Abstract

O CCR6 receptor de quimiocinas foi mostrado recentemente para ser associado com câncer colorretal (CRC ) progressão. No entanto, a evidência direta para se CCR6 em tumores é um marcador de prognóstico para a sobrevida de pacientes com CRC e se desempenha um papel crítico na CRC metástase

in vivo

está faltando. Aqui mostra-se que os níveis de CCR6 foram regulados positivamente em linhas celulares de CRC e amostras clínicas primárias CRC. CCR6 upregulation estava estreitamente correlacionada com os estágios da doença e o tempo de sobrevivência de pacientes com CCR. Knockdown de CCR6 inibiu a migração de células CRC

in vitro

. Superexpressão de CCR6 em células CRC aumentou a sua proliferação, migração e formação de colônias

in vitro

e promoveu o seu potencial metastático

in vivo

. CCR6 activado Akt sinalização, genes regulados positivamente metástases e regulados negativamente genes supressores de metástase. direccionamento selectivo de CCR6 em tumores inibiu dramaticamente o crescimento de CRC em ratinhos. Assim, a expressão tumoral de CCR6 desempenha um papel crítico na CRC metástase, regulada CCR6 prediz a sobrevivência pobre em pacientes com CCR, e visando expressão CCR6 em tumores pode ser uma estratégia terapêutica potencial para CRC

Citation:. Liu J, Ke M, Xu Z, Z Liu, Zhang G, Yan S, et al. (2014) CCR6 é um marcador de prognóstico para a sobrevida global em doentes com cancro colorectal, e sua sobre-expressão Melhora Metástase

In Vivo

. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10.1371 /journal.pone.0101137

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 26 Janeiro, 2014; Aceito: 03 de junho de 2014; Publicação: 30 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China e 973 do Programa (Não: 91029730, no: 81202304, no: 2012CB917100, no: 2010CB529700 e Não: 30972787), pelo Programa de Professor de Nomeação especial (Eastern Scholar) em Shanghai instituições de ensino superior, por parte da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (Não: 09140902600), pelos principais Academic Projeto Disciplina da Comissão de Educação Municipal de Xangai (Não: J50208 e Não: J50207), pela Shanghai Programa Pujiang (Não: 10PJ407300 ), e pelo Comitê de Xangai da Ciência e Tecnologia (11DZ2260200). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é um importante problema de saúde em todo o mundo. Embora o progresso substancial foi feito na última década, os desafios de tratar CRC e suas metástases permanecem formidável [1]. Atualmente, apesar do uso de drogas ativas específicas para o tratamento de câncer colorretal metastático se tornando mais popular, as taxas de cura são baixas e os mecanismos moleculares subjacentes para a metástase orientada para o órgão da CRC não são totalmente compreendidos.

As quimiocinas são 8 – a péptidos 12-kDa que funcionam como citocinas quimiotáticas e exercem os seus efeitos biológicos através da interacção com os receptores de quimiocina transmembranares ligados a proteína G. Um certo número de quimiocinas e seus receptores correspondentes são conhecidos por desempenhar um papel importante no tráfico de leucócitos e direcção, especialmente nos locais de inflamação, danos nos tecidos e a migração de células malignas [2], [3]. Curiosamente, enquanto a maioria dos receptores de quimioquinas se ligam a várias quimiocinas, o receptor de quimiocina CCR6 tem apenas um ligando de quimiocina, CCL20 (anteriormente conhecida como proteína-3α inflamatória de macrófagos ou de MIP-3α) [4].

