Abstract

Fundo

polo-like kinase Humana 1 (PLK1) expressão tem sido associada a resultados inferiores em cancro colo-rectal. Nossos objetivos foram analisar PLK1 no cancro rectal, e sua associação com variáveis ​​clínico-patológicas, a sobrevida global, bem como a regressão do tumor ao tratamento neoadjuvante.

Métodos

expressão PLK1 foi quantificada com imuno-histoquímica no centro e periferia (frente invasiva) dos cancros rectais, bem como nas envolvidos linfonodos regionais de 286 pacientes. Pontuações foram baseadas em intensidade de coloração e a percentagem de células positivas, multiplicado para dar pontuações ponderadas 1-12, dicotomizada em baixa (0-5) ou alta (6-12).

Resultados

pontuações PLK1 na periferia do tumor foi significativamente diferente com a mucosa normal adjacente. A análise de sobrevida revelou que a baixa pontuação PLK1 na periferia do tumor teve uma taxa de risco de morte de 0,59 na análise multivariada. Outros preditores de sobrevida incluíram idade, a profundidade do tumor, estado metastático, invasão vascular e perineural e quimioterapia adjuvante. Não houve correlação estatisticamente significativa entre o escore PLK1 e regressão do tumor histológico na coorte neoadjuvante.

Conclusão

pontuação baixa PLK1 foi um preditor independente de sobrevida global superior, o ajuste de múltiplas variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo tratamento .

Citation: Tut TG, Lim SHS, Dissanayake IU, Descallar J, Chua W, Ng W, et al. (2015) regulada Polo-Like Kinase 1 Expressão correlaciona-se com os resultados de sobrevivência inferiores em cancro retal. PLoS ONE 10 (6): e0129313. doi: 10.1371 /journal.pone.0129313

Editor do Academic: Kyung S. Lee, do Instituto Nacional do Câncer, NIH, Estados Unidos

Recebido: 30 de novembro de 2014; Aceito: 08 de maio de 2015; Publicação: 05 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tut et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é uma das principais causas de mortalidade no mundo desenvolvido. cancros rectais compreendem um terço destes casos e realizar um prognóstico pior do que os cancros do cólon. Na configuração localmente avançado, eles são tratados de forma diferente para cancros do cólon, com a terapia trimodal constituído por quimioradioterapia neoadjuvante, cirurgia e quimioterapia adjuvante [1]. tumores retossigmoide são tratados semelhante aos tumores do cólon, como é o cancro rectal metastático. Há uma necessidade de biomarcadores para informar prognóstico e escolha da terapia, avaliar a resposta ao tratamento e ajuda na estratificação de risco do paciente, a fim de se adaptar e personalizar o atendimento ao paciente.

Recentemente, Rodel e colegas relataram polo-like cinase 1 (PLK1) para ser um novo biomarcador preditivo de sensibilidade à radiação no cancro rectal [2]. Nós hipótese de que a sobre-expressão de PLK1 se correlaciona com piores resultados no cancro rectal. PLK1 é um regulador mitótico serina /treonina-quinase de células de ciclo necessário para a divisão celular, envolvidos na regulação mitótica de entrada, a formação do fuso e a citocinese [3-5]. O significado funcional de PLK1 em carcinogénese e progressão maligna não é claramente entendida, mas contudo, a sua sobre-expressão é encontrada em muitos tipos de cancro [2,6], incluindo o cancro colo-rectal [7,8]. A sua capacidade tumorigénica foi mostrado em ratinhos nus injectados com fibroblastos NIH3T3 que sobre-expressam PLK1 [9]. Utilização de pequenos RNA [10,11] e oligonucleótidos anti-sentido interferem [12] em células malignas que empobrecem níveis PLK1 também induziu apoptose e contenção da proliferação maligna em

in-vitro

e

in vivo

modelos. actividade PLK1 é necessário na reparação de danos no ADN resultante de quimioterapia e radioterapia [13]. Daí PLK1 parece ser um biomarcador preditivo e prognóstico promissor, e aqui nós investigamos o seu papel no câncer de reto. Temos também como objectivo mostrar que PLK1 é independente do marcador de proliferação celular Ki67.

