Humana

Abstract

O objetivo inicial deste estudo foi identificar marcadores de diagnóstico romance de soro para o tumor do ovário humano de células da granulosa (GCT), que representa um tumor até 5% de todos os cancros do ovário. Para contornar a escassez de tecidos humanos disponíveis para análises, foi utilizado o

CTNNB1

tm1Mmt /+;

Pten

tm1Hwu /tmiHwu;

Amhr2

tm3 (CRE) Bhr /+ modelo de rato transgénico, que apresenta a ativação constitutiva da CTNNB1 sinalização combinada com a perda de

Pten

em células da granulosa e desenvolve TCG que imitam formas agressivas da doença humana. profiling proteômica por espectrometria de massa mostrou que vinculin, enolase 1, várias proteínas de choque térmico, e valosin contendo proteína (VCP) foram mais abundante secretado pelas células do rato GCT cultivadas em relação ao GC cultura primária. Entre estas proteínas, apenas a VCP estava presente em níveis significativamente aumentados no soro pré-operatório de pacientes com câncer GCT, em comparação com indivíduos normais. Para determinar a especificidade da VCP, os níveis séricos foram também medidos no carcinoma do ovário, linfoma não-Hodgkin e da mama, do cólon, do pâncreas, do pulmão, e doentes com cancro da próstata. O aumento dos níveis séricos VCP foram observados na maioria dos casos de cancro, com a excepção de pacientes com cancro do pulmão ou da próstata. Além disso, os níveis séricos da VCP foram aumentados em alguns GCT, os pacientes carcinoma de ovário, câncer de mama e câncer de cólon que não de outra forma mostrar aumento dos níveis de marcadores tumorais séricos amplamente utilizados para o seu tipo de câncer (por exemplo inibina A, inibina B, CA125, CEA, ou CA15.3). Estes resultados demonstram o potencial uso de VCP como marcador sérico altamente sensível para GCT, bem como vários outros cancros humanos

Citation:. Laguë MN, Romieu-Mourez R, Bonneil E, Boyer A, Pouletty N, sagem Masson AM, et al. (2012) proteômica Profiling de um modelo de ratinho para ovário granulosa celular Tumor Identifica VCP como um marcador tumoral soro altamente sensível em vários cancros humanos. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10.1371 /journal.pone.0042470

editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Abril, 2012; Aceito: 09 de julho de 2012; Publicação: 01 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Laguë et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pela operação concessão MOP-102508 dos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde e da Canada Research Chair em Biologia Molecular ovário e Genómica funcional. A Universidade de Virginia Centro de Pesquisa em Reprodução Ligand Assay e Análise de Núcleo é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NICHD (SCCPRR) Grant U54-HD28934. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

marcadores de soro são de valor considerável para a clínica de triagem, diagnóstico e acompanhamento de cânceres. Um marcador ideal deve ter alta sensibilidade e /ou especificidade elevada, a fim de discriminar doentes com cancro de indivíduos saudáveis, bem como a partir de pacientes com tumores benignos ou condições não relacionados. Mais correntemente utilizados são os marcadores séricos hormonas, glicoproteínas ou outras proteínas sobre-expressas por células cancerosas. Estes marcadores geralmente não são específicos de um tipo de câncer único e às vezes falta sensibilidade [1]. Várias estratégias têm sido propostos recentemente para identificar novos marcadores tumorais soro [2]. análises proteomic diferencial de amostras de soro de doentes com cancro e indivíduos saudáveis ​​são abordagens de escolha, mas são impedidos pela escassez de material em cancros raros, bem como pela dificuldade na detecção de proteínas que são expressas em níveis baixos em comparação com proteínas de soro normais abundantes. Uma abordagem alternativa de dois passos envolve a identificação inicial de proteínas que são diferencialmente expressos e /ou segregadas entre células normais e tumorais, seguida pela identificação destas proteínas no soro de doentes com cancro. Esta abordagem requer, idealmente o isolamento de células de tumor primário e as células normais correspondentes. Neste contexto, a utilização de modelos animais relevantes de desenvolvimento do tumor podem proporcionar materiais de partida essencial para a análise proteómica ou genómico, e conduzir à identificação de proteínas candidatos específicos de tumores ou genes cuja expressão pode ser, em seguida, ser investigados, em amostras humanas, como demonstrado no cancro do ovário [3], [4], [5].

