B), não exibiu mudança nas viabilidade celular, independentemente das alterações nos níveis de expressão let-7A.

As células com diferentes

inibidor TP53

estatuto +/- deixá-7a foram tratados com 5-FU, seguida por radiação. A viabilidade celular foi medida. Os dados mostrados representam a média viabilidade como uma percentagem de células não tratadas. * P 0,05, ** p . 0,05

Discussão

KRAS Comprar e

TP53 Quais são mutações somáticas comuns com preditivo e prognóstico valor em pacientes com CRC. A detecção de seleccionar

in KRAS

mutações foi associado com o aumento do risco de recidiva da doença e morte [23] e previu resistentes a terapias anti-EGFR em CRC [9]. Da mesma forma, selecione

TP53

alterações têm sido associados com maus resultados no CRC [8]. Nós também têm relatado que a detecção simultânea de

TP53

e

KRAS

mutações em pacientes que receberam CRT neoadjuvante para câncer retal previu fracasso de resposta patológica completa [10]. Nesta investigação, buscou-se compreender melhor uma possível interação entre os dois genes. Identificamos deixá-7a como um potencial ligação entre o

TP53

e

KRAS

. caracterização prévia de let-7a revelou seu papel no controle da progressão do ciclo celular e divisão em cancros do pulmão e do cólon humano [24], [25]. Além disso, Johnson et ai. [15] descobriu que

expressão let-7 controlado negativamente KRAS

no câncer de pulmão. Além disso, Ruzzo et ai. [17] relataram uma sobrevida global melhorada em pacientes com elevado deixá-7a dentro de um

KRAS

população câncer colorretal mutante tratados com terapia anti-EGFR, sugerindo um papel inibidor do tumor para deixá-7a em

KRAS

-activated tumores.

TP53

tem sido conhecido por regular a expressão transcricional de miARNs [26], [27]. Portanto, teorizou a existência de uma série de medidas regulatórias de

TP53

deixar-7a a

KRAS

. Descobrimos que oncogênico atividade K-Ras foi regulamentada pelo

TP53

genótipo e deixe-7a; e alterações na sensibilidade, tanto influenciou a CRT.

Em nosso estudo utilizamos células CRC abrigando vários

TP53

genótipos. Estas células foram derivadas de uma linha celular parental que alberga o ganho de função

KRAS

mutação localizada no codão 13 [28], [29]. Não há justificativa para a utilização de células com knockout e mutante

TP53

alelos em nosso estudo. Apesar da perda comum de tipo selvagem

TP53

alelos, o nocaute e mutante

TP53

alelos não são iguais. perda completa da

TP53

alelos resulta em perda correspondente de actividade supressora de tumor, enquanto mutante

TP53

alelos podem expressar proteínas p53 que perdem actividade supressora de tumor, mas também ganhar propriedades oncogênicas [21]. No entanto, nesta investigação não fomos capazes de encontrar diferenças consistentes entre KO e mutante

TP53

alelos com relação a K-Ras actividade no início do estudo e em resposta a deixá-7a inibição, nem em resposta a CRT

Como observado anteriormente, observamos mudanças na atividade K-Ras com a inibição da expressão let-7-A. No entanto, não foram observadas alterações correspondentes na expressão da proteína K-Ras, que está em conflito com os relatórios anteriores demonstrando let-7 regulação miRNA de expressão K-Ras [30], [31]. No entanto, nossas descobertas são consistentes com mecanismos regulatórios estabelecidos de miRNA. Com efeito, miARN pode regular os genes através de uma variedade de mecanismos de tradução do mRNA a estabilidade no citoplasma a actividade do ciclo celular [14], [24]. As diferenças entre os nossos resultados e os de relatórios anteriores poderiam também ser devido a diferenças entre as espécies ou linhas celulares utilizadas. Assim, enquanto expressão K-Ras permaneceu inalterada pela inibição let-7a, nossos experimentos mostraram que a atividade K-Ras foi afetada por deixá-7a. Além disso, as células que abrigam homozigoto de tipo selvagem

TP53

alelos expressou a menor atividade K-Ras, o que sugere que o tipo selvagem

TP53

alelos podem suprimir a atividade K-Ras. Além disso, nossos resultados são consistentes com um relatório no câncer de pâncreas, mostrando um aumento na atividade K-Ras mutante quando

KRAS

foi emparelhado com mutante

TP53

[32]. Finalmente, a actividade K-Ras claramente aumentou quando deixe-7a foi inibida, independentemente do

TP53

genótipo, o que sugere uma maior regulamentação deixá-7a da atividade K-Ras.

A quimioterapia ea radioterapia são componentes importantes da a gestão multimodal de pacientes cirúrgicos com câncer retal; e CRT neoadjuvante tem sido associada com a doença de downstaging e diminuição da recorrência local [33], [34]. Em nossa investigação, descobrimos que células sem tipo selvagem

TP53

alelos eram resistentes a CRT e não exibiram morte celular quando tratados com CRT. Em contraste, as células com pelo menos um alelo selvagem (

TP53

+ /+, TP53

mut /+

, e

TP53

– /+) tinha aproximadamente 50% de morte celular quando tratada com CRT. Estes resultados são consistentes com os resultados de nossos estudos clínicos anteriores em que pacientes com mutações duplas (

KRAS Comprar e

TP53

) falharam em demonstrar uma resposta patológica completa após o tratamento com CRT neoadjuvante [10]. Ao deixar-7a expressão foi inibida (levando ao aumento da atividade K-Ras), as células falta de tipo selvagem

TP53

alelos (

TP53

– /- Comprar e

mut /-

) teve 100 sobrevivência da célula%. No entanto, em células que alberga pelo menos um de tipo selvagem

TP53

alelo (anteriormente mostrando alguma morte celular), sobrevivência celular aumentada em resposta a let-7a inibição. Estes resultados têm duas implicações importantes: (1)

TP53

genótipo influencia a atividade K-Ras e pode prever a resposta à TRC e (2) deixe-7A níveis de expressão influenciar a atividade K-Ras e pode alterar a resposta à TRC.

Em resumo, nós fornecer informações sobre potenciais mecanismos que ligam

KRAS

,

TP53

, e deixe-7a. Apesar de os mutantes duplos são relativamente raros, a condição parece ter um fenótipo com pobre resistência à TRC. Nossos resultados contribuem para uma melhor compreensão da conexão entre

KRAS Comprar e

TP53

. Conhecimento das vias que ligam

KRAS

,

TP53

, e deixe-7a pode proporcionar um maior conhecimento sobre os mecanismos de condução pobres fenótipo observado em certas mutações no CRC. Embora reconheçamos que as limitações do nosso estudo incluem a falta de

em

vivo

modelagem e as limitações da linha de uma célula, nosso foco era sobre a investigação do potencial de cross-talk entre let -7a e p53, que demonstram claramente que no nosso modelo. É possível que essa interação pode ser linhagem celular específica ou pode depender de outras vias aberrantes no HCT-116 (MSI-H,

PIK3

mutante). O trabalho futuro vai se concentrar em investigar os possíveis mecanismos de interação entre deixá-7a e p53 em diferentes linhas celulares colorretal e com perfis moleculares diferentes.