Materiais e Métodos

aprovação ética foi obtida em 22

nd junho 2012 de South-West área de Sydney Serviço de Ética Comitê de revisão de saúde, número de referência HREC /12 /LPOOL /102. O conselho de revisão institucional dispensou a necessidade de consentimento informado por escrito dos participantes como o projeto foi considerado na categoria de baixo ou insignificante risco. Informações de-foi identificado antes da análise.

Os espécimes de uma cirurgia primária para o câncer retal ou retossigmóides foram obtidos a partir do banco de dados de South-Western Area Patologia, Austrália 2000-2010. A cirurgia consistiu na excisão total do mesorreto, com anterior ou ressecção abdominoperineal. As variáveis ​​de interesse foram: idade, sexo, estágio patológico do tumor, grau, invasão vascular, invasão perineural, linfócitos infiltrantes de tumor e tratamento. O estadiamento foi baseado no Comitê Americano conjunta sobre Câncer (AJCC) metástases tumor-node-sistema (TNM). Desfechos de interesse foram a sobrevida global (OS) e regressão do tumor histológico (TRG) no intestino ressecado para os casos tratados com quimioradioterapia neoadjuvante. OS foi definido como o tempo desde o diagnóstico até último acompanhamento ou morte. TRG foi classificada com base nos critérios AJCC, modificado a partir Ryan [14]: resposta completa sem células malignas viáveis ​​(0), resposta moderada com único ou pequenos grupos de células malignas (1), resposta mínima à malignidade residual superado por fibrose ( 2) ea resposta pobre com extensa doença maligna residual (3). RG 0, 1 e 2 foram classificados como respondedores e TRG 3 como não-respondedores. Follow-up consistiu em visitas clínicas regulares, colonoscopia, exames de sangue e de imagem, a critério do especialista tratamento.

Para cada paciente, blocos dadores de tecido embebido em parafina foram obtidos a partir do departamento de anatomia patológica. Dois núcleos, cada um milímetro em diâmetro, foram obtidos a partir de cada local de amostragem que inclui centro do tumor (TC), a periferia do tumor (TP), mucosa normal perto do tumor (NCT) e mucosa normal longe do tumor (NAT). Também foram obtidos dois fragmentos de tecido a partir de nódulos linfáticos (LN) nos casos nódulo positivo. TC foi feita a partir do centro da massa do tumor, TP a partir da periferia do tumor infiltrante /invasivo, NCT de mucosa normal imediatamente adjacente ao tumor e NAT da mucosa normal bem longe do tumor, geralmente nas margens de extremidade do intestino ressecado. Estas foram transferidas para os poços pré-perfurados no bloco tissue microarray (TMA) utilizando o Manual de tecido Beecher arrayer-1 (Sun Prairie, WI, EUA). Os blocos de TMA foram aquecidos durante 5 minutos em 60 ° C forno para selar as lacunas entre núcleos de tecido e parafina circundante.

seções de slides retirado do TMA foram deparaffinised com xileno, seguido de álcool absoluto, em seguida, re-hidratado em gradiente de álcool. Antígeno foi recuperado no calor em 98 ° C banho de água com Tris EDTA (pH 9,0) tampão. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com H

2O

2, antes da incubação com anticorpo monoclonal primário PLK1 de ratinho (diluição 1:50, sc17783, Santa Cruz Biotechnology). O anticorpo foi originado e coradas de acordo com o método publicado anteriormente [15]. etapa Linker com solução de rato vinculador, seguido pelo secundário incubação do anticorpo (polímero Envision FLEX /HRP, Dako) precedeu a aplicação de cromogénio (Flex DAB, Dako) e contracoloração com hematoxilina. Ki67 foi corado na Dako Autostainer utilizando o anticorpo fornecido na diluição de 1: 100, com recuperação de epítopo de calor induzida a pH 6,0 e 10 minutos de tempo de incubação de anticorpo primário

