Abstract
Fundo
O câncer colorretal (CRC) multiplicidade tem sido principalmente relacionados a polipose e não-polipose síndromes hereditárias. Em CRC esporádica, aberrantes de metilação promotor do gene foi mostrado para desempenhar um papel fundamental na carcinogênese, embora pouco se sabe sobre o seu envolvimento na multiplicidade. Para avaliar o efeito da metilação na multiplicidade tumoral em CRC esporádica, hipermetilação de genes-chave supressores de tumor foi avaliada em pacientes com ambos os tumores múltiplos e solitários, como uma prova de conceito-de um defeito epigenética subjacente.
Metodologia /As principais conclusões
Foi examinado um total de 47 síncrona /metacrônica CRC primária de 41 pacientes, e 41 sexo, idade (intervalos de 5 anos) e tumorais pacientes emparelhado-localização com tumores solitários. Os critérios de exclusão foram: síndromes polipose, síndrome de Lynch e doença inflamatória do intestino. metilação do DNA na região promotora do
MGMT
,
CDKN2A
, S
FRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A
e
GATA4
genes foi avaliada por PCR específica de metilação quantitativa, tanto do tumor e amostras de mucosa colorretal aparecendo do normal correspondente. Em geral, os doentes com múltiplas lesões exibiram um maior grau de metilação em amostras de tumores do que aqueles com tumores solitários sobre todos os genes avaliados. Após o ajuste para idade e sexo, binomial Análise de Regressão Logística metilação identificados de
MGMT2
(OR, 1,48; IC 95%, 1,10-1,97; p = 0,008) e
RASSF1A
(OR, 2,04 IC 95%, 1,01 a 4,13; p = 0,047) como variáveis associadas de forma independente com a multiplicidade de tumores, sendo o risco relacionado com a metilação de qualquer um desses dois genes 4,57 (IC 95%, 1,53 a 13,61; p = 0,006). Além disso, em seis pacientes em que ambos os tumores estavam disponíveis, encontramos uma correlação nos níveis de metilação de
MGMT2
(r = 0,64, p = 0,17),
SFRP1
(r = 0,83, 0,06),
HPP1
(r = 0,64, p = 0,17),
3OST2
(r = 0,83, p = 0,06) e
GATA4
(r = 0,6, p = 0,24). Metilação na aparência normal mucosa retal de pacientes com múltiplas e solitária CRC não mostraram nenhuma diferença relevante em qualquer gene avaliada.
Conclusões
Estes resultados fornecem uma prova de conceito que a metilação do promotor gene está associado com a multiplicidade de tumores. Este defeito epigenética subjacente pode ter implicações notáveis na prevenção de pacientes com CCR esporádico
Citation:. Gonzalo V, Lozano JJ, Muñoz J, Balaguer F, Pellisé M, de Miguel CR, et al. (2010) aberrante Gene metilação do promotor Associated com câncer colorretal esporádico múltipla. PLoS ONE 5 (1): e8777. doi: 10.1371 /journal.pone.0008777
editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de setembro de 2009; Aceito: 23 de dezembro de 2009; Publicação: 19 de janeiro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Gonzalo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 07-64873), Fondo de Investigación Sanitaria (PI061384 e PI080024), Asociación Española Contra el Câncer (Fundação Científica e Junta de Barcelona), Fundación Investigación Médica Mutua Madrileña (PI040296) , Fundación Olga Torres (PI040212) e Acción Cancer en (Instituto de Salud Carlos III). Victoria Gonzalo foi apoiado por uma bolsa da Clinic Hospital, Cristina Rodriguez por uma bolsa da Olympus Medical Systems-Europe, Mireya Jimeno por uma bolsa do Instituto de Salud Carlos III (PI016017), Francesc Balaguer por uma bolsa da Fundação Alfonso Martín Escudero e Sergi Castellvi-Bel por um contrato do Fondo de Investigación Sanitaria (CP 03-0070). Centro de Investigación Biomédica en Red en el área temática de Enfermedades hepáticas y Digestivas (CIBERehd) é financiado pelo Instituto de Salud Carlos III. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Cristina Rodriguez era uma enfermeira de pesquisa financiado por uma bolsa da Olympus Medical Systems-Europa. O financiador, no entanto, não estava envolvido no desenho do estudo; recolha, análise e interpretação dos dados; escrita do papel; nem decisão de submeter para publicação.
