Abstract

montagem de adesão focal e desmontagem são essenciais para a migração celular e invasão de câncer, mas os mecanismos moleculares detalhadas que regulam estes processos continuam a ser elucidado. Fosfatidilinositol quinase tipo fosfato Iγ (PIPKIγ) liga-se a talina e é necessário para a formação de adesão focal em células estimulada por EGF, mas o seu papel na regulação dinâmica de adesão focal e invasão do cancro é mal compreendida. Mostramos aqui que a superexpressão de PIPKIγ promoveu a formação de adesão focal, enquanto que as células que expressam tanto PIPKIγ

K188,200R ou PIPKIγ

D316K, dois mutantes quinase-morto, tinha muito menos adesões focais do que aqueles que expressam WT PIPKIγ em CHO-K1 e células de cancro do cólon HCT116. Além disso, a sobre-expressão de PIPKIγ, mas não PIPKIγ

K188,200R, resultou num aumento em ambas as taxas de montagem e desmontagem de adesão focais. Esgotamento de PIPKIγ usando shRNA formação fortemente inibida de adesões focais em células HCT116. Superexpressão de PIPKIγ

K188,200R ou o esgotamento de PIPKIγ reduziu a força de adesão celular HCT116 para fibronection e inibiu as capacidades invasivos de células HCT116. esgotamento PIPKIγ reduzida PIP

2 níveis para ~ 40% do controle e PIP

3 a níveis indetectáveis, e inibido vinculin localizar a focal aderências. Tomados em conjunto, PIPKIγ regula positivamente a dinâmica de adesão focal e invasão de câncer, mais provavelmente através PIP

2 mediada por activação vinculin

Citation:. Wu Z, Li X, Sunkara M, Spearman H, Morris AJ, Huang C (2011) PIPKIγ Regula Adesão focal Dynamics e celular do cancro do cólon Invasion. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10.1371 /journal.pone.0024775

editor: Maddy Parsons, Kings College London, Reino Unido

Recebido: 11 de julho de 2011; Aceito: 17 de agosto de 2011; Publicação: 12 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo Cancer Center Start-up fundo de Markey (University of Kentucky) (para Cai Huang) e parcialmente pelo Migration Consortium concessão (NIH GM64346) (para Ken Jacobson, University of North Carolina-Chapel Hill). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adesões focais (FAS, também chamado de adesões célula-matriz) são tipos específicos de grandes montagens macromoleculares na superfície ventral de células, funcionando como ambas as máquinas mecânicas e centros de sinalização de regulamentação [1], [2]. regulação temporal e espacial da adesão focal de montagem /desmontagem é necessária para a migração de células [3]. Durante a migração de células, adesões focais nascentes (também chamados complexos focal) são formadas para estabilizar lamelip�ios na parte da frente, enquanto as células adesões focais são dissolvidos nos bordos de fuga das células [4], [5].

adesão focal montagem e desmontagem também estão implicados na invasão do cancro, um pré-requisito para a metástase. DRR (regulada no carcinoma de células renais) associados com actina e microtúbulos e estimula a invasão glioma através da promoção de desmontagem de adesão focal [6]. A actina de reticulação proteína filamina A suprime a invasão de células de adesão e desmontagem do cancro da mama focal [7]. sinalização de Rho /Rock promove a migração de células tumorais e invasão de regulação dinâmica de adesão focal através caveolin-1 fosforilação [8]. FAK também promove a desmontagem focal adesão e invasão câncer [9], [10], [11]. dinâmica de adesão focal e vias de sinalização que regulam este processo pode ser, portanto, um alvo atraente para a terapia do cancro.

Muitas moléculas têm sido mostrados para regular a dinâmica de adesão focal. FAK regula a rotação de adesão focal [9], [12], provavelmente através de um percurso dependente de dinamina e microtúbulos [13]. Paxillin, um adaptador de adesão focal, também modula a dinâmica de adesão focal por JNK e fosforilação mediada por PAK [14], [15]. Talin ativa integrinas e inicia a formação de adesão focal [16], [17], [18], ao passo que a clivagem de Talin por calpaína medeia a adesão desmontagem focal [19]. Calpaína também cliva a FAK e paxilina para modular a dinâmica de adesão focal [20], [21]. Mostrámos que a ubiquitinação Smurf1 mediada do domínio cabeça talina, um dos dois produtos de clivagem, desempenha um papel importante na desmontagem de adesão focal e a migração de células [22]. ACF7, um dos microtúbulos e proteína de ligação de actina filamentosa, regula adesão focal montagem /desmontagem através da sua actividade ATPase [23]. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam a adesão focal de montagem /desmontagem não são completamente compreendidos.