CCR6 é expresso primariamente em leucócitos, com expressão em linfócitos maduros, especialmente em células de memória [4], células dendríticas imaturas (DCs) de linhagens particulares [5] e a migração de células T reguladoras [6]. Na maioria dos casos, CCR6 está ausente de granulócitos (excepto neutrófilos activados), células monocíticas, linfócitos imaturos, e DCs maduras [7] – [9]. CCL20 mostra tanto a expressão constitutiva e induzível, principalmente em tecidos linfóides associados a mucosas e no fígado [10], e a taxa de expressão basal é aumentada em condições inflamatórias [11]. O nível de expressão basal de CCL20 é pensado para regular a migração de DC imaturas que expressam CCR6 e linfócitos de memória a partir do sangue para a vigilância homeostático. A sobre-regulação de CCL20 durante a inflamação pode aumentar a migração de ambos estes tipos de células no tecido [12] – [14]. Para cancros humanos, os dados acumulados implicam uma associação entre o sistema receptor de quimiocina-quimiocinas e o potencial metastático das células cancerosas. Por exemplo, as células tumorais a partir de, pelo menos, 23 tipos diferentes de cancros humanos de epitelial, mesenquimal e origem hematopoiética CXCR4 expresso [15], [16]. CCR7 também foi encontrada em mama, gástrico e câncer epidermóide do esôfago, e sua expressão foi correlacionada com mau prognóstico [15], [17], [18]. Todos estes estudos mostram que a expressão de receptores de quimioquinas em metástases do cancro não é aleatória.

O CCR6 receptor de quimiocina é de particular interesse na metástase do fígado de cancro colo-rectal. A sua única CCL20 ligando quimiocina é predominantemente expresso em tecido linfático e no fígado [19]. A expressão aberrante do CCR6 receptor de quimiocina em células de CRC é apontada como estando envolvida na metástase de tumores de órgãos selectivo [20], [21]. No entanto, o direto

in vivo

evidências que suportam um papel para CCR6 na metástase do CRC está faltando. No presente estudo verificou-se que a expressão CCR6 regulada positivamente em linhas celulares de câncer colorretal metastático previu pobres sobrevivência para pacientes com CCR. A superexpressão de CCR6 foi suficiente para promover a metástase das células CRC ambos

in vitro

e

in vivo

. Selectivamente bloquear a função CCR6 inibiu dramaticamente o crescimento de CRC em ratinhos. CCR6 exibe um papel direto na metástase do CRC humana, possivelmente através da regulação de genes relacionados com a metástase.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Comitês do Hospital da Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China.

Todos os ratos foram mantidos sob específicas de livre de patógenos (SPF) condições em conformidade com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Laboratório animais e com a aprovação (SYXK-2003-0026), da Investigação Conselho Científico da Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, China. Para amenizar o sofrimento de ratos observados durante estes estudos experimentais, os ratos foram sacrificados por CO

2 inalação.

A tissue microarray incluindo 191 cancro colorectal humana e amostras para-tumorais correspondentes foi comprado a partir do Centro Nacional de Engenharia para biochips em Xangai. consentimento informado por escrito, do dador foi obtido por utilização de suas amostras para fins de investigação. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da ressecção cirúrgica. Os tecidos do cólon não-cancerosas adjacentes foram obtidos a partir de um mínimo de 2 cm de distância do tumor para assegurar que estes tecidos eram livres de células cancerosas. Os espécimes foram rotineiramente fixadas em formol a 10% no pós-operatório imediato e embebidos em parafina dentro de 24 horas após a remoção.

Ratos

C57BL /6J, Balb /c e B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (designado como CCR6

– /-). camundongos foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

as linhas celulares de CRC e culturas Celulares

Um imortalizado células de rim embrionário humano a linha, HEK293T, foi cultivada em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Hyclone) com soro fetal bovino a 10% (FBS). A linha celular colorrectal CMT93 rato foi mantida em DMEM suplementado com FBS a 10%. Outra linha de células de rato colorrectal, CT26, foi mantida em meio RPMI-1640 com 10% de FBS. HEK293T, CMT93, CT26 e sete linhas celulares de CRC humanos, Caco-2, SW480, HT-29, HCT116, SW1116, SW620 e LoVo, foram todos obtidos a partir da Cell Bank da Comissão do Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China), em que foram caracterizados por fingerprinting de DNA, a detecção de micoplasma, e a vitalidade das células. células Caco-2 foram cultivadas em Mínimo de Eagle Essential Médium (Gibco) com 20% de FBS. As células HT-29 e HCT116 foram cultivadas em meio 5a de McCoy (Gibco) com 10% de FBS. SW1116, as células SW480 e SW620 foram cultivadas em de Leibovitz L-15 (Gibco) com 10% de FBS. LoVo foram cultivadas em F-12K (Gibco) com 10% de FBS. Todas as células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar, excepto SW1116, SW480 e SW620, que foram cultivadas em 100% de ar a 37 ° C.