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é um problema de saúde pública, uma vez que representa o segundo tumor maligno mais comum e também a segunda principal causa de morte por câncer em Países ocidentais. Herança constitui a causa subjacente em até um terço de todos os casos de CRC, com distúrbios hereditários altamente penetrantes e bem definidos, isto é, polipose adenomatosa e hamartomatosa e síndrome de Lynch, representando 3-5% da carga total de CRC [1]. Em tais condições, a presença de uma mutação germinativa no gene causador (ou seja,
APC
,
MYH
,
LKB1
,
SMAD4
,
BMPR1A
,
PTEN
,
MLH1
,
MSH2
,
MSH6
e
PMS2
) [1], [ ,,,0],2], predispõe esses indivíduos para o desenvolvimento de várias neoplasias colorretais. De facto, enquanto polipose adenomatosa familiar representa o paradigma da multiplicidade tumoral, presença de síncrono ou metacrônica CRC é também um dos critérios clínicos mais comuns para suspeitar síndrome de Lynch [3].
Além das condições acima mencionadas herdadas , a multiplicidade de tumores é uma observação frequente em pacientes com CCR que não estão, aparentemente, predispostos a estas neoplasias, com base em sua origem genética. Na verdade, os adenomas colorectais síncronos e metacrônicos são relatados em até 30% e 48% dos pacientes com esporádica CRC, respectivamente, enquanto os valores correspondentes para o carcinoma são 4% e 9%, respectivamente, [4], [5]. Neste cenário, evidente agregação de câncer familial ou características pessoais distintas não são abertamente distinto, e apesar de um distúrbio celular ou molecular generalizada em toda a mucosa retal pode ser suspeita, o mecanismo patogénico subjacente permanece indefinida.
Um efeito de campo carcinogénese colorectal subjacente é uma situação bem reconhecido em pacientes com doença inflamatória do intestino, uma condição pré-maligna com um risco cumulativo aumentado para desenvolver CRC associado com a idade precoce do aparecimento, a duração da doença, e a extensão e a gravidade da inflamação [6], [7]. O mecanismo exacto pelo qual a inflamação da mucosa do cólon crónica provoca malignidade, neste contexto, é pouco compreendida, apesar de que é suposto estar relacionada com uma falha em mecanismos de regulação durante a divisão celular. A inflamação crônica leva à liberação de radicais livres a partir de leucócitos e macrófagos, e essas espécies reativas de oxigênio pode dirigir carcinogênese, causando danos ao DNA [8]. Uma vez que na maioria dos casos, o dano de ADN conduz à inactivação de genes supressores de tumores, o conceito de “efeito de campo” pode ser melhor designado como “defeitos de campo”. putativo envolvimento de tal defeito do campo no CRC esporádica, no entanto, não foi satisfatoriamente estabelecida até agora.
esporádica CRC surge como consequência do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que transformam células epiteliais do cólon em células de adenocarcinoma de cólon [9]. A perda de estabilidade e de alterações do gene genómico resultantes são passos chave patogénicos moleculares que ocorrem mais cedo na tumorigénese: eles permitem a aquisição de um número suficiente de alterações em genes supressores de tumor e oncogenes que transformam as células e promover a progressão do tumor. Análogo a instabilidade genómica, epigenética instabilidade resulta na metilação aberrante de genes supressores de tumor [9]. Na verdade, tumor epigenética silenciamento do gene supressor tem sido comumente envolvidos em todos os tipos de tumores humanos, incluindo CRC [10]. Aberrantes de metilação da citosina desempenha um papel preponderante na transformação de células quando afeta genes que protegem a instabilidade do genoma. Esta mudança epigenética também pode ser detectado nas lesões pré-cancerosas e tecidos peritumoral aparentemente normais [11], [12], [13], [14], [15], sugerindo assim o seu possível envolvimento no processo carcinogênese inicial. Este defeito âmbito putativo associado com hipermetilação promotor do gene na mucosa colorretal aparentemente normal foi sugerido em relação ao
MGMT
gene [12], bem como
ERa
,
myod
,
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3
e
DAPK
[13].
