Abstract

O câncer de ovário é a principal causa de morte por todos os cânceres ginecológicos e terapias convencionais, tais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia geralmente não conseguem controlar estágios avançados da doença. Assim, existe uma necessidade urgente de opções terapêuticas alternativas e inovadoras. Nós argumentar que a terapia genética do cancro utilizando um vector capaz de entregar especificamente um gene que codifica a enzima de células de cancro do ovário permitirá que a célula cancerosa de metabolizar uma pró-droga inócua num citotoxina potente, o que irá conduzir a efeitos terapêuticos. No presente estudo, exploramos a utilização de uma pseudo-virião do papilomavírus humano (HPV) para proporcionar um vírus herpes simplex timidina cinase (HSV-tk) de genes para as células do tumor dos ovários. Verificou-se que o pseudo-virião de HPV-16 foi capaz de infectar preferencialmente células de tumor de ovário murino e humanos quando administrado por via intraperitoneal. Além disso, a injecção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões que transportam o gene HSV-TK, seguida por tratamento com ganciclovir levou a efeitos anti-tumorais terapêuticos significativos em ratinhos com cancro do ovário murino. Os nossos dados sugerem que a pseudo-virião de HPV pode servir como um potencial veículo de entrega de terapia génica do cancro do ovário

citação:. Hung C-F, Chiang AJ, Tsai H-H, Pomper MG, Kang TH, Roden RR, et ai. (2012) Gene Therapy cancro do ovário Usando HPV-16 no pseudo-virião portador do gene HSV-tk. PLoS ONE 7 (7): e40983. doi: 10.1371 /journal.pone.0040983

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Março, 2012; Aceito: 15 de junho de 2012; Publicação: 17 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Cancer Programas Nacionais especializados de Investigação de Excelência (https://trp.cancer.gov/) no colo do útero CA098252 P50 Cancer, CA118790 (Roden) e CA122581 (Roden). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por todos os cânceres ginecológicos e a sexta neoplasia maligna mais comum para as mulheres nos Estados Unidos [1], [2]. Embora avanços significativos ocorreram em ambas as técnicas cirúrgicas e quimioterapêuticos, as taxas de sobrevivência de 5 anos globais para todos os estágios de cancro do ovário permanecem 50% [2], [3]. As terapias atuais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia) geralmente não conseguem controlar estágios avançados da doença. Portanto, abordagens terapêuticas alternativas podem servir como métodos importantes para controlar estes tumores ovarianos fase avançada.

Uma abordagem possível é a utilização de terapia de gene suicida (BET). Com BET, o gene para uma enzima externa (isto é, um a partir de um vírus, bactéria, ou levedura) é especificamente entregues às células cancerosas. de entrega de genes é seguido pela administração sistémica de uma prodroga não tóxica. As células cancerosas infectados são capazes de expressar a enzima estranha para converter a prodroga numa citotoxina activa, que é capaz de matar as células infectadas. Um SGT vantagem tem mais de terapias genéticas convencionais é sua capacidade de matar as células vizinhas através do efeito espectador. A droga ativa pode escapar das células transduzidas e difundir para as células vizinhas não infectadas, em última análise, levando à sua morte também. As células que morrem são também capazes de induzir as células assassinas naturais (NK) e células T para induzir um efeito espectador distante. A esperança para esta abordagem é ter grande especificidade para células tumorais, particularmente células-tronco cancerosas. Esta abordagem deve também reduzir os efeitos secundários tóxicos associados com terapias convencionais do cancro devido ao aumento da especificidade de tanto o fornecimento e a activação da citotoxina [4].

O sistema de genes /pró-fármaco suicida mais estudado é a combinação de vírus herpes simplex timidina cinase (HSV-TK) com ganciclovir (GCV) [5]. HSV-TK, o qual tem alta afinidade para o ganciclovir, catalisa a primeira fosforilação de GCV que pode ser, em seguida, di- e tri-fosforilados por quinases celulares. Trifosforilado GCV pode ser incorporada no ADN replicante, que leva à inibição da polimerase e, eventualmente, a apoptose [4] – [6]. Este sistema tem demonstrado algum sucesso na clínica, mas a sua utilidade é limitada pela sua dependência em relação de contacto e gap junctions célula-a-célula para o efeito espectador [4].

