Abstract

Fangchinoline é um alcalóide bisbenzylisoquinoline isolado do Radix

Stephaniae tetrandrae

S. Moore. Fangchinoline e seu análogo estrutura, tetrandrina, exibiu afinidade de ligação direta com proteassoma humana recombinante β1 subunidade e também inibiu a sua actividade

in vitro

. Em próstata PC-3 em cultura de células e células LNCaP, fangchinoline poderia dependente da dose inibem a proliferação celular e a actividade semelhante à caspase de proteassoma celular que foi mediada por proteassoma β1 subunidade. O efeito inibidor da fangchinoline sobre a atividade da caspase-like do proteassoma também foi observada em purificada eritrócitos humana proteassoma 20S. No PC-3 células, fangchinoline induzida paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 e apoptose. Tratamento de PC-3 ratinhos nus com fangchinoline inibiu o crescimento tumoral, a apoptose induzida e diminuição causada também em actividades de proteassoma em xenoenxertos de tumor portador de tumor. a acumulação dependente da dose e dependente do tempo de proteínas importantes ubiquitinadas e substratos de proteassoma, tais como p27, Bax e IkB-α foram observadas nas células tratadas com fangchinoline. A sobre-expressão de proteassoma β1 subunidade por transfecção do plasmídeo aumento da sensibilidade das células à citotoxicidade de fangchinoline enquanto knockdown de proteassoma β1 subunidade melhorou a citotoxicidade de fangchinoline em células PC-3. Os resultados do presente estudo sugerem que a inibição do proteassoma foi envolvido nos efeitos anti-câncer de fangchinoline. Fangchinoline e seus análogos estrutura pode ser novos inibidores de proteassoma naturais segmentação subunidade β1

citação:. Li D, Lu Y, Sun P, Feng G-X, Liu H, Hu G-H, et al. (2015) Inibição de proteassoma β1 Subunidade poderá contribuir para a Anti-Cancer Efeitos da Fangchinoline em células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10.1371 /journal.pone.0141681

editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, TAIWAN

Recebido: 20 Março, 2015; Aceito: 11 de outubro de 2015; Publicação: 29 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Shanghai Science Programa de Apoio à Tecnologia (13431900401), o National Nature Science Foundation da China (81373964), Shanghai Science Programa de Inovação Tecnológica Acção (15140904800), o Science Projeto de Tecnologia major da China (2014ZX09301-306-03), e da Ciência Nacional Quinquenal de Reis Programa de Apoio à Tecnologia (2012BAI29B06). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nanjing Tianyi Bioscience Co. Ltd, forneceu apoio sob a forma de salários para os autores YL, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Yu Lu é empregado por Nanjing Tianyi Bioscience Co. Ltd. Não há patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

proteassoma tem emergido como uma importante e eficaz alvo para a terapia anti-cancro [1]. No nosso rastreio de inibidores de proteassoma naturais, fangchinoline e tetrandrina, dois alcalóides bisbenzylisoquinoline isolado de raiz seca de

Stephaniae tetrandrina

S. Moore (família, Menispermaceae), conhecido como Fangji na China, foram encontrados para ter afinidade de ligação direta com proteassoma humana recombinante β1 subunidade e também inibiu a sua actividade

in vitro

. Fangji é uma medicina chinesa tradicional (TCM) que tinha sido utilizado na clínica como um analgésico, anti-reumáticos, anti-hipertensores e drogas para um longo período de tempo na China [2, 3]. atividades relatadas de Fangji incluiu os efeitos anti-câncer [2, 4], efeitos anti-inflamatórios [5], efeitos cardiovasculares [6, 7], e etc. Os principais componentes ativos de Fangji tinha sido encontrado para ser fangchinoline e tetrandrina [2 ]. As estruturas químicas dos fangchinoline e tetrandrina foram mostrados na Fig 1A e Fig 1B, respectivamente. tetrandrina purificada tinha sido admitido pela China Food and Drug Administration para ser utilizado na clínica para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como a silicose [8] e também foi utilizada no tratamento de cancro [9]. Tanto quanto sabemos, nem qualquer composto purificado isolado de Fangji nem extrato bruto de Fangji haviam sido notificados antes de ter efeitos inibidores de proteassoma. Proteassoma é conhecido por desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro, doenças inflamatórias e doenças cardiovasculares [10]. Portanto, pode ser interessante estudar se a inibição do proteassoma está envolvido nos efeitos da fangchinoline, tetrandrina, bem como Fangji.