Tipo de fosfatidilinositol fosfato cinase I y (PIPKIγ) é uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI (4 ) P) para gerar PI (4,5) P

2, que regula uma variedade de processos biológicos, incluindo a formação de adesão focal [24]. PIPKIγ tem um domínio catalítico cinase bem conservada na região central [25]. Dentro do domínio catalítico, há um subdomínio chamado o circuito de activação, que determina local de fosforilação no anel inositol do substrato. PIPKIγ interage fortemente com talina e concorre para a ligação com a cauda β integrina [26] Talin, [27]. É localizada nas junções aderentes de células epiteliais [28], [29]. Tem sido relatado que PIPKIγ é necessário para a formação de adesão focal em células migratórias [30]. No entanto, as funções precisas das atividades lipídico quinase de PIPKIγ na dinâmica de adesão focal não estão definidos.

No presente estudo, investigamos o requisito para a atividade lipídico quinase de PIPKIγ na dinâmica de adesão focal e invasão do cancro do cólon . Nossos resultados identificam um papel essencial de PIPKIγ em focal montagem adesão /desmontagem e câncer de invasão.

Resultados

PIPKIγ promove a formação de adesão focal

Para examinar um possível papel para PIPKIγ em formação de adesão focal, células CHO-K1 foram transfectadas com EGFP-PIPKIγ ou vector EGFP, respectivamente. As células foram re-plaqueadas em fibronectina, fixadas com paraformaldeído, incubadas com um anticorpo monoclonal anti-paxilina, e depois coradas com DyLight 549 de IgG de cabra anti-ratinho conjugada. adesões focais foram alinhadas nas bordas das células transfectadas com vector EGFP, com poucas adesões focais nos centros das células, enquanto que a expressão estimulada PIPKIγ dramaticamente a formação de adesão focal nos centros das células (Fig. 1a). A sobre-expressão de PIPKIγ estimula um aumento no número de adesão focal (Fig 1B.) E o aumento foi contribuído essencialmente por pequenas adesões focais ( 3? M

2) (Fig. 1C). A estimulação da formação de adesão focal por PIPKIγ baseia-se na sua interacção com a talina, porque PIPKIγ

W647F, um mutante que é deficiente na interacção com a talina, não foi capaz de promover focal formação de aderência (Fig 1A, B, C).

(A) imagens TIRF de células CHO-K1 expressando EGFP, EGFP-PIPKIγ WT ou EGFP-PIPKIγ

W647F. As células foram transfectadas transitoriamente com pEGFP-vector, -PIPKIγ WT ou -PIPKIγ

W647F, e em seguida coradas para paxilina. Barra de escala, 20 mm. (B) A expressão de PIPKIγ mas não PIPKIγ

W647F causou um aumento no número de adesão focal (n = 15, barra de erro = média ± SEM; Vector

vs

WT, P 0,001; WT

vs

W647F, P 0,001; Vector

vs

W647F, P 0,05). (C) distribuição Área de adesões focais em células que expressam EGFP, EGFP-PIPKIγ WT ou EGFP-PIPKIγ

W647F.

atividade PIPKIγ quinase é necessário para a estimulação da formação de adesão focal

PI (4,5) P

2 liga-se a talina e reforça a interacção entre a talina e a cauda β integrina, estimulando agrupamento integrina [31]. PI (4,5) P

2 também se liga vinculina e desmascara os sítios de ligação à actina e talina em vinculina, promovendo a formação de adesão focal [32]. PI Portanto, PIPKIγ estimulada (4,5) P

2 síntese poderia ser essencial para promover a formação de adesão focal. Para testar esta hipótese, foram mutados dois resíduos de lisina, K188 e K200, para arginina resíduos dentro do local de ligação de ATP de PIPKIγ. O mutante PIPKIγ

K188,200R e o WT foram purificados a partir de células CHO-K1 e as actividades de quinase foram examinados