5-8 semanas de idade C57BL /6 murganhos foram inoculados com células tumorais MOSEC (1 × 10

6 células /ratinho). Uma semana mais tarde, os ratinhos portadores de tumor foram injectados por via intraperitoneal com ou sem HPV-16 /pseudoviriões luc (20 ug de L1 de HPV-16 proteína /ratinho, o equivalente a 120 ng de ADN /murganho). ratos não tratados previamente infectados com ou sem o HPV-16 /pseudoviriões luc serviu como um controlo. Os ratinhos foram fotografadas por não-invasivo imagiologia luminescência 1 dia após a infecção. Os dados apresentados são representativos de 2 experiências realizadas.

Para este estudo, nós utilizamos o papilomavírus humano replicação deficiente (HPV) pseudoviriões para entregar o gene HSV-TK para as células do tumor dos ovários. Estudos recentes mostram plasmídeos de ADN pode ser embalado em L1 de papilomavírus e proteínas da cápside L2 para gerar o “pseudo-virião ‘que pode entregar o eficiente de ADN em várias linhas de células [7] – [9]. A encapsulação também protege o ADN contra nucleases e proporciona uma entrega direccionada com grande estabilidade. Muitos dos problemas de segurança associados com a utilização de vectores virais vivos são atenuadas como as pseudoviriões HPV contêm uma construção de ADN diferente do genoma viral do HPV natural. Há também mais de 100 tipos de papilomavírus pseudoviriões, o que permite repetidas impulsionar usando tipos diferentes desde que os anticorpos neutralizantes contra um tipo geralmente não reactivo com outros tipos.

Aqui nós explorar o uso de pseudoviriões HPV para entregar genes marcadores e genes suicidas para ambas as células do tumor dos ovários de murino e humanas. Descobrimos que a injeção intra-peritoneal de HPV-16 pseudoviriões levou à infecção preferencial de cânceres de ovário murino ectópica e que ocorrem espontaneamente em camundongos. infecção preferencial também ocorreu em xenoenxertos de tumor dos ovários humanos de ratinhos portadores de tumor. A injecção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões que transportam o gene HSV-TK seguido por administração de ganciclovir levou a efeitos anti-tumorais terapêuticos significativos em ratinhos com cancro do ovário murino-. Os nossos dados mostram prova de princípio de que pseudoviriões HPV podem ser vectores úteis para a entrega de genes terapêuticos para cancro do ovário.

5-8 semanas de idade ratinhos nus foram injectados intraperitonealmente com células de tumor dos ovários humanos ES2 (1 × 10

6 células /ratinho). Uma semana mais tarde, os ratinhos portadores de tumor foram injectados intraperitonealmente com o tipo selvagem (wt) de HPV-16 /Luc VgV ou L2 mutante pseudoviriões (mtL2) de HPV-16L1mtL2-Luc (20 ug de HPV-16 L1 proteína /ratinho, equivalente a 120 ng de ADN /murganho). ratos não tratados previamente infectadas com HPV-16 pseudoviriões /luc ou MT wt serviu como controlos. Os ratinhos foram fotografadas por não-invasivo imagiologia luminescência 1 dia após a infecção. Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. Todos os procedimentos foram realizados com a aprovação prévia do Comitê Animal Care e Use o Johns Hopkins (protocolo MO08M446).

Ratos

O C57BL /6 e nude (BALB /c nu /nu) ratos foram adquiridos a partir da National Cancer Institute.

MISIIR-TAG

camundongos transgênicos [10] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Denise Connolly no Fox Chase Cancer Center. Todos os animais foram mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados e de acordo com as recomendações para o uso adequado e cuidados de animais de laboratório.

camundongos C57BL /6 e

MISIIR -tag

ratinhos transgénicos que foram injectados com 20 ug de HPV-16 /luc VgV por injecção intraperitoneal de 10 semanas após o nascimento. imagens de luminescência foram tomadas um dia após a injeção de HPV-16 /luv VGV.