Considerando que a hipermetilação do regiões promotoras de genes supressores de tumor pode ser observado na aparência normal mucosa colorretal, a hipótese de que este fenômeno seria especialmente relevante em pacientes que desenvolveram múltiplos CRC. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar padrões de metilação dos genes envolvidos na carcinogênese colorretal através deste mecanismo, tanto tecido tumoral e aparecendo amostras de mucosa colorretal normais de pacientes com múltiplas e solitária CRC, como uma prova de conceito-de um subjacente putativa defeito epigenética associado com a multiplicidade de tumores.
Materiais e Métodos
Os pacientes
Foi examinado um total de 47 síncrona /metacrônica CRC primária de 41 pacientes (36 síncrona, 4 metacrônica e pacientes um tanto) e 41 sexo, idade (intervalos de 5 anos) e tumor location-emparelhado com tumores solitários. pacientes do grupo controle com tumores solitários foram recrutados no projeto EPICOLON, um estudo prospectivo, multicêntrico, coorte de base populacional de âmbito nacional (n = 1.222) [16] e, aleatoriamente selecionados entre aqueles sem CRC anterior e com um mínimo de seguimento de cinco anos após o diagnóstico de câncer em que a vigilância colonoscopia normal não identificou nenhuma lesão adicional. Em relação à pacientes com múltiplos CRC, 31 também foram recrutados no projeto EPICOLON e 10 pacientes adicionais no Serviço de Endoscopia do Hospital Clínic de Barcelona, entre Junho de 2007 e Maio de 2008. Não houve diferenças no que diz respeito às características clínico-patológicas de ambos os conjuntos de pacientes com múltiplas lesões (dados não mostrados). Os critérios de exclusão para o presente estudo foram síndromes de polipose colorretal, síndrome de Lynch e história pessoal de doença inflamatória intestinal. características demográficas, clínicas e relacionadas com tumores de pacientes incluídos no estudo estão resumidos na Tabela 1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de cada hospital participante Ética institucional e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Membros do projeto EPICOLON estão listadas na Nota S1.
tumor Congelados e correspondente de aparência normal, peritumoral tecidos da mucosa colorretal foram obtidos quer a cirurgia ou a endoscopia de todos os pacientes, e imediatamente armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Em doentes com múltiplas lesões, amostra de tecido foi obtida a partir de pelo menos um tumor (a mais avançada ou à maior quando vários tumores tinham a mesma fase do tumor).
Isolamento de ADN e tratamento com bissulfito
as amostras congeladas foram descongeladas e o ADN genómico foi isolado utilizando o QIAamp DNA Mini-Kit® (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. tratamento com bissulfito foi realizada em ADN genómico utilizando o ADN de metilação EZ-ouro Kit® (Zymo Research, laranja, CA) de acordo com o protocolo do fabricante, com modificações menores descritas abaixo [17]. Este procedimento integrado a desnaturação do ADN e bissulfito de conversão em um-passo, utilizando a desnaturação temperatura para substituir a desnaturação química com o hidróxido de sódio, e foi baseado num processo de reacção de três passos entre a citosina e o bissulfito de sódio, que converte as citosinas não metiladas em uracilos. Uma quantidade de 250 ng de DNA genómico isolado a partir de cada amostra de tumor ou tecido normal foi utilizado por reacção, e um volume de 15 ul foi utilizado para cada ADN bisulfited a ser eluído. O ADN resultante foi utilizado para amplificação por PCR ou armazenado a -80 ° C.