(A) Estrutura química da fangchinoline. (B) Estrutura química da tetrandrina. (C) em tempo real de ligação de medições de afinidade de fangchinoline ao proteassoma recombinante β1 proteína de subunidade. (D) em tempo real de ligação de medições de afinidade de tetrandrina ao proteassoma recombinante β1 proteína de subunidade. actividades de (E) da enzima de proteassoma β1 subunidade recombinante com ou sem a presença de fangchinoline em diferentes concentrações. actividades (F) da enzima de proteassoma β1 subunidade recombinante com ou sem a presença de tetrandrina em diferentes concentrações. Os dados foram resultados estatísticos de três experimentos independentes.

Ambos fangchinoline [2, 11-14] e tetrandrina [4, 15-26] tinha sido relatado para ter efeitos anti-câncer

in vitro Comprar e

in vivo

. No presente estudo, nós nos concentramos em estudar os efeitos anti-câncer de fangchinoline. Relatos anteriores mostraram que, fangchinoline poderia induzir a paragem do ciclo celular [11, 13, 14, 27] e a apoptose [2, 14, 27] em células cancerosas em cultura. Houve também um relatório sobre as actividades anti-câncer de fangchinoline

in vivo

[13]. No presente estudo, foram avaliados os efeitos anti-câncer de fangchinoline em células PC-3 cultivadas, células LNCaP cultivadas e PC-3 ratinhos nus portadores de tumor. Ambos foram verificados os efeitos inibidores de fangchinoline sobre as atividades de proteassoma celular em células cancerosas e sobre as atividades de purificada 20S humanos proteassoma. A eficiência de proteassoma como alvo para a terapia do cancro baseou-se no facto de o sistema de proteassoma ubiquitina foi responsável pela degradação de muitas proteínas intracelulares importantes envolvidas em processos celulares importantes, tais como a progressão do ciclo celular, proliferação e apoptose [28-30]. Portanto, os efeitos do tratamento fangchinoline sobre a degradação de importantes substratos de proteassoma, tais como p27, que desempenhou um papel na progressão do ciclo celular, Bax, que foi envolvido em apoptose, e IkB que relacionado com NF-kB via de [31], foram ainda verificados no presente estude. Além disso, observamos também a influência de sobre-expressão de proteassoma β1 subunidade ou knockdown de proteassoma β1 subunidade na sensibilidade das células à citotoxicidade de fangchinoline.

Em conjunto, nossos resultados sugerem o envolvimento da inibição do proteassoma na anti efeitos -Câncer de fangchinoline

in vitro

e

in vivo

. Os resultados do presente estudo contribuem para a compreensão do mecanismo anti-tumoral de fangchinoline, bem como Fangji.

Materiais e Métodos

Chemicals

Fangchinoline com uma pureza superior a 98% e tetrandrina com uma pureza superior a 98% foram ambos adquiridos a partir de Xangai Fonte Folha Technology Co., Ltd. (Xangai, China). Fangchinoline ou tetrandrina foi dissolvido em DMSO para a concentração de 0,1 M, como solução de reserva e armazenado a -20 ° C. substratos peptídicos fluorogênicos Z-LLE-AMC para verificar a actividade do proteassoma caspase-like (C-L) e Z-ARR-AMC para a verificação (T-L) atividade do proteassoma tripsina foram de Calbiochem, Merck. substrato peptídeo fluorogénico Suc-LLVY-AMC para verificar a actividade do proteassoma quimotripsina-like (CT-L) foi da Sigma-Aldrich. Outros reagentes químicos, excepto quando expressamente observado, foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

cultura celular

PC-3 células cancerosas humanas da próstata e células cancerosas próstata LNCaP humanos foram adquiridos de celular Centro de Recursos de Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia chinesa de Ciências. As células PC-3 e as células LNCaP foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina e mantido a 37 ° C e 5% de CO