Top,

imagens de luminescência representativos do VGV infectados camundongos C57BL /6 ou

MISIIR-TAG

ratinhos transgénicos (esquerda) e seus órgãos colhidos (direita). Nota: A seta branca indica apenas o câncer de ovário de ratinhos transgénicos MISRII podem ser infectadas pelo HPV-16 /luc VGV.

Bottom,

gráficos de barras representativos de imagem de luminescência em ratinhos transgénicos MISIIR-tag ou camundongos C57BL /6. dados representativos de 2 experimentos realizados.

Linhas Celulares

células 293TT foram gentilmente cedidas por J Schiller (National Cancer Institute (NCI), os Institutos Nacionais de Saúde (NIH)) [11 ]. A linha celular MOSEC (uma linha celular de cancro do ovário do rato) foi preparado como descrito anteriormente [12]. A linha celular de ES2 (uma linha celular de cancro do ovário humano) foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. células (MOSEC-Luc) MOSEC /luciferase foram gerados como descrito anteriormente [13].

células MOSEC-Luc foram infectadas HPV16-GFP ou VgV VgV HPV16 /HSV-tk, a uma concentração de 1 ug de proteína L1 /ml durante 48 horas. As células infectadas foram semeadas em placas de 96 poços e em seguida tratou-se com 0 ug /mL, 0,1 ug /mL, 1 ug /ml ou 10 ug /ml de ganciclovir durante 72 horas. expressão de luciferase foi analisada pelo sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados.

Os plasmídeos

Os plasmídeos que codificam HPV16 L1 L2 (pShell16) foram gentilmente cedidas pelo Dr. J Schiller (NCI). O ponto de mutação HPV16L1 mtL2 construção é descrito em nosso estudo anterior [14]. A geração do plasmídeo que expressa luciferase (pcDNA3-luciferase) e o plasmídeo que expressa GFP (pcDNA3-GFP) tem sido descrito anteriormente [15], [16]. O plasmídeo pORF-tk do HSV foi comprado de Invivogen.

HPV pseudo-virião Produção

HPV16-GFP, HPV16-Luc (luciferase), HPV16-tk (HSVtk Herpes Simplex Virus-Timidina quinase) pseudoviriões foram feita utilizando os métodos como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, as células foram co-transfectadas com 293TT plasmídeos de expressão de HPV pShell16 e os plasmídeos de escolha (por exemplo, GFP, luciferase ou HSVtk) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 48 h, as células foram colhidas e lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS) (Invitrogen) suplementado com MgCl 9,5 mM

2 e mistura de antibiótico-antimicótico (DPBS-Mg) (Invitrogen). As células foram suspensas em DPBS-Mg suplementado com 0,5% Brij58, 0,2% de Benzonase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EUA), e 0,2% plasmídeo Seguro (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, EUA) na 100 × 10

6 células /ml e incubadas a 37 C durante 24 h para a maturação da cápside. Após a maturação, o ligado de células foi arrefecida em gelo durante 10 min. A concentração de sal do lisado celular foi ajustada a 850 mM e incubado em gelo durante 10 min. O lisado foi então clarificado por centrifugação, e o sobrenadante foi em camadas sobre um gradiente de Optiprep. O gradiente foi centrifugado durante 4,5 h a 16 C a 40 000 r.p.m. num rotor SW40 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EUA). A pureza de pseudoviriões HPV foi avaliada através da execução das fracções em electroforese de gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de gradiente de 4-15% de sódio. O plasmídeo de ADN encapsulado foi quantificado através da extracção de ADN a partir de encapsidado facções OptiPrep seguido de comparações de PCR quantitativa em tempo real com diluições em série de ADN nu. As concentrações de plasmídeos (GFP, luciferase, ou HSVtk) nos pseudoviriões foram determinadas para ser, aproximadamente, 6,2 ng de DNA por 1 ug de proteína L1.