A metilação quantitativa de PCR específico
Após a conversão bissulfito, duplicados de 0,5 ul de cada ADN bisulfited foram amplificados pela técnica MethyLight , um anteriormente descrito quantitativo em tempo real baseada em PCR fluorescente, altamente específica, sensível e reprodutível de ensaio [18]. primers locus específico de PCR e sondas para os genes supressores de tumor de sete –
MGMT1
(promotor mínimo),
MGMT2
(potenciador região),
CDKN2A
,
SFRP1
,
TMEFF2
,
HS3ST2 (3OST2)
,
RASSF1A
e
GATA4 viajantes – foram projetados especificamente para sequências de DNA bisulfited-convertidos e localizados em cada região promotora do gene. Estes genes foram escolhidos por seu envolvimento na carcinogênese colorretal através de silenciamento e evidência de algum grau de hipermetilação orientado a metilação em contrapartida mucosa aparentemente normal, peritumoral colorectal (Tabela 2). Nesse sentido, é importante ressaltar que os genes propostos como marcadores do fenótipo ilha methylator CPG que, por definição, são quase exclusivamente metilado em tecido de cancro foram evitadas. Primer e sondas utilizadas para sequências de ADN bisulfited estão listadas na Tabela S1. Totalmente não metilado e totalmente
ADN Sss
l-metilado foram empregues como inicialmente 0 e 100% referências metilados para testar os resultados de amplificação, e o ADN metilado foi ainda utilizado como calibrador para todas as amostras testadas.
ALUC4
gene foi utilizado como referência endógena para normalizar para a quantidade de ADN de entrada [19]. As reacções foram realizadas MethyLight em tempo real do sistema de PCR 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA) com um volume final de 12,5 mL contendo 900 nM de cada iniciador e 250 nM de sonda correspondente. As condições de PCR foram: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 92 ° C durante 15 segundos e 58 ° C durante 1 minuto, tal como foi descrito anteriormente [18]
Cada. medição de uma dada amostra foi realizada em duplicado para ambos os genes testados e endógenas, e o ciclo limiar (C
t) -O número fraccionada em que a quantidade do alvo amplificado atingiu um fixo threshold- foi determinada. O desvio padrão em duplicados das amostras foi sempre inferior a 0,2. quantidades relativas de ambos os genes também foram normalizados para DNA metilado comercial 100% (Zymo Research, Orange, CA) atuando como calibrador para permitir a comparação em todas as amostras testadas. O C
método comparativo t [20], também conhecido como o
-ΔΔCt método 2, foi calculada fromwhere
Sc
t, amostra foi testada a genes C
valor de t para qualquer amostra normalizada para
ALUC4
e
Sc
t, calibrador foi a genes C
valor t testado para o calibrador, também normalizada para
ALUC4
. O resultado obtido a partir do
ΔΔC
t × 100 corresponde à percentagem de referência metilado (PMR), a qual indica a percentagem de moléculas completamente metilados num locus específico [21].
Investigadores realizar o PCR experiências em tempo real específicos de metilação foram cegos para as características clínicas dos pacientes (ou seja, a multiplicidade de tumores).
Avaliação de tumor mismatch Repair deficiência
deficiência reparação tumor incompatibilidade foi avaliada por ambos imunocoloração e microssatélites testes de instabilidade. análise imuno-histoquímica incluiu a avaliação de MSH2 (anti-MSH2, Oncogene Research Products, Boston, MA), MLH1 (anti-MLH1, PharMingen, San Diego, CA) e MSH6 (anti-MSH6, BD Transduction Laboratories, San José, CA), tal como descrito noutro local [16]. As células tumorais foram consideradas negativas para a expressão da proteína somente se eles não tinham coloração de uma amostra na qual colonócitos normais e células do estroma foram coradas. Se não imunocoloração de tecido normal pode ser demonstrado, os resultados foram considerados pouco fiáveis. instabilidade de microssatélites foi avaliada utilizando o painel 5-marcador proposto pelo Instituto Nacional do Câncer e /ou o pentaplex de repetições mononucleotídicos, como descrito em outros lugares [22].