A imuno-histoquímica

para immunohischemistry, cortes de tecido (5

mm) foram cortadas a partir de blocos de rotina, de-parafinado com xileno, reidratados e submetidos métodos induzidas por calor para recuperação de epitopo (HIER) antes da incubação com os anticorpos apropriados. As secções foram imersos em 10

mM de tampão de citrato de sódio a pH 6,0 e foram subsequentemente aquecida numa panela de pressão para 10

min. Depois de enxaguar em água corrente e PBS, as secções foram incubadas em solução de bloqueio /5% de soro normal de cabra TBST durante 0,5 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo anti-CCR6 monoclonal humano (diluição 1:50; R D Sistema, clone: ​​# 53103). Esta diluição foi considerada óptima após titulação de anticorpos usando amígdalas humana como controlo positivo. Um rato IgG irrelevante

2b anticorpo foi utilizado como um controlo do isotipo em todos os casos para demonstrar que a coloração era específico para CCR6. No dia seguinte, as secções foram marcadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP apropriados, desenvolvido com diaminobenzaminidine (DAB) e contrastadas com hematoxilina.

Avaliação da coloração Immunohischemistry

Para a avaliação visual, a avaliação de imunocoloração foi realizada de forma independente por dois patologistas que foram cegados aos dados clínicos dos pacientes. Como anteriormente realizadas por outros [18], criamos uma pontuação imunorreativo multiplicando a pontuação para a percentagem de células positivas, ea pontuação para a coloração de intensidade. A pontuação para a percentagem de células tumorais positivas foi classificada como se segue: 0, nenhum; 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; e 4, 75-100%. intensidade da imunocoloração foi classificado como se segue: 0, nenhum; 1, fraco; 2, intermediário; e 3, intensa. Dividimos todas as amostras (n = 191) em dois grupos (baixa ou alta expressão CCR6) de acordo com o princípio mediana. Para comparar a expressão diferencial CCR6 nos tecidos do cólon cancerosas e tecidos normais adjacentes emparelhados em cada estádio clínico, a quantificação da intensidade da imunocoloração CCR6 específica foi realizada usando software de imagem em gel (IPWIN60). Resumidamente, a imunocoloração CCR6 de todos os tecidos do cólon e cancerosos correspondentes tecidos do cólon não-cancerosas adjacentes no chip de arranjo de tecido foram fotografadas com um microscópio com uma ampliação de 100 vezes (Carl Zeiss). O software de imagem em gel (IPWIN60) foi usada para calcular os valores de densidade óptica em imagens capturadas. Utilizou-se o valor de DO média de três imagens de cada núcleo sobre as lâminas de matriz de tecidos, e a expressão diferencial CCR6 no tumor e tecidos adjacentes normais combinados em cada estágio clínico foram comparados.

Cicatrização de Feridas Ensaio

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr e LoVo

células shCCR6 foram semeadas separadamente em placas de seis poços, cultivadas até quase 80% confluentes e privadas de soro durante 24

hrs. feridas artificiais foram criados por raspagem as monocamadas com uma solução estéril de 10

μ l

ponta, e as células foram lavadas com PBS várias vezes para remover as células flutuantes. Imagens representativas de células que migram para as feridas foram capturados após 0 horas e 24 horas sob um microscópio (20 ×).