In vitro

usando espectrometria de massa para quantificar a produção de PI (4,5) P

2 a partir de PI (4) P. Como mostrado na Fig. 2A, a mutação no K188 e K200 reduzida actividade de quinase em 95%. EGFP-tagged mutante PIPKIγ

K188,200R e WT PIPKIγ foram expressos de forma estável em células CHO-K1, e os seus efeitos sobre a formação de adesão focal foram examinadas após coloração paxilina. Células que expressam estavelmente WT PIPKIγ formado adesões focais em torno das bordas e nos centros de células, enquanto que as células que expressam PIPKIγ

K188,200R, semelhante às células parentais, possuía pequenas adesões focais, a maioria das quais eram em torno das bordas do células, e tinha um defeito na difusão (Fig. 2B). A análise quantitativa indica que o aumento PIPKIγ adesões focais em mais de 2 vezes, ao passo que PIPKIγ

K188,200R não promoveu significativamente a formação de adesão focal (Fig 2C . D). Estes resultados indicam que a actividade PIPKIγ é essencial para a formação de adesão focal em células CHO-K1.

(a) a análise das actividades de PIPKIγ e PIPKIγ

K188,200R. (B) as imagens TIRF de células CHO-K1 que expressam

K188,200R e as células CHO-K1 ou parentais PIPKIγ PIPKIγ. As células parentais e células que expressam EGFP-PIPKIγ WT ou -PIPKIγ

K188, 200R foram coradas para paxilina. Barra de escala, 20 mm. (C) A análise quantitativa dos números de adesão focal (por célula) nas células progenitoras e células que expressam PIPKIγ ou PIPKIγ

K188,200R (n = 30, barras de erro = média ± SEM; parental vs PIPKIγ, P 0,001; parental vs PIPKIγ

K188,200R, P 0,05). (D) de distribuição Área de adesões focais nas células parentais e células que expressam PIPKIγ e PIPKIγ

K188,200R.

Para verificar ainda mais a exigência de actividade PIPKIγ para a formação de adesão focal, foi testada a capacidade de outro mutante morto quinase, PIPKIγ

D316K [33], para promover a formação de adesão focal tal como descrito acima. Como mostrado na Fig. S1, o número médio de adesão focal (por célula) em células que expressam PIPKIγ

D316K foi de aproximadamente 45, o que é aproximadamente a mesma que em células que expressam EGFP vector (Fig. 1). As adesões focais em células que expressam PIPKIγ

D316K acumula nas bordas das células, com muito poucas adesões focais no centro das células. Este resultado confirma o papel essencial da actividade PIPKIγ na formação de aderências focal.

A atividade de PIPKIγ é essencial para a sua promoção dinâmica de adesão focal

Para examinar se a atividade lipídico quinase PIPKIγ é necessário para adesão focal dinâmica, as células CHO-K1 que expressam de forma estável EGFP-PIPKIγ ou -PIPKIγ

K188,200R foram transfectadas com mDsRed-paxilina e depois plaqueadas em placas de MatTek (com uma lamela de vidro na parte inferior) pré-revestidas com fibronectina (5 ug /ml ) e cultivadas durante 3 h. TIRF imagens de mDsRed-paxilina foram feitas usando um microscópio Nikon TIRF e a temperatura foi mantida a 37 ° C utilizando um sistema de microscópio de incubação inu-TIZ-F1 (Tokai Hit). As imagens foram registadas a intervalos de 1 min para um período de 120 min. As constantes de montagem de adesão focal e de taxa de desmontagem foram calculados como descrito anteriormente [22]. O conjunto de FA e constantes de velocidade de desmontagem em células que expressam PIPKIγ

K188,200R foram 0,083 ± 0,014 e 0,072 ± 0,010 min

-1, respectivamente, os quais são semelhantes às de células normais CHO-K1 que relatados anteriormente [ ,,,0],22], enquanto que a montagem FA e constantes de velocidade de desmontagem foram 0,190 ± 0,019 e 0,136 ± 0,014 min

-1, respectivamente, em células que expressam WT PIPKIγ (Fig. 3). Este resultado indica que é necessária a actividade de quinase de lípidos inositol de PIPKIγ pela sua estimulação da montagem e desmontagem de adesão focal.