Análise Estatística
Comparação de grau de metilação entre pacientes de CRC múltiplos e solitárias foi realizada qualitativamente onde positividade metilação foi definido como PMR ≥4, como previamente validado [23]. Desde informações sobre metilação na mucosa colorretal aparentemente normal foi limitado, a análise neste cenário foi realizada de acordo com tanto um ≥4 PMR cut-off e um adicional, escolhido arbitrariamente ≥1 cut-off PMR a fim de verificar qualquer efeito menor potencial. A análise foi realizada utilizando o teste exato de Fisher. Correlação entre os níveis de metilação de pares de tumor foi analisado por análise de correlação de Spearman.
A comparação entre pacientes com tumores múltiplos e solitárias quanto ao grau de metilação, tanto tumor e amostras de mucosa normal que aparecem colorretais também foi realizada através de regressão logística binomial, ambos não ajustado e ajustado para idade e sexo. Além disso, testamos o efeito independente de metilação do gene na multiplicidade de tumores, incluindo todos os genes avaliados no modelo de regressão logística binomial, juntamente com a idade e sexo. Essas variáveis foram “podados” utilizando um procedimento gradual automatizado para otimizar o critério de informação de Akaike [24]. interações multiplicativas foram testados para cada par de genes associados de forma independente com a multiplicidade de tumores através da inclusão de ambos os efeitos principais e um termo de interacção (um produto de dois efeitos principais), no modelo de regressão logística. Finalmente, testamos os efeitos cumulativos de genes metilados sobre a multiplicidade de tumores através da contagem do número de genes seleccionados, independentemente associados a este fenómeno em cada disciplina. A razão de probabilidade para a multiplicidade de tumores em doentes que transportam qualquer combinação dos genes metilados seleccionados foi estimada por comparação com os doentes que transportam nenhum destes genes com o uso de análise de regressão logística. As análises estatísticas foram realizadas usando (R Core Team Desenvolvimento, https://www.R-project.org) “R”.
As variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio padrão. Todos os valores de p foram dois lados. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado para indicar uma diferença estatisticamente significativa.
Resultados
Quarenta e um pacientes com síncrono ou metacrônica CRC, e 41 sexo, idade e localização do tumor-pareado pacientes com tumores solitários constitui a base do presente estudo. Como é mostrado na Tabela 1, ambos os grupos de doentes eram semelhantes com respeito a todas as características demográficas, clínicas e relacionadas com tumores, com excepção para a presença de adenomas colorectais síncronos.