In vitro

infecção de células tumorais por HPV16 pseudoviriões

MOSEC ou células ES2 foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço e cultivadas durante a noite. As células foram infectadas com HPV-16 /Luc VgV (1 ug de proteína L1 /ml) durante 72 horas. Luciferina (15 ug /ml) e incubou-se durante 10 min. Um tempo de integração de 10 segundos foi usado para a aquisição de imagens por luminescência o sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA).

caracterização da infecção por HPV16 pseudoviriões Tumor em Ratinhos

6 ratinhos C57BL /(5 por grupo) foram injectados por via intraperitoneal com 1 x 10

6 MOSEC células /ratinho. Uma semana mais tarde, os ratinhos portadores de tumor foram injectados por via intraperitoneal com o HPV-16 /Luc VgV a uma dose de 20 ug de L1 de HPV-16 proteína /ratinho (equivalente a 120 ng de ADN /murganho). imagens de luminescência foram registrados no dia após o HPV-16 injeção /Luc VGV. Um tempo de integração de 2 min foi usado para a aquisição de imagens de luminescência.

Para a caracterização da infecção de células de cancro do ovário humano por HPV-16 /Luc VgV, ratinhos nus foram inoculados com células do tumor dos ovários humanos ES2 numa dose de 1 × 10

6 células /mouse. Uma semana mais tarde, os ratinhos portadores de tumor foram injectados intraperitonealmente com o tipo selvagem (wt) de HPV-16 /Luc VgV ou mutante (mt) HPV-16L1mtL2-Luc VgV a uma dose de 20 ug de HPV-16 L1 proteína /ratinho (equivalente de 120 ng de ADN /murganho). camundongos normais sem tumores infectadas com wt ou MT de HPV-16 /Luc VgV serviram como controlos. imagens de luminescência foram tiradas no dia após a injecção de HPV-16 /Luc VGV. Os ratinhos foram injectados com 0,2 ml de luciferina ml 15 mg /besouro (sal de potássio; Promega). Após 10 min, os ratinhos foram visualizados utilizando o sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). Um tempo de integração de 30 segundos foi usado para a aquisição de imagens de luminescência.

HPV16-

In vitro

citotoxicidade mediada pelo HPV16-TK pseudoviriões e

células MOSEC-Luc ganciclovir

foram infectados GFP VgV ou HPV16-TK VgV (1 ug L1 proteína /ml) durante 48 horas. As células infectadas foram semeadas em placas de 96 poços. As células infectadas foram tratadas com 0 ug /mL, 0,1 ug /mL, 1 ug /ml ou 10 ug /ml de ganciclovir durante 72 horas e a expressão de luciferase foi analisada pelo sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA ).

In vivo

citotoxicidade mediada pelo HPV16-TK pseudoviriões e ganciclovir

Os ratos foram injectados por via intraperitoneal com 1 × 10

6 MOSEC-Luc células /rato no dia 1. a actividade de luciferase foi analisada no dia 2, como uma indicação do número de tumores no ratinho. Os ratinhos foram injectados com 0,2 ml de luciferina ml 15 mg /besouro (sal de potássio; Promega). Depois de dez minutos, os ratos foram visualizados utilizando o sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). Um tempo de integração de 2 min foi usado para a aquisição de imagens de luminescência. Os ratinhos foram injectados com HPV16-GFP VgV (20 ug de proteína L1) ou de HPV16-TK VgV (20 ug de proteína L1) no dia 3. Os ratinhos foram tratados diariamente com o ganciclovir (50 mg /kg) ou PBS desde o dia 5 ao dia 18. Os ratos foram fotografadas novamente por imagem luminescência não-invasivo no dia 20.