o tumor de células da granulosa do ovário (GCT) é a mais prevalente do subgrupo cordão sexual /estromal dos tumores de ovário em mulheres, e é pensado para representar até 5% de todos os cancros do ovário. Ao longo dos últimos anos, o nosso grupo tem-se centrado na elucidação da etiologia molecular de GCT humano, bem como para a criação de modelos animais relevantes GCT. Encontramos evidências de que misregulation tanto do WNT /CTNNB1 (ß-catenina) e PI3K /AKT vias de sinalização ocorrem em GCT humana [6], [7]. camundongos transgênicos com ativação constitutiva de CTNNB1 nas células da granulosa (GC,

CTNNB1

tm1Mmt + /;

Amhr2

tm3 (CRE) Bhr /+) desenvolvem lesões pré-cancerosas do ovário que muitas vezes evoluir para GCT mais tarde na vida [6]. A perda do gene antagonista de sinalização PI3K /AKT

Pten

em GC raramente causa GCT, mas a ativação concomitante de CTNNB1 e perda de

Pten

no

CTNNB1

tm1Mmt /+;

Pten

tm1Hwu /tm1Hwu;

Amhr2

tm3 (CRE) Bhr /+ (CPA) modelo resulta no desenvolvimento de agressiva GCT, metastático com 100 penetrância% [7]. Propusemos que o rato CPA é o melhor modelo disponível atualmente para a análise de GCT biologia, bem como para estudos animais pré-clínicos destinado a desenvolver novas intervenções terapêuticas e /ou ferramentas de diagnóstico.

Nossa hipótese é que o rato CPA modelo pode ser utilizado para a identificação de proteínas, GCT-expressos diferencialmente associados, e que estes se traduziria em marcadores de diagnóstico novos soro clinicamente úteis da doença humana. Aqui apresentamos uma análise secretome diferencial comparando GC cultura primária de ratos normais para as células do TCG de ratos CPA. Esta abordagem levou à identificação de proteínas contendo vasolin (VCP) como um marcador do soro potencialmente clinicamente relevante para GCT humano, bem como para outras formas de cancro.

Resultados

A identificação de proteínas secretadas seletivamente em rato GCT

profiling proteômica foi utilizado com o objetivo de identificar as proteínas secretadas que possam representar marcadores de diagnóstico novo séricos específicos para GCT. meios de cultura gastos foram obtidos a partir de células cultivadas GCT de ratos CPA ou de GC normal a partir de ovários eCG estimulados. Proteínas de os meios foram separados por SDS-PAGE e catorze bandas de proteína observadas em GCT mas não em meio de GC foram submetidas a análise de espectrometria de massa (Figura 1). Este processo identificou uma série de proteínas que foram secretados ou mais abundantemente derramadas por células GCT relativos a CG normal (Tabela 1). VCL, ENO1, várias proteínas de choque térmico (HSPA8 /hsc70, os constitutivos e induzíveis isoformas HSP90 alfa HSP90ab1 e ​​HSP90aa1 e HSPA4) e VCP foram as proteínas mais consistentemente identificados a partir do secretome GCT.

As amostras foram separadas por 10% de SDS-PAGE seguido por coloração com prata. As setas indicam exemplos de proteínas expressas selectivamente no meio de cultura de células GCT, juntamente com pesos moleculares aproximados. Um total de 3 géis com diferentes teores de acrilamida foram estudados e 14 bandas (com proteínas de 12 a 116 kDa) foram submetidas a análise por espectrometria de massa. Apenas um dos 3 géis é mostrado na figura.

VCP é um marcador sorológico para GCT e outros tipos de câncer

A seguir, investigou se as proteínas secretadas por GCT As células de ratos CPA poderia servir como marcadores séricos em pacientes GCT humanos. homólogos humanos de nove proteínas identificadas nas análises secretoma (B2M, CTSB, HSPA4 /HSP70, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCP, VCL e WIF-1) foram selecionados para um estudo mais aprofundado com base em funções de genes conhecidos e disponibilidade de anticorpos. As amostras de soro foram obtidas a partir de voluntários saudáveis ​​e de pacientes com GCT antes do tratamento. Não houve diferenças significativas nos níveis de B2M, CTSB, HSP90, SPARC, TIMP-2, ou VCL WIF-1 foram observados por análises de imunotransferência de soro de pacientes GCT comparação com indivíduos saudáveis ​​(dados não apresentados). Marginalmente aumento dos níveis de HSP4A foram observados no soro de alguns pacientes TCG em comparação com indivíduos normais, no entanto, as diferenças não foram estatisticamente significativas, e considerado improvável que seja clinicamente úteis (Figura 2A). VCP níveis foram baixos em análises de imunotransferência de amostras de soro de indivíduos saudáveis, mas foram significativamente aumentados na maioria das amostras de soro de pacientes TCG (