metilação do promotor do gene em amostras de tumores de
Comparação de metilação do promotor do gene em amostras de tumor de pacientes com múltiplas e solitário CRC é ilustrado na Tabela 3. em geral, os doentes com múltiplas lesões exibiram um maior grau de metilação em amostras de tumores do que aqueles com tumores solitários sobre todos os genes avaliados. A proporção de tumores que exibem gene promotor hipermetilação foi significativamente maior em pacientes com múltiplas lesões do que naqueles com CRC solitária em relação ao
MGMT2
(40,4%
vs
14,6%, respectivamente;. P = . 0.009) e
RASSF1A
(17,0%
vs
0%, respectivamente; p = 0,006) (Tabela 3)
Estimativa do risco de tumor. multiplicidade associada a metilação do promotor de genes em amostras de tumor é mostrada na Tabela 4. Após o ajuste para idade e sexo, análise de regressão logística binomial indicou que a metilação de regiões promotoras do locus
MGMT1
(odds ratio (OR), 1,57 ; 95% intervalo de confiança (IC), 1,01-2,43; p = 0,04),
MGMT2
lócus (OR, 1,50; IC 95%, 1,14-1,96; p = 0,003), e
RASSF1A
gene (OR, 2,02; IC 95%, 1,03-3,93; p = 0,03) foram associados com um risco aumentado de desenvolver múltiplos CRC (Tabela 4)
p> A análise de regressão
MGMT2
lócus (OR, 1,48; IC 95%, 1,10-1,97; p = 0,008) e
RASSF1A
gene (OR, 2,04; IC 95%, 1,01-4,13; p = 0,047) como variáveis independentemente associadas à multiplicidade de tumores. Além disso, quando o produto destas duas variáveis foi adicionado ao modelo de regressão, este termo não foi seleccionado interacção (OR, 0,88; IC de 95%, 0,67 a 1,16; p = 0,37). Finalmente, quando foi avaliado o efeito cumulativo de genes metilados, o risco de a multiplicidade de tumores associados com a metilação de qualquer destes dois genes seleccionados era de 4,57 (IC de 95%, 1,53-13,61; p = 0,006), com nenhum aumento significativo quando ambos os genes foram simultaneamente metilado (OR, 2,31; IC 95%, 0,00 a indeterminada; p = 0,99).
por fim, analisamos a correlação dos níveis de metilação no subgrupo de seis pacientes com múltiplos tumores nos quais ambos os tumores eram disponível para análise (Figura 1). Esta análise mostrou uma correlação não significativa nos níveis de metilação de
MGMT2
(r = 64, p = 0,17),
SFRP1
(r = 0,83, 0,06),
HPP1
(r = 0,64, p = 0,17),
3OST2
(r = 0,83, p = 0,06), e
GATA4
(r = 0,6, p = 0,24).
MGMT1
e
CDKN2A
não mostraram evidência de concordância entre tumores no mesmo paciente (r = -0,05, p = 0,91; r = -0,09, p = 0,91, respectivamente), e
RASSF1A
raramente foi metilado nestes tumores, o que impediu uma análise de correlação adequada.
Os resultados são expressos como percentagem de metilação com base no PMR.
Gene metilação do promotor normal aparecendo amostras colorectal mucosa
a metilação na mucosa colorretal aparência normal de pacientes com múltiplas e solitária CRC não mostraram nenhuma diferença relevante em qualquer gene avaliadas (Tabela 5). A fim de verificar qualquer efeito secundário potencial, a análise foi repetida utilizando um cut-off ≥1 PMR (Tabela 5). Nesta segunda análise, não foi observado padrão de metilação consistente, com alguns genes que mostram hipermetilação (ou seja,
MGMT1
,
MGMT2
e
RASSF1A
) e outros hipometilação (ou seja,
SFRP1
,
TMEFF2
e
GATA4
) em pacientes com lesões múltiplas. Nenhuma dessas diferenças foram estatisticamente significantes (Tabela 5).
Discussão
Os resultados deste estudo demonstram que os tumores de pacientes com síncrona e metacrônica exposição CRC um maior grau de metilação do que aqueles de pacientes com lesões solitárias. hipermetilação tumor da
MGMT e região potenciador do gene e da
RASSF1A
região promotora do gene foram identificadas como variáveis independentemente associadas com um risco cinco vezes maior de desenvolver lesões múltiplas. Além disso, verificou-se padrões de metilação semelhantes em pares de tumor do mesmo doente. Em geral, estas observações fornecem uma prova de conceito de um defeito epigenética mediada pelo gene promotor hipermetilação que favorecem a multiplicidade de tumores no CRC esporádica.