resultados

injeção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões leva à infecção preferencial de células murino do cancro do ovário em ratos portadores de tumores

inicialmente analisou se o HPV-16 no pseudo-virião portador do gene luciferase (HPV-16 /Luc PSV) foi capaz de infectar a linha de células de cancro do ovário murino, MOSEC,

in vitro

. Como mostrado na Figura S1, o HPV-16 /Luc PVS foi capaz de infectar células tumorais MOSEC

in vitro

. Para demonstrar se o HPV-16 /Luc VgV também pode infectar a linha celular de cancro do ovário murino em ratinhos portadores de tumor, primeiro intraperitonealmente ratinhos injectados com células tumorais MOSEC. Os ratinhos portadores de tumor foram injectados por via intraperitoneal com o HPV-16 /Luc VgV uma semana mais tarde. Como mostrado na Figura 1, enquanto que os ratinhos sem tumores não mostraram qualquer actividade de luciferase, os ratinhos portadores de tumor intraperitonealmente injectados com o HPV-16 /Luc VgV demonstrada actividade luciferase significativa. Estes dados sugerem que o pseudo-virião de HPV infecta preferencialmente células de tumor em ratinhos portadores de tumor.

A injecção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões leva à infecção preferencial de células do cancro do ovário humano em ratinhos nus portadores de tumor

Nós ainda determinar se o HPV-16 /Luc PVS foi capaz de infectar a linha de células de cancro do ovário humano ES2. Como mostrado na Figura S2, ES2 células infectadas com o HPV-16 /Luc VgV demonstrada actividade luciferase, o que sugere que o HPV-16 /Luc PVS foi capaz de infectar células humanas de cancro do ovário in

in vitro

. Nós também caracterizou o

In vivo

infecciosidade de HPV-16 /VgV luc em ratinhos nus portadores de tumores de ovário ES2 humanos para determinar se a infectividade de pseudoviriões HPV é essencial para a entrega eficiente de genes às células do tumor dos ovários por pseudoviriões HPV. É agora claro que a menor proteína da cápside L2 de HPV é essencial para a infecção de células por eficiente pseudoviriões HPV [14], [17]. Assim, temos utilizado HPV-16 /Luc VgV com uma mutação de um único aminoácido em L2 de HPV (HPV16L1mtL2-Luc PSV) que elimina a infecciosidade do pseudoviriões [14]. Como mostrado na Figura 2, apenas os ratinhos nus portadores de tumores de ovário humanos demonstraram luminescência significativa em comparação com os pequenos ratos nús não portadores de tumores. Além disso, os ratinhos que ostentem-tumorais infectadas pelo HPV-16 /luc VgV mas não mutante de HPV-16 /L1mtL2- Luc VgV demonstrado luminescência significativa (Fig. 2). Assim, nossos dados mostram que o HPV-16 pseudoviriões pode também preferencialmente infectar as células do tumor dos ovários humanos

in vivo

. Além disso, os nossos dados indicam que o HPV intactos L2 é essencial para a entrega eficiente de genes encapsidadas às células do tumor dos ovários por pseudoviriões HPV.

HPV-16 /luc VgV infecta preferencialmente ovário tumores em

MISIIR-tag

rato transgénico

Foram examinados ainda mais a infecção preferencial de células de tumor de ovário por pseudoviriões HPV no

MISIIR-tag

camundongo transgênico, um modelo de tumor de ovário murino ocorrem espontaneamente. Este ratinho transgénico, que expressa a região de transformação de SV40 sob o controlo do promotor do gene do receptor de Mullerian inibidora substância tipo II, tem sido demonstrado para desenvolver tumores ovarianos bilaterais. Assim, o modelo do cancro do ovário espontânea em

MISIIR-tag

ratinhos transgénicos se assemelha mais estreitamente do cancro do ovário humano que um modelo de transplante tais como modelo de tumor MOSEC. O

MISIIR-tag

camundongo transgênico tem sido relatada a desenvolver espontaneamente carcinoma do ovário dentro de 6-13 semanas de nascimento [10]. Em nosso laboratório, todo o