As secções foram examinadas por contagem manual das células. cada TMA ponto, com o observador cego para os resultados clínicos. Percentagem de células positivas e a intensidade da coloração de PLK1 foram marcados (Figura 1). A intensidade foi classificada como negativa (0), fraca (1+), moderada (2+) ou forte (3+) e a percentagem de células positivas classificados como 5% (0), 5-25% (1), 26 -50% (2), 51-75% (3) e 75% (4). Estas duas medidas foram multiplicados para dar pontuações ponderadas 0-12, dicotomizada em baixa (0-5) ou alta (6-12), como descrito por Rodel [15]. As duas pontuações para cada local de amostragem duplicado foram em média, obtendo a pontuação média ponderada finais (S1 tabela). Para Ki67, porcentagem de coloração foi marcado, e as duas contagens para cada local de amostragem duplicada se a média (S1 Tabela).

As imagens de alta potência mostrar dezenas de (b) pontuação ponderada de 0, (c) pontuação ponderada de 3, a partir de 1 (percentagem de 5-25%) x 3 (forte intensidade) e (d) pontuação ponderada de 4 (percentagem 75%) x 3 (forte intensidade), anote o contraste com as glândulas normais adjacentes

teste t-pareado foi utilizado para comparar PLK1 no TC e TP, o teste exato de Fisher para as associações entre PLK1 e variáveis ​​clínico-patológicas, e regressão de Cox para OS. Apenas os casos com dados completos sobre todos os domínios variáveis ​​foram incluídos nas análises uni e multivariada. Significância foi estabelecido em

p Art 0,05. As variáveis ​​com uma uni

p

-valor ≤0.2 foram incluídos no modelo multivariado inicial. As variáveis ​​não significativas foram removidos iterativamente e coeficientes verificado para determinar se a remoção de uma variável resultou em uma grande mudança efeito para qualquer uma das variáveis ​​restantes. Isto foi repetido até que as variáveis ​​significativas permaneceu. Dois interações caminho entre as demais variáveis ​​foram verificados quanto significado e incluída no modelo se eles foram significativas. O teste supremo para a assunção de riscos proporcionais foi usada para determinar se as funções de risco ao longo do tempo foram constantes. Para as variáveis ​​que não satisfazem a perigos assunção proporcional, um termo de interação entre tempo e essa variável foi incluída no modelo para explicar não-proporcionalidade. As análises dos subgrupos foram realizadas utilizando um procedimento semelhante para pacientes no grupo positivo nó de linfa para determinar se PLK1 no nó envolvido correlacionada com o número de nó (teste exacto de Fisher) e com a sobrevivência (regressão de Cox). Outra análise de subgrupo (teste exato de Fisher) foi realizada em pacientes que se submeteram a terapia neoadjuvante para determinar se houve uma correlação entre PLK1 e TRG. Ki67 foi correlacionada com a pontuação PLK1 meio de regressão logística. A análise dos dados foi gerado utilizando o software SAS Enterprise Guide, Versão 6.1 do Sistema SAS para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados

Características da população do estudo

duzentos e oitenta e seis casos foram identificados, com uma idade mediana de 73 anos (S1 tabela). A coorte consistiu de 34% do sexo feminino, 66% do sexo masculino, 33% pT1 /2, 67% pT3 /4, 48% nódulo positivo e 7% com doença metastática. Acompanhamento médio foi de 3,1 anos e 5 anos OS 58%. Vinte e dois por cento receberam terapia neoadjuvante e terapia adjuvante a 30%. A quimioterapia adjuvante consistiu de infusão de 5-FU, a capecitabina ou FOLFOX (5-FU e oxaliplatina). Fora do grupo de terapia neoadjuvante, 25% receberam de curta duração (25 Gy em 5 frações, 5 Gy por fração, mais de 5 dias) e 75% de longo curso chemoradiation concorrente (45 a 50,4 Gy, 1,8 Gy por fração, mais de 5 6 semanas, com concomitante infusão de 5-fluorouracil 225 mg /m