(A) células CHO-K1 que expressam de forma estável ou PIPKIγ PIPKIγ

K188,200R foram transitoriamente transfectadas com mDsRed-paxilina. As células foram semeadas em fibronectina e as dinâmicas de paxilina foi analisada através de microscopia TIRF time-lapse. Pontas de seta aponta para dinâmico (painéis superiores) e estáveis ​​(painéis inferiores) adesões focais. (B) A sobreposição de 0 e 24 minutos em “A”. (C) Quantificação das constantes montagem adesão e taxa de desmontagem focais em células que expressam PIPKIγ ou PIPKIγ

K188,200R. Quantificações são expressos como média ± S.E.M. de 50 adesões focais de 10 células. Montagem, WT vs K188,200R, P 0,00005; desmontagem, p . 0.005

Um papel essencial para PIPKIγ na formação de aderências focal em células cancerígenas do cólon

adesões focais têm sido implicados na regulação da invasão de câncer, enquanto o papel de adesões focais em células cancerígenas do cólon não foi bem definida. Para determinar se a actividade de PIPKIγ influencia a formação de adesão focal em células de cancro do cólon, células HCT-116 que expressam estavelmente EGFP-PIPKIγ ou -PIPKIγ

K188,200R foram plaqueadas em fibronectina e coradas para a paxilina. Como mostrado na Fig. 4A, a maioria das adesões focais foram localizados para a região periférica, e células HCT116 que expressam PIPKIγ

K188,200R teve muito menos adesões focais do que aqueles que expressam a enzima WT. O número médio de adesão focal em células que expressam WT PIPKIγ foi de 22,5 /célula, enquanto que em células que expressam PIPKIγ

K188,200R foi de 11,5 /célula, ambos os quais eram menos do que os observados em células CHO-K1 (Fig. 4B) . Além disso, PIPKIγ

K188,200R tinha mais efeito sobre as adesões focais menores do que os maiores (Fig. 4C).

(A) imagens TIRF de células CHO-K1 expressando PIPKIγ ou PIPKIγ

K188,200R. As células que expressam de forma estável EGFP-PIPKIγ WT ou -PIPKIγ

K188, 200R foram coradas para paxilina. Barra de escala, 20 mm. (B) PIPKIγ

K188, 200R não terem conseguido estimular um aumento no número focal adesão (n = 10, barra de erro = média ± S.E.M; teste t pareado, P 0,005). distribuição (C) Área de adesões focais em células que expressam PIPKIγ e PIPKIγ

K188,200R.

Para testar se PIPKIγ é essencial para a formação de adesão focal em células HCT116, as células HCT116 foram infectadas com o recombinante lentivírus que expressam PIPKIγ shRNA ou shRNA controle e foram selecionadas com puromicina. Como mostrado na Fig. 5A, a expressão de PIPKIγ shRNA resultou em redução dramática no nível PIPKIγ endógena de células HCT116. As células foram então plaqueadas em fibronectina e coradas para a paxilina. Surpreendentemente, PIPKIγ knockdown quase aboliu a formação de adesão focal em células HCT116 (Fig. 5B). esgotamento PIPKIγ número reduzido de adesão focal de cerca de 74% (Fig. 5C). Diferente de PIPKIγ

K188,200R, PIPKIγ shRNA tinha mais efeito sobre as adesões focais maiores do que os mais pequenos (Fig. 5D). Estes resultados indicam um papel essencial de PIPKIγ na formação de aderências focal em células cancerígenas do cólon HCT116. Este efeito dramático de PIPKIγ knockdown não ocorrem na MDA MB 231-células humanas de cancro da mama, onde PIPKIγ knockdown apenas parcialmente inibiu a formação de adesão focal (dados não mostrados).

(A) Expressão de PIPKIγ em células estavelmente expressando shRNA controle e PIPKIγ shRNA. imagens (B) TIRF de células HCT116 que expressam de forma estável controle e PIPKIγ shRNA. As células foram infectadas com partículas que transportam lentivirais controlo ou PIPKIγ shRNA, seleccionadas com puromicina, e coradas para a paxilina. Barra de escala, 20 mm. (C) PIPKIγ depleção inibiu a formação de adesão focal em células HCT116. (N = 10, barra de erro = média ± SEM; teste t pareado, P 0,0001). (D) de distribuição Área de adesões focais em células que expressam controle e PIPKIγ shRNA

PIPKIγ modula positivamente a adesão força de células cancerígenas do cólon à fibronectina

para examinar se a atividade de PIPKIγ regula a força de adesão celular em fibronectina, as células HCT116 que expressam de forma estável EGFP-PIPKIγ ou -PIPKIγ