Transwell Migração Ensaio

Transwell secções de filtro de membrana de tamanho de poro de 8 mm inserções (Corning, EUA) foram utilizados para determinar a capacidade de migração celular. De FBS foi usado como o quimioatractor. Resumidamente, HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr e LoVo

shCCR6 foram colhidas e re-suspensas em meio isento de soro. Uma quantidade de 3 × 10

4 células foi adicionado na câmara superior e incubaram-se durante 24

horas a 37 ° C. As células que migraram através da membrana à superfície inferior foram fixadas com metanol frio para 10

min, manchado com 0,1% de violeta de cristal para 30

min, lavadas, secas ao ar, fotografado e contabilizados .

Formação de Colónias Ensaio

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr e SW1116

CCR6 células foram semeadas separadamente em placas de seis poços a uma densidade de 600 células /poço. Os meios foram mudados duas vezes por semana, e depois de 14 dias, as células foram fixadas com metanol durante 10 minutos, coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 15 min, lavado três vezes com PBS para remover o excesso de corante, fotografadas e contadas.

Análise western Blot

Os seguintes anticorpos primários foram utilizados para a transferência de western: CCR6 humano (# 14-1969, eBioscience ™ San Diego, EUA), CCR6 rato (# ab78429, Abcam), β-Actina ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (# 4691, a tecnologia de sinalização celular), fosfo-Akt (Thr308) (C31E5E) Rabbit fosfo-Akt (Ser473) Rabbit mAb (# 4060, a tecnologia de sinalização celular) mAb (# 2965, a tecnologia de sinalização celular), p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (137F5) mAb Coelho (# 4695, a tecnologia de sinalização celular), fosfo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) mAb de coelho (# 4376, Cell Signaling tecnologia). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626201, BioLegend), uPAR (# sc-10815, Santa Cruz Biotechnology), CDH1 (# 3195P, Cell tecnologia de sinalização), BEIJA-1 (# sc-18134, Santa Cruz Biotechnology ), e TIMP2 (# 635401, BioLegend). A análise Western blot foi realizada tal como publicado anteriormente [22].

Construção do vetor

O vector lentiviral PGC-FU-Luc foi construído através da introdução do gene da luciferase do pirilampo (Luc) a jusante do promotor de CMV no vector plasmídeo PGC-FU que transporta o gene de resistência à neomicina. O vector de transporte lentiviral pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 foi construída para sobre-expressar de forma estável CCR6 em Luc-HCT116. Resumidamente, a sequência de codificação de 1125 pb de CCR6 humana (NM_004367) foi amplificado a partir do molde de ADNc de CMSP humanas e subclonado nos locais XhoI e BamHI do vector pLVX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, EUA). O vector de transporte pLVXshRNA2 lentiviral (Clontech Laboratories, EUA) foi utilizado para expressar shRNAs a partir do promotor U6. Além de expressar shRNAs, pLVX-shRNA2 também expressa a proteína verde fluorescente ZsGreen1. Para o knockdown de CCR6, quatro sequências alvo foram concebidos. As sequências alvo utilizadas foram as seguintes: shCCR6-1, 5′-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 ‘; shCCR6-2, 5’-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 ‘; shCCR6-3, 5’-TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 ‘; shCCR6-4, 5’- GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 ‘. controle mexidos, 5’- TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 ‘. Em resumo, os oligonucleótidos de ADN complementares que consistiu de um 21 nucleótidos específica da sequência seguido pela sequência do loop (CTCGAG) e, finalmente, o complemento inverso da sequência de direccionamento foram sintetizados, recozida, e inserido no pLVX-shRNA2 vector (Clontech) entre BamHI e locais EcoRI a jusante do promotor U6. Quatro pLVX-shRNA2-CCR6 plasmídeo de vaivém foram transfecção transiente na HEK 293 células T com lipofectina, a RT-PCR foram rastreados para a expressão de ARNm CCR6 mais eficiente knockdown, um plasmídeo ShCCR6-1 mostrando aproximadamente 75% de diminuição de ARNm CCR6 na SW480 as células foram pegar para o seguinte CCR6 estável knockdown CRC construção da linha celular.