2 /dia).

pontuações PLK1

a média de pontuação PLK1 ponderada foi de 2,5 para o centro do tumor (TC) e 3,4 para periferia do tumor (TP). A composição de TC e TP pontuações ponderado é mostrada na Tabela 1 e as contagens discretas mostrados na Tabela S1. As pontuações dicotômicas de positivo contra o negativo também são mostrados. TC e TP pontuações ponderadas foram significativamente diferentes (teste t pareado

p Art 0,001). Coloração em TP e TC teve proporções semelhantes de 75% da coloração (isto é, 35%), no entanto as proporções de 3+ coloração foi de 14% no TC e 25% no TP. A média de pontuação PLK1 foi de 3,4 para NCT e 3.0 para NAT, e essas pontuações foram significativamente diferentes (

p

= 0,025). NAT era significativamente diferente para TP (

P

= 0,011), mas não para o TC (0,08), portanto, TP foi considerado como sendo uma representação mais precisa da coloração do tumor, e será aqui usado para análises. A distribuição das pontuações TP é ilustrada na Figura 2.

Associações entre a pontuação PLK1 e características clínico-patológicas

Uma associação foi encontrada entre os escores TP e estado metastático, em que pacientes com doença metastática apresentaram uma pontuação baixa TP PLK1 em 95% dos casos em comparação com 72% no grupo de doença não metastático (Tabela 2). Não houve outras associações significativas.

analisa Survival

As 12 variáveis ​​de interesse incluídos TP PLK1 ponderada pontuação, idade, sexo, estágio TNM, grau histológico, invasão vascular, invasão perineural , a presença de linfócitos que se infiltram no tumor, quimioterapia adjuvante e tratamento neoadjuvante. Houve 219 casos com dados completos sobre todos estes domínios. regressão Cox análises univariadas mostraram maior pontuação TP PLK1, maior idade, maior estádio T tumor, estado metastático, presença de invasão vascular e perineural e ausência de quimioterapia adjuvante para ser preditores significativos de pior OS (Tabela 3, Figura 3). O modelo multivariado final inclui pontuação TP PLK1, estado nodal, estado metastático, uma interação entre a quimioterapia adjuvante e estado vascular, e uma interação entre a quimioterapia adjuvante e do tempo (Tabela 3). pontuação elevada TP PLK1, estado nodal positivo e presença de metástases foram encontrados para ser associado com pior sobrevida. Os pacientes que não tinham recebido quimioterapia adjuvante tiveram uma sobrevida pior do que pacientes que receberam quimioterapia adjuvante e este efeito foi observado para ser pior para os pacientes cujos cânceres tinha invasão vascular. Com o tempo, o efeito de não ter quimioterapia adjuvante reduzida, e não foi significativa após 2 anos para cancros sem invasão vascular. No entanto, a sobrevivência permaneceu significativamente pior para até 10 anos em cancros com invasão vascular (S1 Fig).

subgrupo positivo Linfonodo

Média LN pontuação PLK1 na 105 casos nódulo positivo foi de 3,1. Não houve associação estatisticamente significativa entre a pontuação LN PLK1 e número de nós envolvidos (

p

= 0,097). No entanto, parecia haver uma tendência entre os maiores pontuações LN PLK1 e maior número de linfonodos positivos, com 68% das pontuações mais altas PLK1 com N2 em relação ao estatuto N1. Houve associações limítrofes entre os escores LN PLK1 e invasão vascular (

p

= 0,064), invasão perineural (

p

= 0,070) e grau histológico (

p

= 0,057) .