MISIIR-tag

ratinhos transgénicos (a partir de uma nova linha adquirida da Dr. Connolly) desenvolveram tumores de ovário no prazo de 4 meses após o nascimento. Nós injetamos HPV-16 /luc VgV 10 semanas após o nascimento e descobrimos que o HPV-16 /Luc VgV poderia também infectam preferencialmente o câncer de ovário ocorrem espontaneamente no

MISIIR-tag

ratinhos transgénicos (Fig. 3). Além disso, observou-se que os órgãos vitais, incluindo os pulmões, coração, estômago, baço e rim não foram infectados. Além disso, nenhuma actividade de luciferase foi observado nos ovários normais de ratinhos C57BL /6 injectados com HPV-16 /luc VgV. Assim, os nossos dados indicam que o HPV-16 pseudoviriões pode infectar selectivamente as células de tumor do ovário em um modelo de tumor de ovário murino que ocorre espontaneamente.

A infecção de HPV-16 pseudoviriões portador do gene de HSV-TK, seguida por tratamento com ganciclovir conduz a

in vitro

citotoxicidade de células infectadas

a infecção preferencial de HPV-16 pseudoviriões em células do tumor dos ovários permite a oportunidade de carregar especificamente o DNA terapêutico para as células do tumor dos ovários para o controlo de tumores ovarianos. Uma vez que a administração inicial de pseudoviriões HPV pode não ser capaz de infectar todas as células do tumor dos ovários, é importante considerar uma estratégia que permite que as células do tumor dos ovários não infectadas directamente para também tornam-se susceptíveis. Por isso, nós escolhemos o sistema de HSV-TK /ganciclovir, uma vez que é o sistema de terapia de gene suicida mais estudado e mais de duas décadas de tentativas para utilizar o sistema como uma terapia anti-cancro tem demonstrado sucesso variável. Para demonstrar se de HPV-16 /HSV-tk VgV pode infectar as células do tumor dos ovários e torná-los susceptíveis à morte por tratamento com ganciclovir, que as células infectadas MOSEC-Luc com HPV16-GFP ou VgV VgV HPV16 /HSV-tk, durante 48 horas. As células infectadas foram subsequentemente tratadas com diferentes concentrações de ganciclovir e a expressão de luciferase de células infectadas foi medida utilizando o sistema IVIS 200. Como mostrado na Figura 4, as células tumorais MOSEC-Luc infectadas com HPV-16 VgV /HSV-tk, seguido por tratamento com ganciclovir levou à morte celular das células infectadas

in vitro.

Isto não foi observado nas células infectadas com HPV-16 /GFP. Observou-se também que as concentrações mais elevadas de ganciclovir levou a mais morte celular. Efeitos semelhantes foram observados quando foram realizados ensaios semelhantes com a linha celular de cancro do ovário humano ES2 (ver Figura S3).

A injecção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões portador do gene de HSV-TK, seguida por tratamento com ganciclovir conduz a Significativo efeitos antitumor em Murino cancro do ovário ratos portadores de

além disso, determinado se os ratinhos portadores de tumor MOSEC infectadas com HPV-16 VgV /HSV-tk, seguido por tratamento com ganciclovir, poderia apresentar efeitos antitumorais terapêuticos. Os ratinhos foram injectados com células tumorais MOSEC-Luc e, em seguida, tratada com o HPV-16 /HSV-tk VgV ou HPV-16 /GFP VgV usando regime tal como descrito na Figura 5. Os ratinhos foram tratados subsequentemente com ganciclovir crescimento tumoral e foi monitorizada usando um sistema de imagem de luminescência. Como mostrado na Figura 5, os ratinhos portadores de tumor tratados com o PSV HPV-16 /HSV-tk, seguido por tratamento com ganciclovir exibiram efeitos antitumorais significativamente melhor terapêuticos do que ratinhos tratados com o HPV-16 /GFP VgV seguido por tratamento com ganciclovir. Estes dados indicam pseudo-virião de HPV-16 podem ser usadas para entregar eficazmente o gene HSV-TK para as células do tumor dos ovários para tornar as células do tumor dos ovários mais susceptíveis ao tratamento com ganciclovir.