P

0,05). Com um valor de referência para níveis VCP definidos na média dos valores de intensidade da banda de imunotransferência dos controlos saudáveis ​​mais duas vezes o desvio padrão, observou-se que 8 dos 9 mulheres com níveis GCT mostraram aumento da VCP soro (Figura 2B, Quadro 2). Para determinar a especificidade da VCP como um marcador tumoral de GCT, os níveis séricos VCP foram avaliados em doentes com carcinomas do ovário, bem como em pequenos grupos de doentes com cancros principais não-ovarianos de histologia conhecido e grau (Tabela 3). Surpreendentemente, os níveis de VCP séricos elevados foram detectados em proporções clinicamente significativas de pacientes com carcinoma do ovário (8 de 8), o cancro da mama (5 de 12), câncer de cólon (7 de 12), o câncer de pâncreas (8 de 12) ou não-Hodgkin linfoma (5 de 12) (Figura 2B e na Tabela 3). No entanto, os níveis séricos da VCP não foram significativamente aumentados em pacientes com pulmão ou cancro da próstata.

Níveis HSPA4

(A) no soro de mulheres com GCT ou carcinoma de ovário. Quantidades iguais de proteína de soro foram separadas por SDS-PAGE e foram submetidas a análise de immunoblot para níveis HSPA4 (blots representativos são mostrados no painel de topo, cada pista representa um único dador). Densitometria análises dos sinais obtidos com as análises HSPA4 immunoblot são referidos num gráfico, no qual cada ponto representa um único doador (parte inferior, barra horizontal = média). Não houve diferença significativa nos níveis de HSPA4 entre os grupos por ANOVA one-way. níveis (B) VCP estão aumentados no soro de doentes com cancro. Os soros foram analisados ​​como em (A) para a presença de VCP em pacientes com cancro da mama, do cólon, do pulmão, do pâncreas ou o cancro da próstata, carcinoma do ovário, TCG, ou linfoma de não-Hodgkin (NH). Diferenças estatisticamente significativas (

P Art 0,05). Foram detectadas entre os grupos de câncer de cólon controle (normal) e GCT e

A especificidade e sensibilidade da VCP em relação ao amplamente utilizado soro de diagnóstico marcadores

a seguir, comparou a relevância da VCP com a de outros marcadores de diagnóstico soro comumente usado para vários tipos de câncer. Atualmente, os marcadores sorológicos mais úteis para GCT em mulheres pós-menopáusicas são inibina A e inibina B [8]. Em nossa coorte, os níveis séricos de inibina A e inibina B foram aumentados em 5 a 9 e 7 de 9 de pacientes com GCT (Tabela 2), respectivamente. Não houve correlação clara entre os níveis pré-operatórios de inibina A, inibina B e VCP em pacientes GCT, no entanto, um paciente tinha níveis séricos indetectáveis ​​de inibina A e inibina B, mas altamente aumento dos níveis de VCP (Tabela 2). A sensibilidade da VCP, por conseguinte, parece que se comparam favoravelmente com as inibinas, e VCP poderia servir para identificar pacientes GCT inibina-negativo raras. O soro CA125 é aumentada em cerca de 50% de mulheres com carcinoma do ovário precoce e em mais de 80% das mulheres com doença avançada e é útil para a terapia de acompanhamento [9]. No nosso pequeno grupo carcinoma do ovário, 4 de 8 pacientes positivos para o CA125, ao passo que a medição VCP detectado cancro em todos os pacientes, incluindo aqueles negativo para CA125 (Figura 3). CEA é o marcador de tumor no soro mais amplamente utilizado para o cancro do cólon. CEA no soro é elevada em menos de 25% do cancro do cólon fase precoce e 75% do cancro de fase final e é útil para a determinação do prognóstico, a monitorização da terapia e vigilância [10]. Nos pacientes com câncer de cólon 12 que testamos, 5 foram positivos para CEA. medição VCP detectado cancro em todos os pacientes CEA-positivas, para além de dois que foram CEA-negativa (Figura 3). CEA e CA15.3 estão os marcadores séricos mais comumente utilizados para o cancro da mama. Avaliação desses marcadores não é recomendado para o prognóstico, mas sim para o acompanhamento pós-operatório, bem como a monitorização das doenças avançadas [10]. No caso de 12-coorte que examinámos, 3 pacientes positivos para o CEA seja ou CA15.3, com o remanescente negativo para ambos. níveis VCP foram elevados em todos os três pacientes que estavam CEA ou CA15.3-positivos, e também em três pacientes que foram negativas para ambos os marcadores (Figura 3). Assim, os níveis séricos VCP foram significativamente aumentados na maioria dos doentes com cancro testadas, incluindo em alguns outra forma negativa para marcadores tumorais séricos estabelecidos.