Pontos fortes deste estudo contam com o fato de que ele foi realizado em um general população através de um estudo multicêntrico de âmbito nacional prospectivo, em que os pacientes não selecionados e consecutivos com CRC foram incluídos independentemente de suas características pessoais e familiares; anterior caracterização genética realizada no contexto do projecto EPICOLON permitiu uma identificação adequada e consequente exclusão de pacientes com distúrbios hereditários (isto é, polipose colorretal, síndrome de Lynch e CRC associado-MYH) [16], [22], [25], [26 ], [27], [28], no qual um mecanismo molecular específico e bem definido justifica a multiplicidade de tumores; que representa a maior série de pacientes com múltiplas lesões avaliadas até agora para a metilação do tumor, bem como o primeiro estudo em que um grupo de pacientes com lesão solitária controle foi incluído com estratificação adequada para sexo, idade e localização do tumor; e, finalmente, a PCR específica de metilação quantitativa foi realizada tanto em amostra de tumor e emparelhado com aparência normal mucosa colorectal, e os dados analisados de forma cega.
Estamos conscientes, no entanto, de algumas limitações do estudo. Primeiro, amostras de ARN não estavam disponíveis para efectuar expressão paralelamente analisa e verificar a importância biológica da metilação do promotor do gene. No entanto, existe um grande conjunto de evidências de que MethyLight ensaios fornecem uma excelente correlação entre a metilação do promotor e o silenciamento de genes em configurações semelhantes tumorais [11], [29]. Mais incerteza existe, no entanto, no que diz respeito ao valor destes resultados em tecidos não-neoplásicas. Embora tenha sido sugerido que o assinatura epigenética de cancros pode ter em fase inicial, contrapartes dos tecidos normais potencialmente envolvido na iniciação de processo carcinogênese [14], ainda não é claro se o mesmo corte de metilação utilizado para as amostras de tumor ( ou seja, PMR ≥4) pode ser empregue em tecidos não-neoplásicas. De modo a ultrapassar esta limitação, os resultados obtidos na mucosa colorrectal aparentemente normal foram analisadas utilizando dois níveis de corte diferentes. Em segundo lugar, este estudo representa um candidato para o gene, a investigação dirigida-hipótese em que um número reduzido de genes foram escolhidos com base na informação anterior demonstrando o seu envolvimento na carcinogénese colorrectal através de silenciamento de genes mediada por metilação, e evidências de um grau decrescente de hipermetilação Entre tumor, peritumoral com aparência normal da mucosa colorrectal, colo-rectal e da mucosa normal a partir de indivíduos não-tumorais. O principal objectivo desta abordagem foi o de fornecer uma prova de conceito do envolvimento potencial do gene promotor hipermetilação na multiplicidade tumoral em vez de identificar a assinatura epigenética subjacente a este processo. Para atingir este último objectivo, técnicas de alto rendimento com capacidade de grande genoma são necessários, uma abordagem em curso no nosso laboratório. Em terceiro lugar, a avaliação da mucosa colorrectal normal-aparecendo foi limitada à zona peritumoral, na grande maioria dos casos, uma vez que a maioria das amostras foram obtidas a partir de espécimes cirúrgicos. Este aspecto impede generalização dos resultados obtidos na mucosa aparentemente normal de todo o cólon. Na verdade, as diferenças específicas do segmento impressionante cólon na prevalência de metilação de alguns genes (isto é,
MLH1
e
MGMT
) foram observados [14]. Como esse padrão de dispersão afetaria o uso potencial da análise de metilação na avaliação de risco CRC e, consequentemente, estratégias de triagem e vigilância orientada por metilação putativos, está actualmente a ser avaliado.