K188,200R foram marcadas com calceína-AM e semeadas numa placa de 96 poços que foi previamente revestida com diferentes concentrações de fibronectina. A fluorescência foi lida calceína, e, em seguida, a placa foi invertida e centrifugada a 150 x g durante 5 min. A fluorescência foi lida novamente calceína. Como mostrado na Fig. 6A, a diferença da força de adesão celular entre as células que expressam PIPKIγ

K188,200R e o WT não foi significativa em concentrações elevadas de fibronection. No entanto, a baixas concentrações de f ibronectina, as células que expressam PIPKIγ

K188,200R teve significativamente menor força de adesão em comparação com aquelas que expressam o WT. PIPKIγ knockdown também causou uma redução significativa na força de adesão celular em células HCT116 (Fig. 6B). Estes resultados indicam que a actividade PIPKIγ regula a força de adesão celular em células do cancro do cólon.

(A) Expressão de PIPKIγ

K188,200R inibida células HCT116 que aderem a baixas concentrações de fibronectina. As células que expressam de forma estável ou PIPKIγ PIPKIγ

K188,200R foram incubadas com calceina AM e plaqueadas numa placa de 96 poços revestidas com fibronectina para ensaios de centrifugação. (B) O esgotamento dos PIPKIγ inibiu células HCT116 aderentes à fibronectina. As células que expressam de forma estável o controlo e PIPKIγ shRNA foram incubadas com calceina AM e plaqueadas numa placa de 96 poços revestidas com fibronectina para ensaios de centrifugação. F

a /F

0 = (fluorescência após a centrifugação) ÷ (fluorescência antes da centrifugação).

PIPKIγ é essencial para a invasão, mas não a migração de células cancerígenas do cólon

foi relatado que PIPKIγ desempenha um papel na migração celular. Para testar se PIPKIγ regula a migração de células de cancro do cólon HCT116, que empregue ensaios para cicatrização de feridas tempo decorrido para examinar a migração de células HCT116 que expressam EGFP-PIPKIγ e -PIPKIγ

K188,200R, respectivamente, na presença de HGF . Como mostrado na Fig. S2 A B, células que expressam PIPKIγ

K188,200R migrou ligeiramente mais rápido do que aqueles que expressam a enzima WT conforme medido por ensaios de cicatrização de lapso de tempo. Além disso, a depleção de PIPKIγ não teve nenhum efeito significativo sobre a migração de células HCT116 na Transwell ensaios (Fig S2 C . D). Estes resultados sugerem que a actividade PIPKIγ não é essencial para a migração de células de cancro do cólon HCT116.

Para testar o papel da PIPKIγ na invasão do cancro, a invasão de células HCT116 que expressam estavelmente PIPKIγ shRNA ou um shRNA controlo no ausência e na presença do HGF foi examinada utilizando ensaios de invasão de Matrigel. Como mostrado na Fig. 7 (A B), PIPKIγ knockdown resultou na redução significativa na invasão de células HCT116, quer na ausência ou na presença do HGF. O basal e capacidades invasivas HGF-estimulados de células HCT116 que expressam estavelmente PIPKIγ

K188,200R também são significativamente mais baixos do que aqueles das células que expressam a enzima WT (Fig 7C . D). Estes resultados indicam que PIPKIγ regula positivamente a invasão de células cancerígenas do cólon HCT116.

(A) Depleção de PIPKIγ usando shRNA inibiu a invasão de células HCT116. As capacidades invasivas das células que expressam de forma estável ou shRNA controlo PIPKIγ shRNA foram examinados na presença e ausência de HGF (50 ng /ml) por ensaios de invasão baseados em Matrigel. (B) Quantificação da invasão de células HCT116 que expressam de forma estável ou shRNA controlo PIPKIγ shRNA. n = 5, barra de erro = média ± S.E.M; Ctrl vs PIPKIγ, p 0,01; Ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, p 0,01. (C) A expressão de PIPKIγ

K188,200R inibiu a invasão de células HCT116. As células que expressam de forma estável EGFP-PIPKIγ ou -PIPKIγ

K188,200R foram testados quanto à capacidade invasivos na ausência e na presença do HGF. (D) Quantificação da invasão de células HCT116 que expressam de forma estável EGFP-PIPKIγ ou -PIPKIγ