ratinhos C57BL /6 (5 por grupo) foram intraperitonealmente com 1 × 10

6 células MOSEC-Luc por rato no dia 1. a actividade de luciferase foi examinado no dia 2 como indicação do número de tumores nos ratos. Os ratinhos foram injectados HPV16-GFP VgV (proteína L1 20 ug) ou de HPV16 VgV /HSV-tk, a uma dose de proteína L1 (20 ug /ratinho) no dia 3. Os ratinhos foram tratados diariamente com ganciclovir a uma dose de 50 mg /kg ou PBS a partir do dia 5 ao dia 18. Os ratos foram fotografadas por técnicas de imagem de luminescência não-invasivos no dia 20. Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados.

Discussão

O sucesso emprego do gene HSV-TK para terapia génica do cancro do ovário usando pseudoviriões HPV sugere que outros genes candidatos adequados podem também ser entregues por pseudo-virião de HPV para os tumores do ovário para a terapia génica do cancro do ovário. Vários genes candidatos para as combinações enzima-prodroga para terapia de gene suicida foram relatadas, incluindo citosina-desaminase [18], [19], nitro-redutase [20], carboxilesterase [21], citocromo p450 [22] e nucleósido de purina fosforilase [23]. Como o HSV-TK, as enzimas codificadas por estes genes pode converter os pró-fármacos não-tóxicos em drogas capazes de bloquear a síntese de ADN, resultando em eventual morte celular, bem como efeitos espectador para matar células tumorais vizinhas adicionais.

Para futura clínica tradução, será importante considerar a preocupações de segurança de ambos o sistema de HSV-TK /GCV e o veículo de entrega. No entanto, a terapia genética do cancro utilizando HSV-TK foram utilizados extensivamente. Muitos ensaios clínicos usando esta abordagem têm sido realizados em pacientes com gliomas e sem eventos adversos graves foram relatados (para revisão ver [24], [25]). Por outro lado, a produção do pseudo-virião de HPV como veículos de entrega de ADN irá provavelmente exigir novos desenvolvimentos para melhorar o seu perfil de segurança. A linha celular de corrente usada para gerar os pseudoviriões contém o antigénio T grande de SV40, que é uma oncoproteína e, portanto, levanta algumas possíveis preocupações de segurança. Uma abordagem alternativa utilizando levedura para produzir pseudoviriões foi descrito [26]. A produção em massa de pseudoviriões HPV provavelmente também exigem protocolos padronizados eficientes para gerar grandes títulos de pseudoviriões HPV infecciosas para a tradução clínica.

No presente estudo, demonstramos infecção preferencial de murino e os tumores do ovário humano por HPV-16 pseudo-virião. Nossos resultados são consistentes com estudos anteriores por Roberts et al. usando um modelo nu do rato para a disseminação peritoneal de linha de células de cancro do ovário humano, SHIN3 [27]. Eles também descobriram que pseudo-virião HPV administrada tecidos tumorais de ovário intraperitoneal infectados com alta especificidade enquanto ignorando as superfícies de tecido peritoneal normais. No entanto, diferentes tipos de HPV podem demonstrar pseudo-virião diferentes tropismos tumorais e /ou tecidos. Por exemplo, Cerio et al, mostraram que um HPV-16, mas não HPV-45, pseudovirus pode infectar SWA-G células do tumor dos ovários humanos

in vitro

[28]. Os dados sugerem que a infecção pseudovírus de tumores humanos pode ser de tipo de HPV e específico para o tumor. Assim, é importante identificar ainda mais o direito tipos de pseudo-virião de HPV para a terapia genética do cancro futuro.