Na análise univariada (n = 78), LN PLK1 não foi significativamente associada à sobrevida (

p

= 0,114). Nas análises multivariadas (n = 78), LN PLK1 não foi significativamente associada com a sobrevivência (

p

= 0,7083) após o ajuste para quimioterapia adjuvante e interação invasão vascular; bem como quimioterapia adjuvante e interação tempo.

subgrupo neoadjuvante

Dos 57 pacientes que se submeteram à quimioradioterapia neoadjuvante. Vinte e três por cento tinham graus TRG 1 a 2 (respondedores) e 77% tinham TRG3 (não-respondedores). Não houve associação significativa entre o escore TP PLK1 e TRG (

p

= 0,096).

Associação entre PLK1 e Ki67

Ki67 pontuações médias em TC, TP e LN estavam 9%, 8% e 4%, respectivamente. núcleos em NAT e NCT foram 1%. A regressão logística não revelaram associações significativas entre PLK1 e Ki67 na TC (

p

= 0,539), TP (

p

= 0,406) e LN (

p

= 0,413).

Discussão

Enquanto há uma série de publicações sobre os efeitos prognósticos de PLK1 em várias malignidades humanas [6,16], este é o primeiro relatório para o nosso conhecimento, investigando expressão PLK1 na amostragem diferente locais do mesmo tumor, e demonstrando que upregulated expressão PLK1 na periferia do tumor primário se correlaciona com o resultado de sobrevivência inferior no câncer de reto, e é independente do marcador de proliferação Ki67.

Encontramos expressão variável de PLK1 na centro e periferia do tumor primário, e em depósitos nodais. Em comparação com a mucosa normal longe do tumor, o marcador periférico PLK1 foi significativamente maior. A frente invasiva periférica iria ser racionalizado como sendo mais um reflexo do comportamento do tumor como é biologicamente mais ativo no que diz respeito à interacção com e destruição dos tecidos circundantes. A periferia da massa tumoral é uma melhor oxigenação e espera-se ser mais sensível à radiação em oposição ao centro que pode ser necrótico ou isquémico. Propomos que a periferia do tumor ser usado como o local de amostragem para rectal pontuação PLK1 tumor.

Nós demonstramos que TP PLK1 ponderada correlações entre escore de sobrevida global, com uma HR de 0,59. O OS 5 anos foi de 60% no grupo com baixa pontuação PLK1 em comparação com 50% no grupo com altas pontuações PLK1. variáveis ​​significativas para a sobrevivência incluíram idade, estágio do tumor, estado metastático e interações entre quimioterapia adjuvante com invasão vascular, e com quimioterapia adjuvante e tempo. TP PLK1 pontuação foi um fator prognóstico independente de sobrevivência, mesmo após o ajuste para essas variáveis. Importante, temos ajustado para o tratamento adjuvante. Nosso acompanhamento médio foi de 3,1 anos, o que seria um reflexo de sobrevivência a longo prazo, dado que três anos de acompanhamento é um ponto final adequado, com uma elevada correlação com a sobrevida global no cancro colorectal [17].

PLK1 expressão também tem sido documentada em precursoras /início cancros de outros órgãos, tais como na cistadenoma ovariano [18] e no carcinoma precoce papilar da tiróide [19] e anteriormente PLK1 sobre-expressando os cancros colo-rectais foram relatados para exibir um fenótipo mais radiorresistente [2 ]. Nós não poderia confirmar isso em nossas descobertas, no entanto, reconhecer que a coorte neoadjuvante composta apenas um pequeno subconjunto da população estudada e, portanto, pode ter poder suficiente para demonstrar essa relação.