K188,200R. n = 3, barra de erro = média ± S.E.M; WT vs K188,200R, P 0,01; WT HGF vs K188,200R HGF, P ​​ . 0.005

PIPKIγ regula a formação de adesão focal através da activação vinculin pelo PI (4,5) P

2

Para dissecar o mecanismo pelo qual PIPKIγ regula a formação de adesão focal, partimos para analisar os níveis de polifosfoinositídeos em células HCT116 que expressam PIPKIγ shRNA ou um controle shRNA usando espectrometria de massa. Esgotamento de PIPKIγ em células HCT116 não teve efeito significativo sobre o nível de PIP, mas causou redução significativa na PIP

2 nível (note que esses métodos não conseguem distinguir enantiômeros posicionais desses lipídios por isso é possível que PI (3,4) P

2 podem contribuir significativamente para os níveis residuais de PIP

2 nestas células). Curiosamente, em apoio a esta ideia knockdown de PIPKIγ reduzida PIP

3 níveis abaixo do limite de detecção do nosso ensaio (Fig. 8). Estes resultados indicam que PIPKIγ é uma enzima chave responsável pela produção de PI (4,5) P

2 e PI (3,4,5) P

3 em células HCT116.

polifosfoinositídeos a partir de células que expressam de forma estável ou shRNA controlo PIPKIγ shRNA foram extraídos e derivatizado utilizando trimetilsilil diazometano, e, em seguida, foram medidos utilizando espectrometria de massa. N = 4, barra de erro = média ± S.E.M; PIP, P 0,05; PIP2, P = 0,0034; PIP3, P = 0,001.

Para ver se PI (3,4,5) P

3 é essencial para a formação de adesão focal em células cancerígenas do cólon, as células HCT116 foram tratados com LY294002, um inibidor específico de fosfatidilinositol 3-quinase, e a formação de adesão focal nestas células foi examinada após coloração paxilina. LY294002 (20 uM) não teve efeito significativo sobre a formação de adesão focal (dados não mostrados). Tomados em conjunto com as observações acima, este resultado indica que PI (4,5) P

2, mas não PI (3,4,5) P

3, é necessário para a formação de adesão focal.

PI (4,5) P

2 liga-se e activa vinculina e está implicado na regulação da formação de adesão focal [32]. Se a produção de PI PIPKIγ mediada (4,5) P

2 é essencial para a formação de adesão focal em células HCT116, esgotamento de PIPKIγ reduziria PI (4,5) P

2 níveis e evitar vinculin de localizar a adesões focais. Para testar esta hipótese, as células empobrecido-PIPKIγ endógenos foram infectadas com retrovírus que expressam uma PIPKIγ modificada-codão (resgate) (Fig. 9A), e as células foram coradas para vinculina. Vinculina raramente foi localizada para adesões focais de células HCT116 PIPKIγ-esgotadas, ao passo que re-expressão em células de PIPKIγ PIPKIγ-empobrecido resultou em um aumento dramático na focal vinculina localizada aderência (Fig. 9B). A análise quantitativa indica que o salvamento PIPKIγ restaurada a formação de adesão focal em células PIPKIγ-empobrecido (Fig 9C . D), em comparação com os dados na Fig. 5. Estes dados sugerem que PIPKIγ pode regular a formação de adesão focal através de PI (4,5) P

2 mediada por activação vinculin.

(A) Re-expressão de PIPKIγ resgate ZZ-marcado em células que PIPKIγ foi derrubado (KD) expressando estavelmente PIPKIγ shRNA. As células PIPKIγ-KD foram infectadas com partículas retrovirais contendo salvamento ZZ-tagged PIPKIγ seleccionado com neomicina. ZZ-PIPKI foi detectada por transferência Western com um anticorpo policlonal anti-PIPKIγ. Imagens (B) TIRF de células PIPKIγ-KD KD e as células que expressam as células de resgate PIPKIγ foram plaqueadas em placas com fundo de vidro pré-revestidas com fibronectina (5 ug /ml), fixadas e coradas para vinculina. Barra de escala, 20 mm. resgate (C) PIPKIγ restaurado formação de adesão focal em células PIPKIγ-KD. (N = 11, barra de erro = média ± SEM; teste t pareado, P 0,0001). (D) de distribuição Área de adesões focais em células PIPKIγ-KD e as células que expressam KD PIPKIγ resgate

