Abstract

Anti-mesothelin

Pseudomonas

imunotoxinas recombinantes baseados em uma exotoxina (Rits) apresentam um potencial modalidade de tratamento para pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC). Para estudar mecanismos de resistência, a linha de células PDAC sensível KLM-1 foi intermitentemente expostos ao anti-mesothelin SS1-LR-GGS RIT. As células sobreviventes foram resistentes a vários anti-rits mesothelin (IC

50 1 ug /ml), incluindo o novo RG7787 desimunizada. Estas células KLM-1-R resistentes foram igualmente sensíveis ao anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 RIT como KLM-1, indicando resistência era específico para Rits anti-mesothelin. a expressão do gene mesothelin foi parcialmente regulada negativamente KLM em-1-R, resultando em 5 vezes os níveis de proteína de superfície inferior e diminuiu a absorção celular de RG7787 comparação com KLM-1. análise de sequenciação de bissulfito descobriram que a região do promotor mesotelina foi significativamente mais metilado em KLM-1-R (59 ± 3,6%) em comparação com a KLM-1 (41 ± 4,8%), indicando a hipermetilação como um mecanismo de regulação negativa mesotelina. O inibidor da DNA metiltransferase 5-azacitidina restaurado expressão de superfície mesotelina original para mais de metade em KLM-1-R e aumento da sensibilidade à RG7787 (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml), ainda que as células permaneciam significativamente menos sensível em relação a células parentais KLM-1 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). introdução de ADNc mesothelin em KLM-1-R conduziu a 5 vezes os níveis de proteína de superfície superior e a absorção RG7887 significativamente maior em comparação com a KLM-1. Como resultado, a sensibilidade original para RG7787 foi completamente restaurado (IC

50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). Uma absorção RG7787 significativamente mais elevada foi, assim, necessária para alcançar a citotoxicidade em células originais resistentes, indicando que o tráfico RIT intracelular é também um factor limitativo. RNA análise de sequenciação profunda de células KLM-1 e KLM-1-R apoiado os nossos resultados experimentais; comparado a KLM-1, células resistentes exibido expressão diferencial de genes ligados ao transporte intracelular e um padrão de expressão que combinava com um status mais geral hipermetilação. Em conclusão, a resistência a Rits anti-mesothelin na KLM-1 está ligada a um associado-metilação down-regulação da mesothelin, enquanto aberrações no tráfico RIT também poderia desempenhar um papel

Citation:. Hollevoet K, Mason Osann E, Müller F, Pastan I (2015) metilação-Associated parcial Down-Regulação da mesothelin provoca resistência ao Anti-mesothelin imunotoxinas em uma linha de células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10.1371 /journal.pone.0122462

Recebido: 23 de dezembro de 2014; Aceito: 17 de fevereiro de 2015; Publicação: 24 de março de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada pela Intramural Programa de Pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer, e por um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo (# 2791) entre o Instituto Nacional do Câncer e Roche Pharmaceuticals. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. K. H. foi financiado em parte pelo Fundo de Investigação Científica Flanders (FWO, Bélgica). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pela Roche Pharmaceuticals. I.P. é um inventor em diversas patentes de imunotoxinas que têm sido designados para NIH (incluindo US 8357783 “anticorpos monoclonais anti-mesothelin Humanos”, US 20120263674 “exotoxina A de Pseudomonas com imunogenicidade reduzida” e US 20140094417 “exotoxina A de Pseudomonas com células T menos imunogénica e /ou epitopos de células B “). Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Nosso laboratório desenvolve imunotoxinas recombinantes (Rits) para o tratamento do câncer. Rits do momento em ensaios clínicos são compostas de um Fv de ligação ao antigénio fundido com uma porção de 38 kDa de

exotoxina de Pseudomonas Um

(PE) [1]. Depois de endocitose mediada por receptor, rits são proteoliticamente processada, e PE é proposto para o tráfego para a rede trans-Golgi e movimento de uma via retrógrada de retículo endoplasmático, onde se submete a translocação para o citoplasma [2]. Após a chegada no citosol, PE alvo fator de elongação-2 (EF-2). EF-2 madura é produzido por modificação pós-tradução de histidina 715 pelas proteínas Diphthamide Biossíntese (DPH) e 1-5 7 [3, 4]. Este histidina modificada ( ‘diphthamide’) é ADP-ribosylated pelo PE, que inativa EF-2 e interrompe a síntese de proteínas, levando à morte celular programada [2].