Um defeito no campo mediado pelo
MGMT
promotor do gene de metilação foi sugerido previamente [12]. Nesse estudo seminal, a hipermetilação do
MGMT
gene foi observada em 46% dos tumores, bem como no 50% de aparência normal da mucosa colorrectal amostras de pacientes nos quais
MGMT
metilação do promotor foi encontrado no tumor correspondente. Em outro estudo, a participação de metilação do DNA em cinco promotores de genes específicos do CIMP, incluindo
MGMT
, também foi avaliada em seis pares de carcinoma síncronas [30]. Neste estudo, foi observado que enquanto alguns pares de tumor mostrou padrões de metilação discordantes, outros mostraram semelhante, mas não é exactamente idêntica, perfis de metilação do promotor, sugerindo que as alterações epigenética em CRC síncrono provável ter ambos os componentes aleatórios e não aleatórios [30]. . Recentemente, Konishi
et al, achou diferenças significativas na metilação entre múltiplos tumores em comparação com lesões solitárias para
MGMT
(. 26,5%
vs
17,3%; p 0,05) e
p14
(16,1%
vs
9,3%;. p 0,05) [31]. Curiosamente, estes autores encontraram uma correlação significativa para a metilação de genes diferentes, incluindo
MGMT
, entre os pares de tumor do mesmo site (proximal
vs.
Distal). Infelizmente, esta questão interessante só poderia ser parcialmente abordado em nossa investigação, já que, devido à concepção do projeto EPICOLON, apenas uma amostra de tumor foram coletados a partir maioria dos pacientes com CRC síncrona, limitando assim a esta comparação de pares para 6 pacientes. Embora as correlações positivas para
MGMT2
não alcançou significância estatística (provavelmente devido ao baixo número de tumores emparelhados disponível), nossos resultados são consistentes com os dados obtidos por Konishi
et al.
[31 ], apoiando a hipótese de que pacientes com múltiplos tumores mostram metilação concordantes em seus tecidos tumorais. Muito recentemente, em uma publicação seminal, linha de 1 níveis de metilação foram significativamente correlacionados em 10 pares de CRC síncronos, o que reforça a hipótese de um efeito de campo [32].
associada a metilação inativação de
RASSF1A
tem sido freqüentemente observado em várias malignidades humanas, incluindo esporádica CRC [33], [34], [35], [36], [37]. De fato, o promotor de tumor hipermetilação do
RASSF1A
ocorre em aproximadamente 20% do CRC, e parece haver uma relação mutuamente exclusivos com a presença de
mutações KRAS
[34], [35]. Curiosamente, em tumores com deficiência de reparo incompatível, não foram observadas diferenças significativas na frequência de
RASSF1A
metilação entre instável CRC esporádica e tumores associados à síndrome de Lynch [37]. Os resultados mencionados acima [32], juntamente com a demonstração de
RASSF1A
metilação em amostras de tumores de pacientes com múltiplas lesões, ea falta de diferenças em outros fatores predisponentes para a multiplicidade de tumores (ou seja, a história familiar) favorecem a hipótese de um defeito subjacente epigenética. No entanto, se esse mecanismo de silenciamento de genes conduzidos-metilação representa um efeito de campo potencial devido a uma alteração molecular não identificado na mucosa normal ou a expressão de múltiplos pólipos hiperplásicos do qual CRC surge através da via serrilhada [38] pré-existente, como tem sido sugeriu recentemente [32], permanece desconhecida.
Como foi mencionado, a metilação aberrante de algumas ilhas CpG tem sido visto em mucosa colorretal aparecendo normal. Em um estudo [13], este fenômeno foi demonstrado para o
ERa
e
myod
genes, bem como para o
P16 (INK4A)
,
MLH1
,
TIMP3
e
DAPK
genes em um nível inferior. Curiosamente, alguns polimorfismos foram associados a uma metilação inferior das ilhas CpG examinados, sugerindo que fatores genéticos podem influenciar essa alteração epigenética na mucosa colorretal normal, [13]. As condições fisiológicas associadas a metilação do promotor aberrantes em mucosa colorretal aparentemente normais também têm sido recentemente avaliada com relação a dois genes de reparação do ADN,
MLH1
e
MGMT
[14]. Nesse estudo, amostras de machos não apresentaram padrões consistentes para qualquer um promotor, mas a prevalência de
MLH1
e
MGMT
metilação aumentou significativamente com a idade, especialmente no cólon direito, e foram consistentes com perfis epigenéticos atuais de subconjuntos CRC.