Os mecanismos para a infecção preferencial das células do tumor dos ovários por pseudoviriões HPV permanecem obscuros. No nosso estudo, mostraram que uma L2 intacta é essencial para a infectividade do pseudo-virião de HPV-16 em tumores do ovário (ver Figura 2). HPV entrada para as células alvo tem sido mostrado para ser iniciado em primeiro lugar a ligação a factores de ligação à superfície celular de heparina de proteoglicanos sulfonado (HSPG). As partículas virais de HPV, em seguida, submetidos a uma alteração conformacional que expõe o terminal N da proteína menor da cápside L2 de furina clivagem [29], [30]. A proteólise de L2 expõe uma superfície previamente ocluído de L1 que se liga a um receptor da superfície celular correntemente indeterminado em células, que se crê ser responsável pela internalização das partículas (para revisão ver [31]). Também tem sido mostrado que a maioria das linhas celulares de cancro do ovário regular a expressão da furina [32]. Assim, é concebível que a regulação positiva da expressão da furina pode contribuir para a infecção preferencial do tumor do ovário por pseudoviriões HPV. Nós também podemos excluir a possibilidade de que a infecção preferencial é um artefato de passaging o tumor células

in vitro

desde a infecção preferencial foi observada no modelo de tumor de ovário ocorrem espontaneamente (ver Figura 3). Será importante para caracterizar adicionalmente os mecanismos para a infecção preferencial das células do tumor dos ovários por pseudoviriões HPV. Tal informação será útil para melhorar a administração específica de gene de interesse para as células do tumor dos ovários utilizando pseudoviriões HPV.

Em resumo, verificou-se que a injecção intraperitoneal de HPV-16 pseudoviriões leva à infecção preferencial de murino e humano do ovário células de cancro em ratinhos portadores de tumor. Além disso, a terapia de gene do cancro usando pseudoviriões HPV que transportam HSV-tk era capaz de alvejar especificamente os tumores ovarianos, resultando efeitos antitumorais terapêuticos potentes contra tumores do ovário. Será importante para continuar a identificar os candidatos terapia genética mais adequados e regimes terapêuticos para futuros estudos no sentido de tradução clínica.

Informações de Apoio

Figura S1.

Caracterização da infecção de células tumorais MOSEC por HPV-16 pseudoviriões

in vitro

. MOSEC células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço a noite antes da infecção. As células foram então semeadas MOSEC infectadas com HPV-16 /Luc VgV (1 ug de proteína L1 /ml) durante 72 horas e a expressão da luciferase foi analisada pelo sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). imagens de luminescência de linha de células de cancro do ovário MOSEC (superior). gráfico de barras que mostra as contagens totais de fotões para cada poço (parte inferior). Nota: HPV-16 pseudoviriões pode infectar eficientemente câncer de ovário MOSEC rato

in vitro

. Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s001

(TIF)

Figura S2.

Caracterização da infecção de células de cancro do ovário humanos ES2 por HPV-16 pseudoviriões

in vitro

. células do tumor dos ovários humanos ES2 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço a noite antes da infecção. As células foram então semeadas ES2 infectadas com HPV-16 /Luc VgV (1 ug L1 proteína /ml) durante 72 horas e a expressão da luciferase foi analisada por 200 IVIS sistema (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). imagens de luminescência de linha de células de cancro do ovário ES2 (superior). gráfico de barras que mostra as contagens totais de fotões para cada poço (parte inferior). Nota: HPV-16 pseudoviriões podem infectar eficientemente do cancro do ovário humano in vitro ES2. Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s002

(TIF)

Figura S3.

In vitro

citotoxicidade mediada por pseudoviriões HPV16-tk e ganciclovir. células ES2-Luc foram infectadas HPV16-GFP ou VgV VgV HPV16 /HSV-tk, a uma concentração de 1 ug L1 proteína /ml durante 48 horas. As células infectadas foram semeadas em placas de 96 poços e em seguida tratou-se com 0 ug /mL, 0,1 ug /mL, 1 ug /ml ou 10 ug /ml de ganciclovir durante 72 horas. expressão de luciferase foi analisada pelo sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EUA). Os dados apresentados são representativos de 2 experimentos realizados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s003

(TIF)

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer Katherine Liu ( JHMI) para a preparação do manuscrito.