2. de soro bovino fetal, meio RPMI 1640, penicilina e estreptomicina foram todos a partir de Hyclone.

ressonância de plasmão de superfície do biossensor análise

O proteassoma humano recombinante β1 subunidade, produto do gene PSMB6, foi expressa como cauda de His proteínas, utilizando Escherichia coli, e, em seguida, purificado por cromatografia de afinidade como descrito no nosso estudo anterior [32]. As afinidades de ligação de fangchinoline ou tetrandrina de proteassoma recombinante subunidade catalítica β1, foram ensaiadas

In vitro

utilizando um instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Suécia) como relatado anteriormente [33] . Resumidamente, proteassoma recombinante β1 proteína de subunidade foi imobilizado num chip sensor CM5 como ligando em 11624,5 RU com N-etil-N ‘- (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida e N-hidroxisuccinimida de acordo com os procedimentos de acoplamento de amina primária convencionais, e HBS- EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (v /v) de tensioactivo P20, pH 7,4) foi utilizado como tampão de corrida. A equilibração da linha de base foi realizada por um fluxo contínuo de HBS-EP através da superfície do chip durante 1 a 2 h. Biacore dados foram recolhidos a 25 ° C com HBS-EP, como o tampão de corrida a um fluxo constante de 20 mL /min. Fangchinoline ou tetradrine foi diluída em série em tampão de corrida de 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 e 20 uM. As amostras foram injectados para dentro dos canais a uma taxa de fluxo de 20 mL /min, seguido de lavagem com o tampão de corrida. As respostas de ligação foram registadas continuamente em unidades de resposta (RU) com uma frequência de 1 Hz de sensorgramas e apresentados como uma função do tempo. A associação (

k

a) e dissociação (

k

d) constantes de velocidade, a constante de equilíbrio de dissociação () foram determinadas por análise dos sensorgrama-curvas obtidas pelo diferentes concentrações do composto através da utilização de software de avaliação BIA versão 3.1 (Biacore) e a 1: 1 de Langmuir. ligação modelo encaixe

ensaio da actividade enzimática de proteassoma recombinante β1 subunidade catalítica

Resumidamente, actividade catalítica do proteassoma humano recombinante β1 subunidade foi ensaiada através da adição de proteína de subunidade β1 recombinante (30 ug) a 100 uL de proteassoma tampão de ensaio de actividade (10 mM de Tris-HCL, pH 7,8, 5 mM trifosfato de adenosina, ditiotreitol 0,5 mM e 5 mM MgCl

2 • 6H

2O) contendo 50 uM de Z-LLE-AMC na presença de fangchinoline ou tetrandrina em diferentes concentrações ou não. A actividade de hidrolase da subunidade proteassoma β1 catalítico poderia libertar o componente de AMC fluorogénico de substrato Z-LLE-AMC e a libertação de AMC foi medida após 2 horas de incubação utilizando um leitor de microplacas Bio-Rad 550 com excitação e emissão de comprimentos de onda de 360 ​​e 465 nm , respectivamente.

MTT de efeitos de fangchinoline sobre a proliferação de PC-3 células e células LNCaP

Os efeitos inibidoras de fangchinoline sobre a proliferação de PC-3 células ou células LNCaP foi observada verificando a viabilidade celular de células utilizando o ensaio de MTT, tal como descrito antes [33]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células /mL para células PC-3 e 4 × 10

4 células /mL para células LNCaP. Após cultura durante a noite, os meios foram mudados para meio fresco contendo várias concentrações de fangchinoline ou 0,1% de DMSO (controlo de solvente) durante 24, 48 h ou 72 h. A viabilidade celular foi avaliada por medição da conversão dependente de mitocondrial do MTT sal de tetrazólio amarelo de cristais púrpura de formazan pelas células activas metabólicas. A densidade óptica (proporcional ao número de células vivas) foi avaliada com um leitor de microplacas Bio-Rad 550 a 570 nm. IC

50 valor (concentração inibitória de metade do máximo) foi calculado pelo método logit.