Discussão

Além de servir como o precursor de outros segundos mensageiros, PI (4,5) P

2 própria liga muitas proteínas do citoesqueleto e adesão focal e é acreditado para ser um regulador chave da dinâmica de adesão focal [ ,,,0],34]. PI (4,5) P

2 liga-se vinculin para desmascarar os sítios de ligação de Talin sobre vinculin [32]; Também se liga talina estabilizando assim interacções talina-integrina [35]. PIPKIγ se pensa ser a enzima que gera PI (4,5) P

2 espacialmente e temporalmente para a formação de adesão focal durante a migração celular [27], [34]. Por outro lado, PI (4,5) P

2 não foi detectada em adesões focais e o papel de PIPKIγ na regulação dinâmica de adesão focal é controverso [36]. PIPKIγ demonstrou ser necessária para a formação de adesão focal durante a migração celular estimulada por EGF [30], ao passo que também tem sido relatado que a expressão do PIPKIγ causada arredondamento celular e adesão focal desmontagem [26].

Mostramos aqui que a expressão de PIPKIγ em níveis baixos em células CHO-K1 estimulada a formação de adesão focal (Fig. 1), ao passo que os mutantes de cinase morta, PIPKIγ

K188,200R e PIPKIγ

D316K falhou para promover a formação de adesão focal (Fig . 2, Fig. 4 e Fig. S1). Além disso, PIPKIγ abolida knockdown quase completamente a formação de adesão focal em células cancerígenas do cólon HCT116 (Fig. 5). Além disso, a expressão de PIPKIγ promovido montagem de adesão focal e também taxas de desmontagem, enquanto PIPKIγ

K188,200R foi incapaz de fazê-lo (Fig. 3). Estes resultados identificam um papel essencial de PIPKIγ na regulação da dinâmica de adesão focal.

Apesar de evidência direta está faltando, PI (4,5) P

2 foi bem envolvido na regulação da activação de integrina. PI (4,5) P

2 liga-se Talin e bloqueia a sua auto-inibição (interação cabeça-cauda) promovendo, assim, a sua interacção com a cauda β integrina [35]. É também estimula a integrina agrupamento [31]. O aumento tanto na interação e integrina agrupamento talina-integrina deve estimular a activação da integrina. Descobrimos que as células HCT116 que expressam PIPKIγ

K188,200R têm significativamente mais baixa força de adesão em comparação com aquelas que expressam o WT, e depleção de PIPKIγ por shRNA também causou uma redução significativa na força de adesão celular em células HCT116 (Fig. 6), sugerindo que PIPKIγ podem modular a activação de integrina em células cancerígenas do cólon.

tem sido relatado que PIPKIγ é necessária para a migração estimulada por EGF de MDA-MB-231 células de cancro da mama humano e células de cancro do ovário humano HeLa [30] , [37]. No entanto, os nossos resultados mostram aqui que nem expressando PIPKIγ

K188,200R, um mutante de cinase morta, nem depleção de PIPKIγ inibir a migração de células HCT116 (Fig. S2). As células MDA-MB-231 e HeLa migra muito mais rapidamente do que as células HCT-116, sugerindo que PIPKIγ é essencial para as células que se movem rapidamente, mas não para as células, como as células HCT116 lenta migração. Isto é apoiado pelo nosso resultado inédito que PIPKIγ

K188,200R inibe drasticamente a migração de células Clone A, uma linha de células de câncer de cólon em movimento rápido.

Por outro lado, PIPKIγ parece ser necessário para a invasão de ambas as células de cancro em rápido (tais como MDA-MB-231) e lento-invasora (tais como HCT116). Depleção de PIPKIγ foi mostrado para inibir a invasão de EGF-estimulada de células MDA-MB-231 [37], e que expressam, quer PIPKIγ

K188,200R ou o esgotamento de PIPKIγ inibe a invasão de células HCT116 (Fig. 7). Estes resultados indicam um papel essencial no controlo de PIPKIγ invasão do cancro.