Os soros de pacientes foram analisados ​​para níveis VCP por análises de imunotransferência e as mostras de linha pontilhada valores de corte VCP criada em dadores saudáveis. Além disso, os soros foram testados por ELISA para a presença (+) ou ausência (-) de aumento dos níveis de CA 125 no carcinoma do ovário, CEA em cancro do cólon, ou CEA e CA15.3 no cancro da mama. Os intervalos normais de CA125, CEA e CA15.3 estão abaixo de 35 U /ml, 7 g /l, e 29 kU /l, respectivamente.

Discussão

A VCP proteína é um AAA + ATPase associada a diversas atividades celulares. VCP é necessário para a manutenção da homeostase da proteína celular e regula a expressão de proteínas envolvidas em muitas funções tais como a replicação do ADN, mitose, a degradação da proteína, a endocitose, a fusão da membrana, e a biogénese organelo. Especificamente, a VCP atua sobre as moléculas substratos ubiquitinated e regula retorno da proteína, equilibrando a degradação proteossomal de proteínas solúveis ou agregados de proteínas deformadas localizadas no lúmen ER ou o citosol. Dependendo recuperabilidade conformacional de complexos com substratos VCP e proteínas-alvo, a VCP quer promove a sua degradação, segrega-los de grandes complexos de proteínas, ou modula sua ubiquitination por concorrentes de conjugação de ubiquitina e desconjugação máquinas (revisto em [11]). VCP associados com numerosos substratos ubiquinated, e as funções de VCP em diferentes tipos de células refere-se, em parte, à expressão específica de tecido de substratos e co-factores. Em neurônios e células musculares, interação VCP com NF-1, UNC45b e caveolin-3 regula synaptogenesis e myofibrogenesis (revisto em [12]). Alguns autossômicas mutações dominantes na VCP gene causam miopatia corpo de inclusão com a doença de Paget do osso e demência frontotemporal (IBMPFD), que é uma doença rara, tarde idade de início desordem hereditária degenerativa que pode afetar os músculos, ossos e cérebro [13]. Além das funções essenciais na homeostase, VCP foi mostrado para regular a sua meia-vida e os níveis de várias proteínas com funções de modulação de cancro. Por exemplo, a VCP em cooperação com várias ligases de ubiquitina regula o turn-over de IkappaB [14], HIF-1 [15], p53 [16], ou ErbB3 [17]. Mutações e /ou desregulação das funções da VCP em células cancerosas ainda não estão bem caracterizados, como são os seus efeitos causais possíveis na tumorigênese. No entanto, a superexpressão da VCP foi recentemente evidenciado

in situ

em uma ampla gama de tipos de câncer humano, e análises de grandes grupos de pacientes demonstraram níveis significativamente aumentados de expressão de VCP por células tumorais muitas vezes se correlacionam com a progressão da doença [18] , [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. No entanto, o presente relato é a primeira a identificar o aumento dos níveis VCP no soro de doentes com cancro.

Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a VCP representa um marcador de tumor no soro altamente sensível, potencialmente útil clinicamente para uma variedade de humano cancros. Embora a sua falta de especificidade para um único tipo de cancro sugere que é improvável que a medição soro VCP poderia ser utilizado como uma ferramenta de rastreio, a sua sensibilidade equivalente ou superior a muitos marcadores vulgarmente utilizados indica que poderia ser utilizada em aplicações tais como a eficácia do tratamento de monitorização ou monitoramento de recorrência da doença. Além disso, a VCP poderia ser utilizado para o diagnóstico, em conjunto com marcadores específicos do tipo de cancro mais para aumentar a sensibilidade global do ensaio. Rastreio de grupos muito maiores será necessária para determinar a sensibilidade de medição VCP soro para a detecção de diferentes fases da progressão de cancro, e de diferentes subtipos de cancro. Além disso, a especificidade da VCP no que diz respeito à detecção de doenças neoplásicas versus doença não neoplásica terá de ser avaliada antes da sua utilidade como um marcador de tumor podem ser estabelecidas de forma definitiva. Como immunoblotting é limitado tanto em termos de quantitativeness e praticidade técnica, triagem em larga escala exigirá o desenvolvimento de um ensaio ELISA de alto rendimento para a VCP.