Ensaio de actividade de proteassoma celulares de PC-3 de células e células LNCaP

As células foram tratadas com ambos controlo de solvente (0,1% DMSO), fangchinoline em diferentes concentrações, ou carfilzomib 1 uM (controlo positivo) durante 24 h a 37˚C. As actividades enzimáticas de proteassoma celular no lisado celular foram medidos como descrito no nosso trabalho anterior [32]. Resumidamente, as células foram colhidas, lavadas com PBS e depois lisadas em tampão de ensaio de actividade de proteassoma durante 30 min a 4 ° C. O homogenato foi então centrifugado a 12000 × g durante 30 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido como extracto de célula total e o teor de proteína no sobrenadante foi medida com o reagente de Bradford. actividades catalíticas de proteassoma celular foram testados por adição de extracto de célula total (contendo 30 ug de proteína) a 100 uL de tampão de ensaio de actividade de proteassoma contendo substratos peptídicos 50 jiM f luorogénicos tais como Z-LLE-AMC para detectar a actividade de CL, Z-ARR-AMC detectar a actividade de LT ou de Suc-LLVY-AMC para detectar a actividade de CT-L, respectivamente. A libertação de AMC fluorogênico dos substratos peptídicos foi então medida como descrito acima.

Ensaio de actividade CL de 20S humano purificado proteassoma

O kit de ensaio proteassoma 20S foi comprado de Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, Nova Iorque 11735, EUA). O K

m, V

max valores do purificada eritrócitos humana proteassoma 20S para substrato de péptido fluorigênico Z-LLE-AMC são medidos de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Inactivação de eritrócitos humana purificada proteassoma 20S por fangchinoline foi determinada pela monitorização da hidrólise do substrato na presença de diferentes concentrações de fangcinoline. Os ensaios foram realizados a 37 ° C num tampão de reacção (50 ul) contendo 50 mM de Tris /HCl, pH 7,5, KCl 25 mM, NaCl 10 mM, MgCl 1 mM de

2, 0,1 ug do proteassoma 20S e Z-LLE- AMC. As reacções foram deixadas prosseguir durante 120 min, e os dados de fluorescência foram recolhidos a cada 1 minuto, e, em seguida, representados graficamente como uma função do tempo. A dissociação constante aparente, K

i

app, foi determinada por não-linear de mínimos-ajuste da velocidade fraccionada, v

I /V

0, em função de [I], onde v

i é a actividade residual estado estacionário da enzima na presença de inibidor (I) e v

0 é a velocidade inicial na ausência de inibidor (). A constante de dissociação, Ki, foi calculada a partir da aparente constante de dissociação, K

i

app, utilizando a expressão seguinte, onde [S] é a concentração de substrato e K

m é a constante de ligação de substrato () .

indução da paragem do ciclo celular e apoptose pelo fangchinoline em células PC-3

A indução de paragem do ciclo celular e apoptose pelo fangchinoline em células PC-3 foi observado por meio de análise de citometria de fluxo quanto descritos em nossos relatórios anteriores [32-34]. Resumidamente, para a citometria de fluxo de análise de ciclo celular, as células foram recolhidas após o tratamento, lavou-se com PBS e em seguida fixadas com etanol a 70% a 4 ° C durante a noite. Após lavagens com PBS, as células foram re-suspensas em tampão de coloração (10 mg /ml de RNase A a 5 mg /mL de iodeto de propidio em PBS frio), durante 30 min no escuro à temperatura ambiente e, em seguida, analisada utilizando citómetro de fluxo FACSCalibur. Para a análise de citometria de fluxo da apoptose, Alexa Fluor 488 Anexina V foi usado /Dead celular PI Kit de Apoptose (Invitrogen). As células foram recolhidas após o tratamento, lavou-se com PBS e em seguida ressuspensas em tampão de ligação e, em seguida, incubadas com iodeto de anexina V-FITC e de propídio durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. Então, análise de fluxo de citometria foi conduzido e análise dos dados foi realizada com o software CellQuest.