Estudos anteriores têm focado o papel de desmontagem de adesão focal na regulação de invasão do cancro. DRR promove invasão glioma através da promoção de adesão focal desmontagem [6]. Filamin A suprime a invasão de células do cancro da mama através da inibição de adesão focal desmontagem [7]. FAK também promove a desmontagem de adesão focal e invasão câncer [9]. No entanto, os nossos resultados mostram que tanto a expressão de PIPKIγ

K188,200R, o mutante de cinase morta, e depleção de PIPKIγ de impedir a formação de adesão focal, que acompanha a inibição da invasão de HCT116 (Fig. 4, 5 e 7). Além disso, PIPKIγ estimula tanto a montagem e desmontagem de adesão focal (Fig. 3), sugerindo que a rotação de adesão focal, o que exige a montagem e desmontagem de adesão focal espacial e temporalmente, regula a invasão das células cancerosas.

é um PIPKIγ importante enzima que controla o metabolismo polyphosphoinositide em células HCT116. PIPKIγ knockdown resulta em redução significativa do nível de PI (4,5) P

2 diminui e PI (3,4,5) P

3 níveis ainda mais substancialmente (Fig. 8). PI (3,4,5) P

3 desempenha um importante papel na tumorigénese e metástase do cancro. No entanto, PIPKIγ knockdown não afecta a activação de Akt, um dos principais alvos da PI (3,4,5) P

3, em células HCT116 (dados não mostrados), provavelmente porque Akt pode ser activada pela PI (3, 4) P

2, que não é directamente afectada pela PIPKIγ.

a inibição de PI 3-quinase LY294002 usando não influencia a formação de adesão focal em células HCT116, sugerindo que a PI (4,5) P

2 em vez de PI (3,4,5) P

3 é responsável pela formação de adesão focal PIPKIγ mediada. PI (4,5) P

2 promove a ligação a actina talina e vinculina e foi demonstrado ser essencial para a formação de adesão focal [32]. Nosso resultado mostra que PIPKIγ regula vinculin de localizações para adesões focais em células HCT116 (Fig. 9). Tomados em conjunto, é mais provável que PIPKIγ regula a formação de adesão focal através de PI (4,5) P

2 mediada por activação vinculin.

invasão cancro é um processo complicado, que requer regulação espacial e temporária de celular -matrix aderências, saliências celulares e de matriz de degradação [38]. PI (4,5) P

2 gerado pelo PIPKIγ regula invasão cancro através da modulação dinâmica de adesão celular. Embora PI (3,4,5) P

3 não é essencial para a formação de adesão focal, ele também pode desempenhar um papel na invasão de outros aspectos do cancro, provavelmente através da activação Ácido [39].

Materiais e Métodos

Reagentes

anticorpo

Anti-paxilina (clone 5H11) foi da Millipore; Anti-PIPKIγ anticorpo policlonal era de Cell Signaling Technology; anticorpo anti-tubulina e pLKO1 lentivírus PIPKIγ shRNA (sequência: CCG GGC AGT CCT ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA CCT GTA GGA CTG CTT TTT G) eram da Sigma; DyLight 549 cabra conjugado anti-IgG de ratinho (H + L) foi de Thermo Scientific; Fibronectina e recombinante HGF foram de Akron Biotech; fator de crescimento reduzida Matrigel foi a partir de BD Bioscience; O plasmídeo pEGFP-PIPKIγ foi um presente do Dr. Mark Ginsberg (University of California-San Diego); Pfu Ultra era da Agilent Technologies; iniciadores de ADN foram sintetizados por Integrated DNA Technologies.

plasmídeo construção

O plasmídeo pEGFP-PIPKIγ

W647F foi gerado por PCR Ultra-base pfu usando pEGFP-PIPKIγ como modelo e 5′- GAT GAG AGG AGC TTT GTG TAC TCC CCG CTC-3 ‘/5′-GAG CGG GGA GTA CAC AAA GCT CCT CTC ATC-3’ como iniciadores. pEGFP-PIPKIγ

K188,200R e Pzz-PIPKIγ

K188,200R foram criadas por PCR usando pEGFP-PIPKIγ e Pzz-PIPKIγ [40] como modelos, respectivamente, e sequencialmente 5′- GAC GAG TTC ATC ATC AGG ACC GTC ATG CAC-3 ‘/5′-GTG CAT GAC GGT CCT GAT GAT GAA CTC GTC-3′ e 5’-GTT CCT GCA GAG GCT GCT CCC TGG CTA C-3 ‘/5’-GTA GCC AGG GAG CAG CTG CAG CCT GAA C-3 ‘como iniciadores.