Em resumo, os nossos resultados demonstram que a caracterização proteômica de secretomes tumorais de clinicamente relevantes os modelos de ratinho podem conduzir à identificação de proteínas candidatas circulantes associados com tumorigénese em seres humanos. Nós relatamos que a VCP é abundante no soro de pacientes com câncer, e que pode representar um novo marcador clinicamente útil para a detecção do câncer.

Materiais e Methods

Mice

Ctnnb1

tm1Mmt/+;

Pten

tm1Hwu/tm1Hwu;

Amhr2

tm3(cre)Bhr/+ (CPA) ratinhos transgénicos que foram geradas como previamente descrito [7] e mantidos num fundo genético C57BL /6. Nestes ratinhos, a activação constitutiva do sinal CTNNB1 é devida à deleção do terceiro exão de

CTNNB1

, resultando na produção de uma proteína mutante dominante CTNNB1-estável que não possui os locais de fosforilação necessários para a sua degradação proteossomal [ ,,,0],6]. camundongos CPA desenvolver perinatal GCT e morrer antes de 8 semanas de idade [7]. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal e foram em conformidade com a Política de USPHS em Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

cultura celular

normal GC foram isolados utilizando o método descrito por Zeleznik et ai. [26]. Resumidamente, imaturos (23-26 dias de idade) murganhos C57BL /6 foram injectados i.p. com 5 UI de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG, Folligon, Intervet, a Schering-Plough) para induzir o crescimento folicular. Quarenta e oito horas mais tarde, os animais foram sacrificados e os ovários perfuradas com uma agulha de calibre 25 para libertar GCs para o meio (0,9% de NaCl). A suspensão de células foi centrifugada a 1000

g

durante 5 min e ressuspensos GC foram plaqueadas em placas de 24 poços em 70% de confluência em meio DMEM /F12 (Sigma Aldrich), suplementado com 5% de FBS (Invitrogen), e penicilina estreptomicina (P /S). GCT de 21 a ratinhos CPA 25 dias de idade foram excisadas, picada com uma lâmina de bisturi de tamanho 10 e digerida durante 2 h com 0,1% de colagenase de

Clostridium histolyticum

(Sigma) em DMEM isento de soro com o P /S . As células foram então centrifugadas a 1000

g

durante 10 min e ressuspensas em DMEM suplementado com FBS a 10% e P /S antes do plaqueamento em placas de cultura de células de 100 mm (25 × 10

6 células /prato) .

secretoma Diferencial analisa

Vinte e quatro horas após o plaqueamento, e as células cultivadas GC GCT foram lavadas com HBSS (Invitrogen) e incubou-se durante 24 h em DMEM isento de soro. Os sobrenadantes foram recolhidos e concentrados 80 vezes utilizando Amicon Ultra-4 unidades centrífugos de filtro (Millipore) com um 3 kDa de peso molecular de corte. As concentrações de proteína foram quantificadas usando o método de Bradford (ensaio de proteína Bio-Rad) e as amostras 4-6 ug de proteína foram separadas por SDS-PAGE. Após coloração com prata, proteínas bandas encontradas nos TGC mas não em amostras de GC (n = 14) foram excisados ​​do gel. As fatias de gel foram descorados com 50% de metanol, em seguida, reduzida em DTT 10 mM durante 1 hora a 56 ° C e alquilado em cloroacetamida 55 mM durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem em bicarbonato de amónio 50 mM, os pedaços de gel foram encolhidos em 100% de acetonitrilo (ACN). A digestão foi realizada utilizando tripsina em bicarbonato de amónio 50 mM durante 8 horas a 37 ° C. Os péptidos foram, finalmente, extraiu-se em 90% de ACN /ureia 0,5 M e secou-se no vácuo velocidade. As amostras foram ressolubilizado em 5% de ACN com ácido fórmico a 2% (FA) e separadas num caseiro C