tumor PC-3 experimentos xenotransplante de

ratos imunodeficientes Homem nu BALB /c-nu-nu, com idades entre 4 semanas, foram adquiridos a partir de Xangai Experimental animal Center. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Shanghai Institute of Materia Medica, Academia Chinesa de Ciências. No dia 0, as células PC-3 (8 × 10

6) células suspensas em 0,2 ml de RPMI 1640 sem soro foram inoculadas s.c. no flanco direito de cada rato (seis ratos por grupo). 14 dias após a inoculação, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em 3 grupos e começou a injecção, quer com controlo de veículo ou fangchinoline a 25 mg /kg (ip., QD) ou 50 mg /kg (ip., QD). Os tamanhos dos tumores foram medidos a cada 4 dias, utilizando compassos de calibre e os seus volumes foram calculados utilizando a fórmula standard: largura

2 × comprimento /2. O volume relativo do tumor (RTV) foi definida como a razão do volume do tumor em um momento indicado e o volume do tumor no início do tratamento medicamentoso. O peso corporal foi medido diariamente. No dia 30 após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 xenoenxertos tumorais inalação e foram dissecados. Para visualizar a apoptose em xenoenxertos tumorais, rotulagem TUNEL foi conduzido para detectar núcleos apoptóticos usando In Situ Morte Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals). Resumidamente, xenoenxertos de tumores foram fixadas com solução de formalina a 10% à temperatura ambiente durante 24 h e, em seguida, incorporado por parafina. Os espécimes foram aquecidos durante 1 hora por banho de água-corrediça secador (LEICA H1 1220, Alemanha), incubadas com dimetilbenzeno por duas vezes (8 min cada) e depois incubadas com 100%, 95%, 90% e 85% de etanol por duas vezes ( 3 min cada). As amostras foram então incubadas com 0,1 M tampão citrato (pH 6,0) para a irradiação de microondas. Depois de se lavar com PBS durante duas vezes (3 minutos cada), as fatias foram incubadas com tampão de reacção (a partir do In Situ Kit de Detecção de Morte) numa atmosfera húmida a 37 ° C durante 1 h. As fatias foram então lavadas três vezes com PBS (3 min cada) para remover não incorporada trifosfato de f luoresceina-desoxiuridina. Os núcleos foram contra-coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) 1 ug /ml durante 3 minutos e, em seguida, lavadas com PBS por três vezes (3 minutos cada). As imagens foram capturadas usando uma objetiva de 20X (Olympus BX51, Japan) num microscópio de epifluorescência. Além disso, as actividades de proteassoma de xenoenxertos de tumor foram ensaiados. Resumidamente, xenoenxertos de tumor foram homogenerized em tampão de ensaio de actividade de proteassoma utilizando o Sistema FastPrep (MP-24 FastPrep, E.U.A), seguida de centrifugação a 4 ° C durante 30 min. Os sobrenadantes foram então usados ​​para o ensaio de actividade de proteassoma, usando o método como acima descrito para a análise das actividades celulares de proteassoma.

análise de transferência de Western

ensaio de transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [33, 34] . Resumidamente, uma aliquota de proteína (100 ug) a amostra foi carregada num gel de SDS a 12%, separado por electroforese, e transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). Depois a membrana foi incubada com TBS 10 mM com 20% de Tween 20 e 5% de leite desnatado desidratado para bloquear a ligação não específica de proteína, a membrana foi incubada com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários (todos a partir de Cell Signaling Technology) utilizados foram o anticorpo policlonal de coelho contra a IkB-α humano (# 4812, 1: 400), Bax (# 2772, 1: 400), de proteassoma β1 subunidade (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-actina (# 4967, 1: 400) e anticorpo monoclonal de rato contra a p27 humana KIP1 (# 3688, 1: 400) ou ubiquitina (# 3936, 1: 1000). Após lavagens TBS, as manchas foram então incubadas com o anticorpo secundário durante 2 h à temperatura ambiente a uma diluição de 1: 1000 e, em seguida visualizadas utilizando quimioluminescência (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). Os anticorpos secundários utilizados foram ligado a HRP de cabra anti-IgG de coelho (# 7074) e cavalo ligado a HRP anti-IgG de ratinho (# 7076), tanto a partir de Cell Signaling Technology.