lentivírus Produção e Transdução

os lentivírus foram produzidas e colhidas 72 horas após a transfecção de 293 células T com lentivírus e os plasmídeos de empacotamento pMD2.G e psPAX2 usando profecção Mammalian sistema de transfecção (Promega). Após filtração através de um de 0,45 mícrons baixo proteína de ligação-polysulfonic filtro (Millipore), o sobrenadante foi recolhido separadamente e centrifugado durante 10 min a 2000 x g, 4 ° C antes de se filtrar através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 uM novamente. O efluente foi utilizado directamente para a transdução de células de cancro colorrectal humano. Para a experiência de knockdown, seis linhas clonais foram rastreados para a expressão CCR6 por western blotting. Transfectadas estavelmente linhas de células SW480 e LoVo mostrando eficiente proteína diminuída CCR6 foram triados e posteriormente purificado por células activadas por fluorescência para experimentos a jusante. Para o experimento superexpressão, duas linhas de células HCT116 transduzidas foram gerados: HCT116 superexpressão ZsGreen1 (HCT116

Ctr) e HCT116 superexpressão dos genes CCR6-ZsGreen1 bicistrónicos (HCT116

CCR6). O ZsGreen1

+ células HCT116 ou ZsGreen1

+ CCR6

+ células HCT116 foram ainda purificados por fluorescência de células activadas triagem e expandiu-se em meio de cultura. Da mesma forma, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, também foram gerados SW1116

Ctr e SW1116

células CCR6. Além disso, três linhas de células HCT116 transduzidas foram produzidos para

In vivo

experimentos: HCT116 superexpressão estavelmente o gene Luc (Luc-HCT116) com a seleção G418, HCT116 com superexpressão do gene Luc e o gene ZsGreen1 (Luc-HCT116

CTR) e HCT116 com superexpressão do gene Luc e os genes CCR6-ZsGreen1 bicistrónicos (Luc-HCT116

CCR6). ZsGreen1

+ células Luc-HCT116 ou ZsGreen1

+ CCR6

+ células Luc-HCT116 foram ainda purificados por células activadas por fluorescência e ampliado nos meios de cultura.

Tumor Humano Metástase PCR matriz

HCT116

Ctr ou HCT116

CCR6 células foram lisadas directamente em reagente Trizol, e o ARN total foi extraído de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Subsequentemente, o sistema de síntese de Super Script III (Invitrogen) foi utilizado para a síntese de cDNA. PCR em tempo real foi realizada em cada amostra utilizando o tumor humano Metástase RT

2 Profiler PCR Array (Super matriz Bioscience, EUA) em um rápido em tempo real do sistema de PCR ABI 7900HT (Applied Biosystems, EUA). Human β-actina foi utilizada para a normalização pelo método ΔΔCt.

Experimental

in vivo

Liver Metástases Modelo

Liver capacidade metastática foi determinada pela injeção de 1 × 10

6 células por ratinho para o baço de ratinhos nus BALB /c. Resumidamente, ratinhos nus BALB /c foram anestesiados por injecção i.p. injeção de Pelltobarbitalum Natricum e 1 × 10

6 HCT116 células tumorais

Ctr ou HCT116

CCR6 em 25 mL foram injetados no baço exteriorizado com uma seringa de insulina (empresa BD) após a incisão abdominal. Cinco minutos após a injecção das células, os vasos sanguíneos do baço foram ligados, e o baço foi removido. Finalmente, a ferida abdominal foi fechada com agrafos. Após 5 semanas, os ratos foram sacrificados e os fígados foram removidos e fotografados.

Experimental

in vivo

Lung Metástase Modelo

Sete homens de 7 semanas de idade BALB /c ratinhos nus em cada grupo foram injetados com Luc-HCT116

Ctr ou Luc-HCT116

células CCR6. Resumidamente, 5 x 10

6 células em suspensão em 200 ul de PBS foram injectadas na veia da cauda de cada ratinho BALB /c nu. Após 6 semanas, os animais foram sacrificados e examinados macroscopicamente e microscopicamente quanto à presença de metástases. Para imagiologia de pequenos animais de todo o corpo, os ratinhos receberam 150 ug /g de substrato de D-luciferina em PBS estéril através de injecção intraperitoneal e depois anestesiados com isoflurano. bioluminescência imagens foram capturadas com um dispositivo de acoplamento de carga (200 de sistema Xenogen IVIS, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, EUA) dentro de 15 min após a injecção do substrato.