Também investigamos PLK1 nos gânglios linfáticos no a população nódulo positivo. Parecia haver uma tendência para uma associação entre maior pontuação LN PLK1 e maior número de nó, o que é consistente com a nossa hipótese de que a sobre-expressão de PLK1 se correlaciona com resultados mais pobres. No entanto LN PLK1 não se correlacionou significativamente com a sobrevivência, dentro das limitações do pequeno subgrupo análises.

pontuação baixa PLK1 foi significativamente associada com presença de doença metastática. Dado que a nossa coorte consistiu de uma pequena percentagem de casos metastáticos (7%), a utilidade clínica do PLK1 terá de ser mais explorada nesta população de pacientes. Pode-se supor que a maioria dos casos metastáticos não permitiu a recolha de tecido ressecado, portanto, limitando a capacidade de detectar casos com coloração de alta PLK1. Maiores estudos são necessários para definir a interação entre o escore PLK1 e estado metastático em relação aos resultados.

Também realizamos coloração corroborative com Ki67, e demonstrou nenhuma associação significativa entre PLK1 e coloração Ki67. Daí PLK1, embora importante na regulação do ciclo celular, não é simplesmente um substituto para a proliferação celular.

Os nossos resultados são consistentes com observações de estudos de linha celular, onde restabelecimento da atividade PLK1 é essencial na recuperação de G2 /prisão checkpoint M seguinte danos no DNA. O último inibe PLK1 que normalmente requer a fosforilação em sua alça de ativação treonina 210 por Bora em agrupamento com quinase a montante. Treonina 210 fosforilação de picos Plk1 com a acumulação normal das Bora em fase G2. PLK1 posteriormente ativa alvos e células jusante progredir através de mitose [20]. Continuação de inactivação resultados PLK1 em entrada tardia para a mitose. Por outro lado, a superexpressão de PLK1 constitutivamente fosforilada sobrepõe danos ao DNA induzidos G2 /M detenção checkpoint [2,21,22]. Isto é importante no cancro rectal como radiação induz quebras de ADN de cadeia dupla. agentes quimioterápicos usados ​​no cancro rectal, quer em paralelo com a radiação ou em contexto adjuvante, incluem 5-fluoropirimidina que é um anti-metabolito, e oxaliplatina, que é um agente alquilante que faz com ligações cruzadas em DNA.

Current gestão terapêutica de cancro rectal pode ser melhorada pela disponibilidade de melhores biomarcadores preditivos e prognósticos. antígeno carcinoembrionário (CEA) é atualmente o único biomarcador nas orientações National Comprehensive Cancer Network (NCCN), como parte da encenação linha de base e na vigilância pós-tratamento. Na presença de metástases,

K-ras

é um marcador preditivo de resposta à terapia com inibidor EGFR [23]. Nossos resultados sugerem que PLK1 é um biomarcador de prognóstico potencialmente útil em pacientes com câncer retal. inibição PLK1 é actualmente considerado como um agente terapêutico anticancerígeno promissor. O inibidor PLK1 Volasertib (BI6727) concluiu a fase II do teste clínico para determinar os seus perfis anti-malignas e segurança [24,25]. Outros inibidores de PLK1 em desenvolvimento incluem BI2536 (Axon), que, se entregue antes ou depois da exposição à radiação, respectivamente poderia resultar em qualquer aumento da morte celular durante a paragem da mitose ou aumento da recuperação das células a seguir à reparação do ADN durante a paragem ponto de controlo G2 [13]. Outros estudos prospectivos validar a utilidade clínica do PLK1, como demonstrado aqui, na gestão do cancro retal são necessários para reforçar as nossas conclusões e traduzi-las em uso clínico.

Informações de Apoio

S1 Fig. . Efeito da quimioterapia adjuvante estratificada por nível invasão vascular ao longo do tempo, HR = taxa de risco

doi: 10.1371 /journal.pone.0129313.s001

(TIF)

S1 Table. O conjunto de dados mostrando as 286 pacientes, incluindo suas contagens discretas média PLK1, valores Ki67, variáveis ​​clínicas e os resultados de sobrevivência

doi:. 10.1371 /journal.pone.0129313.s002

(XLS)