A sobre-expressão da subunidade de proteassoma β1 em células PC-3 de plasmídeo de transfecção

As células com sobre-expressão de proteassoma β1 subunidade foram obtidos por transfecção com ADNc PSMB6 humana de comprimento completo que codifica plasmídeo pcDNA3.1 como descrito anteriormente [34]. Para a transfecção de plasmídeo, 5 × 10

5 células foram semeadas em cada poço de uma placa de seis poços até que as células atingiram cerca de 80% de confluência após cultura durante 24 h. 2.5 ug de plasmídeo pcDNA3.1 ADN que codifica PSMB6 ou DNA de plasmídeo pcDNA3.1 sem PSMB6 (como controlo negativo) foi diluída em meio isento de soro, em seguida, 250 ul e incubadas durante 20 min à temperatura ambiente com uma mistura de 10 ul de Lipofectamina 2000 (Invitrogen ) e meio isento de soro de 400 uL. A mistura de complexo resultante foi então adicionado a cada poço da placa de cultura celular. Após 6 horas de incubação, o meio complexo, foi substituído com meio essencial mínimo de fresco suplementado com 10% (v /v) de FBS e deixar a crescer durante a noite. Em seguida, G418 (Merck) foi adicionado ao meio para alcançar uma concentração final igual a dose fatal mínimo (400 ug /mL). As células foram deixadas a crescer e passagem na presença de G418 durante mais de 2 semanas. Expressão de subunidade de proteassoma β1 nas células transfectadas foi verificada utilizando o ensaio de transferência de Western e comparada com a de células do tipo selvagem e as células de controlo negativo. A citotoxicidade de fangchinoline em células com sobre-expressão de proteassoma β1 subunidade foi então verificado utilizando o ensaio MTT como descrito acima e, quando comparada com a das células do tipo selvagem e as células de controlo negativo.

knockdown de proteassoma em β1 subunidade as células PC-3 por siARN transfecção

Validado siRNAs para PSMB6 (Sigma-Aldrich) foram transfectados em células PC-3 utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Mexidos siRNAs de controlo negativo (Sigma-Aldrich) foram utilizados como controlo negativo. Os níveis de expressão de PSMB6 (proteassoma β1 subunidade) em células do tipo de largura, células PSMB6 knockdown (células tratadas com ARNsi para PSMB6), células de controlo negativo (células transfectadas com ARNsi de controlo negativo mexidos) foram verificadas utilizando o ensaio de transferência de Western. Para verificar a influência do proteassoma β1 subunidade knockdown na citotoxicidade de fangchinoline, as células foram transfectadas com siRNAs para PSMB6 ou mexidos siRNAs de controlo negativo para 24 h. Em seguida, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 103 células /poço e os efeitos de fangcinoline sobre a proliferação celular foram verificadas utilizando o ensaio MTT como descrito acima. Além disso, os efeitos de fangchinoline sobre marcadores de apoptose e autofagia em células normais ou com knockdown da subunidade β1 foram verificadas utilizando o ensaio de transferência de Western como descrito acima. Resumidamente, depois transfectadas com ARNsi para PSMB6 mexidos ou ARNsi de controlo negativo durante 24 h, as células foram tratadas com fangchinoline a 40 ^ M durante 24 h. Em seguida, as células foram colhidas para o ensaio de transferência de Western. Os anticorpos primários utilizados foram de coelho anti-caspase 3 anticorpos (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9662), anticorpo de coelho anti-PARP (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9542) e anticorpo anti-LC3B coelho ( 1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 2775). O anticorpo secundário utilizado foi de cabra ligado a HRP IgG anti-coelho (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 7074).