Singênico enxerto Modelo CRC e anti-CCR6 Terapia

células CMT93 em 100 ul de PBS foram injectados por via subcutânea (sc) no macho de 6 semanas de idade, CCR6

– /- ratos (1 x 10

6 células /rato), ou CT26 células em 100 ul PBS foram injectados SC em ratinhos BALB /c macho de 7 semanas de idade (1 × 10

6 células /ratinho). Dez dias após a inoculação de células tumorais, quando as células tumorais formados tecidos tumorais sólidos, enxertado CCR6

– /- ratos ou ratinhos BALB /c foram divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento com o controlo de IgG ou anti-CCR6. Vinte microgramas de IgG

2A (R amp; D System, o clone # 54447) dissolvido em 100 ul de PBS ou 20 ug CCR6 (R amp; D System, o clone # 140706) dissolvido em 100 ul de PBS foi injectada separadamente nos locais tumorais todos outro dia por 18 dias. Após 28 dias, os ratinhos foram sacrificados, e os xenoenxertos foram removidos, pesados ​​e fotografado. Para a análise de Western blot, policlonal anti-murganho CCR6 (# ab78429, Abcam) foi usado como o anticorpo primário.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software GraphPad Prism 5.01. Os testes estatísticos para análise de dados incluiu o teste de log-rank, o teste exato de Fisher, o teste do qui-quadrado, o teste de Wilcoxon e o teste U-Mann Whitney. A análise estatística multivariada foi realizada utilizando um modelo de regressão de Cox. Os dados quantitativos foram apresentados como os valores médios ± desvios padrão (SD). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em valores de *

p Art 0,05, **

p Art 0,01 e ***

p Art 0,001.

resultados

regulação positiva de CCR6 está correlacionada com a progressão tumoral

Para investigar a relevância clínica da CCR6 upregulated no CRC, foram coletadas 191 amostras de tecido CRC primários embebidos em parafina (Tabela S1), e expressão CCR6 níveis foram examinados em todas estas amostras usando imuno-histoquímica. A correlação de expressão CCR6 com características clínicas e a sobrevivência de pacientes com CCR foram resumidos (Tabela S2). As análises estatísticas revelaram que a expressão CCR6 foi significativamente correlacionada com o estágio clínico (

p

= 0,0117), classificação N (

p

= 0,0309), a classificação M (

p

= 0,0334) e status vital (

p

= 0,0019) em pacientes com CRC (Tabela S2). Além disso, verificou-se que a expressão CCR6 foi marcadamente regulado positivamente em todas as amostras de CRC clínicas analisadas, mas foi apenas detectável em níveis baixos no tecido paratumor (Figura 1A), e análise univariada revelou uma forte associação entre CCR6 intensidade de coloração e estágios de tumor (n = 14,

p

= 0,0039; n = 104,

p Art 0,0001; n = 57,

p Art 0,0001; n = 16,

p

= 0,0005) (Figura 1B). Estes dados sugerem que CCR6 regulação positiva está fortemente associada com a progressão clínica da CRC humano.

(A) coloração imuno-histoquímica de CCR6 no CRC primária derivada de 191 pacientes de CRC no estágio clínico I-IV. (B) de análise de imagem digital foi realizada a contagem intensidade de coloração da fração de área CCR6 (CCR6-AF) valores de amostras para-tumor /tumorais emparelhados em cada estágio clínico, teste de Wilcoxon.