18 coluna (150 um x 10 cm) utilizando um sistema de Eksigent nanoLC-2D. Um gradiente de 56 min 5-60% de ACN (0,2% de FA) foi usado para eluir os péptidos a partir de uma coluna de fase inversa caseiro (150 um de d.i. x 100 mm) com uma taxa de fluxo fixado em 600 nanolitros /min. A coluna foi conectado diretamente a um nanoprobe interface com um espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap Velos (Thermo-Fisher). Cada espectro de MS completa foi seguida por doze espectros MS /MS (treze eventos de verificação), onde foram seleccionados doze iões carregados-se multiplicam mais abundantes para o MS /MS sequenciação. Tandem MS experiências foram realizadas usando a dissociação induzida por colisão na armadilha de iões linear. Os dados foram processados ​​usando o motor de busca 2.1 Mascot (Matrix Science) com parâmetros de tolerância definidos para 15 ppm e 0,5 Da para o precursor e os íons fragmento respectivamente. As modificações variáveis ​​selecionadas foram carbamidomethyl (C), desamidação (NQ), oxidação (M) e fosforilação (STY). O banco de dados selecionado foi v.3.54 banco de dados IPI humana com 150858 sequências.

As amostras de soro

As amostras de soro de pacientes com câncer de mama, cólon, pulmão, pâncreas ou câncer de próstata, ou linfoma não-Hodgkin ( n = 12 para cada tipo de cancro) foram obtidos a partir do Ontario tumor Bank. As amostras de soro a partir de voluntários saudáveis ​​(n = 7) e pacientes com TCG (n = 9) ou de carcinoma do ovário (n = 8; 2 de células claras, 2 serosas, 2 mucinoso e 2 endometrióides cancros do ovário) foram obtidos a partir do Réseau de Pesquisa du cancer du Fonds de recherche Québec – Santé. Procedimentos foram aprovados pelo Comitê de FRQS-RRCancer Investigação e do Conselho de Ética de Pesquisa do Câncer de Ontário, bem como o Comité d’éthique de la recherche sur les sujets humains do Centro Hospitalar de l’Université de Montréal. Inibina A e B níveis de inibina foram determinados por ELISA na Universidade de Virginia Centro de Pesquisa em Reprodução Ligand Assay e Análise Core. Os valores de inibina A e B abaixo do limiar de detecção (13 ng /L e 20 ng /L, respectivamente) foram definidos como normais. níveis CA15.3 e CEA foram determinadas por Les Laboratoires du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. Valores abaixo de 7 g /l e 29 KU /L para o CEA e CA 15.3, respectivamente, foram considerados normais. níveis de CA125 foram determinados utilizando um kit de ensaio ELISA disponível comercialmente e os níveis foram considerados normais quando abaixo de 35 U /ml (Abnova).

análises de imunotransferência

amostras de soro (4 ul ou seja, cerca de 200 ug ) foram separadas por SDS-PAGE em géis de acrilamida a 10%. Os géis foram transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (GE Amersham /VWR). Imunodetecção foi realizada com HSPA4- ou anticorpos específicos para a VCP (clones ab75977 ou ab11433 respectivamente, Abcam) e rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase (GE Amersham /VWR) e revelou utilizando reagentes de detecção ECL (GE Amersham /VWR). A quantificação das bandas de proteína foi realizada por análise densitométrica utilizando um Kodak imagem Estação de 440CF e software v.3.6.5 Kodak 1D (Eastman Kodak, Rochester, NY). A fim de normalizar os níveis de proteínas ou VCP HSPA4 entre imunoblots, cada gel continham duas ou três amostras de soro comuns como referências. O valor de referência para a VCP foi definido como a média de intensidades das bandas de controlo saudável no immunoblot analisa + 2 DP.

Análise estatística

One-way ANOVA com pós-teste de Dunnett foi utilizado para comparar os níveis da VCP em mulheres saudáveis ​​e pacientes com câncer.

Reconhecimentos

os autores agradecem Meggie Girard, Kathleen Théroux, Jennifer Kendall-Dupont, e Manon de Ladurantaye por sua ajuda técnica e de Ontário tumor Bank (Jeanette Joanes ) ea Réseau de recherche du cancer du Fonds de la Recherche en Santé du Québec para a prestação de soros de pacientes com câncer e indivíduos normais.