A análise estatística

Student

t Restaurant – teste foi aplicado para avaliar as diferenças entre os grupos tratados e de controlo. Os dados foram expressos como média ± EPM e os resultados de pelo menos 3 experiências independentes foram utilizados para análise estatística. Os asteriscos indicam uma diferença significativa (P 0,05) em comparação com o controlo tratado com un

Resultados

afinidades de ligação e os efeitos inibidoras diretos de fangchinoline /tetrandrina sobre proteassoma recombinante b1 subunidade

Ambos fangchinoline (Fig 1C) e tetrandrina (Fig 1D) exibiu afinidade de ligação direta com subunidade proteassoma β1 humana recombinante. Como mostrado na Fig 1C, RU aumentou com o aumento da concentração fangchinoline, o que indicou que fangchinoline era capaz de se ligar à subunidade proteassoma β1 de uma forma dependente da dose. Resultados semelhantes foram observados para tetrandrina (Figura 1D). A associação (

k

a), dissociação (

k

d) e dissociação de equilíbrio (

K

D) constantes de fangchinoline ou ligação à subunidade proteassoma β1 tetrandrina foram apresentados na Tabela 1. os resultados sugeriram que fangchinoline e tetrandrina exibiu afinidade de ligação semelhante ao proteassoma β1 subunidade. Além disso, tanto fangchinoline e tetrandrina pode inibir diretamente a atividade da enzima de proteassoma recombinante β1 subunidade

in vitro

. Como mostrado na Fig 1E, dependente da dose, fangchinoline inibiu a actividade de proteassoma recombinante β1 subunidade. Resultados similares foram observados para tetrandrina (Fig 1F).

Efeitos de inibidor de fangchinoline sobre a proliferação e do proteassoma celular atividades das células cancerosas

Como mostrado na Figura 2A, fangchinoline poderia dose-dependente e tempo-dependente na redução da viabilidade de células PC-3. A IC

50 valores de fangchinoline na inibição da proliferação celular de células PC-3 foram 27,53 ± 3,346 uM, durante 24 h, 13,13 ± 1,579 uM, durante 48 h, e 7,247 ± 0,3122 uM durante 72 h de tratamento, respectivamente. Além disso, como mostrado na Fig 2B, fangchinoline poderia dependente da dose inibem a actividade C-L de proteassoma celular, que foi mediada por proteassoma β1 subunidade. A inibição da actividade de C-G foi significativa em doses de fangchinoline 1 e 10 uM. As atividades do proteassoma tripsina (TL) e do tipo quimotripsina (CT-L) atividades, mediada por β2 proteassoma e subunidade β5, não foram significativamente afetados pelo tratamento fangchinoline.

(A) A viabilidade celular (MTT resultado do ensaio) de células PC-3 tratadas com várias concentrações de fangchinoline para 24, 48 ou 72 h. Os dados foram resultados estatísticos de três experimentos independentes. (B) actividade de proteassoma celulares de células PC-3 tratadas com 0,1% de DMSO ou fangchinoline em diferentes concentrações durante 24 h. (C) A viabilidade celular (resultado do ensaio de MTT) das células LNCaP tratadas com várias concentrações de fangchinoline para 24, 48 ou 72 h. (D) de proteassoma actividades celulares de PC-3 de células de controlo tratadas com DMSO a 0,1% (controlo de solvente) ou fangchinoline em diferentes concentrações durante 24 h. Os dados foram resultados estatísticos de três experimentos independentes. *

p Art 0,05 vs. controlo do solvente. Carfilzomib foi utilizado como controle positivo.

Resultados similares foram observados em outra linha de células de câncer, células LNCaP. dependentemente da dose Fangchinoline e tempo-dependente na redução da viabilidade de células LNCaP (figura 2c). A IC

50 valores de fangchinoline na inibição da proliferação celular de células LNCaP foram 36,18 ± 6,33