regulada CCR6 Indica mau prognóstico para CRC pacientes

É importante ressaltar que nós demonstramos que a expressão CCR6 foi inversamente correlacionada com o tempo de sobrevivência (

p Art 0,001) (Figura 2A). Além disso, a expressão CCR6 foi correlacionada com sobrevida global para o subgrupo de pacientes no estágio clínico diferente, significativamente na fase IV (

p Art 0,05) (Figura 2B-E). Além disso, análises uni e multivariada revelou que a classificação M e expressão CCR6 foram cada reconhecidos como fatores prognósticos independentes no CRC (Tabela S3). Em conjunto, estes dados sugerem que CCR6 tem valor clínico potencial como um biomarcador preditivo para a evolução da doença em pacientes com CCR.

curvas (A) de Kaplan-Meier de doentes com CRC baixo contra alta expressão de CCR6 (n = 191,

p Art 0,001, teste log-rank). (B) as curvas de Kaplan-Meier de pacientes com CCR com baixa contra alta expressão de CCR6 no estágio clínico I (n = 14,

p

= 0,0679, teste log-rank). curvas (C) de Kaplan-Meier de pacientes com CCR com baixa contra alta expressão de CCR6 em estágio clínico II (n = 104,

p

= 0,0738, teste log-rank). (D) as curvas de Kaplan-Meier de pacientes com CCR com baixa contra alta expressão de CCR6 no estádio clínico III (n = 57,

p

= 0,1749, teste log-rank). curvas (E) de Kaplan-Meier de pacientes com CCR com baixa contra alta expressão de CCR6 no estágio IV clínica (n = 16,

p

= 0,0429, teste log-rank).

Knockdown de CCR6 inibe a migração de células CRC

in vitro

a superexpressão CCR6 observado teve uma forte associação com a progressão da CRC, que nos levou a investigar o impacto da CCR6 na capacidade de migração de células CRC . Duas linhas celulares de CRC, SW480 e LoVo, que expressa a mais alta expressão CCR6 de linhas celulares colorrectais analisados, foram usadas para criar sub-linhas com CCR6 batido de forma estável por baixo shRNA (Figura 3A, B). Surpreendentemente, os resultados mostraram que o knockdown de CCR6 causou uma supressão significativa da migração celular em linhas celulares SW480 e LoVo tanto num ensaio de cicatrização de feridas (

P

0,05, Figura 3C). Nós também utilizado outro ensaio transpoço clássica para avaliar a contribuição de CCR6 na migração celular. Foi demonstrado que a ablação das CCR6 marcadamente reduzida a migração de ambas as linhas celulares SW480 e LoVo (

P

0,01, figura 3D). Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que o knockdown específico de CCR6 em linhas celulares de CRC poderia reduzir significativamente a migração de células

in vitro.

(A) Análise de Western blot dos níveis CCR6 em 7 de células cultivadas CRC linhas. Os valores foram expressos como alterações vezes relativamente ao Caco-2, e normalizado para p-actina. (B) Análise de transferência de Western de knockdown de CCR6 em células SW480 e LoVo, β-actina serviu como um controlo de carregamento. Os valores foram expressos como alterações vezes em relação aos controlos (ShCtr) e normalizado para p-actina. (C)-cicatrização de feridas ensaios para a motilidade das células SW480 e LoVo silenciou-CCR6 e células de controlo. representativos de imagens de um campo no inicio (t = 0 h) (painel superior) e no final da gravação (t = 24 h) (painel inferior) em cada condição são mostrados. A migração celular relativa em grupos ShCtr e shCCR6 são apresentados no painel da direita. (D) Imagens representativas de transpo� células migraram em células SW480 e LoVo silenciou-CCR6 (painel inferior) ou células de controlo de células (painel superior). O número de células que migraram em grupos ShCtr e shCCR6 estão apresentados no painel da direita. Os valores representam a média de poços em triplicado, ± S.D. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, teste de Wilcoxon. Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

CCR6 Promove a agressividade de células CRC

in vitro

Para investigar se a sobre-expressão ectópica de CCR6 poderia aumentar a agressividade de células de CRC, HCT116, Caco-2 e de células SW1116 linhas que expressam estavelmente CCR6 ectópica foram estabelecidos (Figura 4A). Surpreendentemente, ambos os ensaios câmara de cura de feridas e de migração revelaram que a sobreexpressão CCR6 pronunciadamente reforçada a migração celular em comparação com grupos de controlo (

P

0,05 ou

P

0,01) (Figura 4B, C) . Além disso, durante o processo de criação de linhas celulares estáveis ​​CCR6, percebemos que havia mais a formação de colónias em células transfectadas-CCR6 do que as células de controlo transfectadas. Nós, portanto, realizados ensaios de formação de colónias usando o HCT116 estavelmente transfectadas

CCR6, HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr e SW1116

células CCR6 . Mais uma vez, observamos que, em comparação com células de controlo (CTR), o tamanho eo número de colônias formadas na CCR6 com superexpressão HCT116, Caco-2 e células SW1116 foram significativamente aumentados (

p Art 0,05) (Figura 4D) . Tomados em conjunto, os nossos dados fornecem evidência de que a expressão elevada de CCR6 desempenha um papel crítico no fenótipo agressivo de células de CRC

in vitro

.

(A) análise de transferência de Western da expressão ectópica de CCR6 em HCT116

Ctr e HCT116

células CCR6 ou Caco-2

Ctr e Caco-2

SW1116

células CCR6 CCR6 ou SW1116

Ctr e. β-actina serviu como um controlo de carregamento. Os valores foram expressos como alterações vezes em relação aos controlos (CTR), e normalizada para p-actina. (B)

Ctr e HCT116

CCR6 ou Caco-2

Ctr e Caco-2

CCR6 ou SW1116

Ctr e SW1116

células CCR6 ensaio para a motilidade dos HCT116-cicatrização de feridas . representativos de imagens de um campo no inicio (t = 0) (painel superior) e no final da gravação (t = 24 h) (painel inferior) em cada condição são mostrados. A migração de células relativo em grupos CCR6 e de controlo estão apresentados no painel da direita. (C) Imagens representativas de transpo� células migraram em HCT116 estavelmente transfectadas

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (painel superior) ou HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 células (painel inferior). Número de células migraram de HCT116

CCR6 ou SW1116

Ctr e SW1116

CCR6 células CCR6 ou Caco-2

Ctr e Caco-2 Ctr e HCT116 são mostrados na painel direito. (D) Imagem representativa da formação de colónias em HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (painel superior) ou HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

células CCR6 (painel inferior). Os valores representam a média de poços em triplicado, ± S.D. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, teste de Wilcoxon. Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

A superexpressão de CCR6 Facilita a metástase de células CRC

in vivo

O fígado é o local mais comum de colorectal metástase do cancro. Para determinar se CCR6 especificamente desempenha um papel importante na metástase do fígado de CRC, estabelecemos um

In vivo

fígado modelo de metástase experimental por injecção de células tumorais humanas em baços de ratinhos nus /c BALB e seguido sua capacidade de invadir através da veia porta para o fígado para formar metástases. Para definir a relação entre CCR6 e CRC metástase hepática

In vivo

, seis do sexo masculino de 7 semanas de idade camundongos BALB /c nu em cada grupo foram injetados com HCT116

Ctr ou HCT116

células CCR6 em o baço antes da esplenectomia. Depois de 5 semanas, os ratinhos foram mortos, e os nódulos tumorais metastáticas que se formaram no fígado foram examinados. Surpreendentemente, nódulos tumorais metastáticas foram mais frequentemente encontrada nos fígados do HCT116

grupo CCR6 que o HCT116

grupo Ctr (Figura 5A, indicado por setas brancas). Estes resultados sugerem que a sobre-expressão CCR6 em células cancerosas pode melhorar a metástases hepáticas de CRC. Além disso, utilizou-se o animal pequeno sistema de imagem de fluorescência de corpo inteiro (IVIS) para monitorar a migração de células tumorais

in vivo

. Em primeiro lugar, construiu-se a linha de células que expressam estavelmente luciferase, luciferase-HCT116 por transfecção de células HCT116 de luciferase com o lentivírus, e estas células seleccionadas com G418.