Nós previamente isoladas e caracterizadas várias linhagens de células leucêmicas resistente à

Moxetumomab pasudotox

[5-7], um-CD22 anti RIT atualmente no III ensaio clínico de fase (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01829711). Estas linhas de células resistentes mostram várias aberrações na expressão DPH, que impedem que EF-2-ribosilação de ADP e protegem as células de inibição da síntese de proteínas [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), outro RIT em ensaios clínicos, tem como alvo mesotelina, uma superfície celular glicofosfatidilinositol 40-kDa (GPI) ancorada proteína [8] que é altamente expresso em vários tumores malignos, incluindo mesotelioma e o adenocarcinoma ductal pancreático ( PDAC) [9-11]. SS1P tem limitado actividade clínica como um agente único, principalmente por causa da imunogenicidade PE limitante da dose em pacientes [12, 13]. Em resposta, SS1P foi combinada com imuno-rits esgotar quimioterapêuticos, resultando em respostas sem precedentes em pacientes com mesotelioma avançado refractário [14], e baixa-imunogénicos têm sido manipulada no qual muitos B- ou de células T e epítopos de regiões sensíveis à protease de PE38 são removidos. Este último resultou em um 24-kDa toxina porção truncada e desimunizada (PE24) que tem menos reactividade com anti-soros de humano, é resistente à degradação lisossomal, e exibe uma diminuição da toxicidade não específica em modelos de roedores

in vivo

[15-18]. Em colaboração com a Roche Innovation Center Penzberg, Alemanha, este backbone PE24 foi integrado um RIT anti-mesothelin romance, chamado RG7787, ligando-o a uma humanizado Fab anti-mesothelin, assim, tamanho e meia-vida circulatória [19] aumentando.

recentemente, mostrou que RG7787 tem uma actividade significativa num modelo de xenoenxerto PDAC, que foi criada por enxertia células KLM-1 em ratos imunodeficientes. RG7787 também foi citotóxica contra várias outras linhas celulares PDAC, embora

in vitro

morte celular não era absoluto [19]. Nós relatado anteriormente que um desequilíbrio entre as proteínas pro- e anti-apoptóticas protege as células cancerosas, incluindo PDAC, da morte celular induzida por PE [20-22]. Para obter insights sobre outros mecanismos de resistência, o objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar células da KLM-1 que eram resistentes a Rits anti-mesothelin.

Material e Métodos

imunotoxinas recombinantes e reagentes

Clinical-grade anti-mesothelin SS1P e anti-CD25 LMB-2 [anti-Tac (Fv) -PE38] foram fabricados e fornecidos pela Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) foi fornecido pela Roche Innovation Center Penzberg, Alemanha sob um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo (# 2791). Anti-mesotelina SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-GGS) e da imunotoxina anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 foram produzidos no nosso laboratório, de acordo com um protocolo padrão [23]. Ambos SS1-LR-GGS e RG7787 são re-engenharia de versões de baixo imunogénicas dos SS1P que consistem de um fragmento PE24. modificações específicas incluem a remoção da maior parte do domínio II de PE, deixando um local de clivagem de furina, e adicionando um Gli-Gli-Ser (GGS) ligante peptídico baseado após o local de clivagem da furina. RG7787 é ainda mais optimizada para o uso clínico, substituindo o ratinho anti-mesotelina Fv (SS1) com um fragmento Fab humanizado (huSS1), para aumentar o tamanho e uma meia-vida, por conseguinte, circulatório, e através da introdução de sete mutações (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, R538A e) no domínio catalítico III de PE de silenciar os epítopos de células B [19]. 5-azacitidina (AZA) (Sigma) é um inibidor da metiltransferase de ADN, e dissolveu-se em meio RPMI-1640.

cultura celular

linha celular PDAC KLM-1 [24] foi mantida em RPMI-1640 e fornecida em 2011 pelo Dr. Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), que originalmente obtido da linha celular a partir do banco de células RIKEN. linha de células A431 carcinoma epidermóide foi mantida em DMEM e doado em 1982 pelo Dr. George Todaro (NCI, Bethesda, MD), que isolado originalmente a linha de células [25]. Os meios foram suplementados com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen). Para isolar células resistentes, 3 x 10

5 células KLM-1 foram semeadas numa placa de 6 poços e incubadas com 1 ug /ml SS1-LR-GGS durante 72 horas, que matou mais de 90% das células (S1 FIG.). as células residuais foram expandidas durante 5 semanas em meio de células RIT-livre, após o que uma segunda ronda de selecção foram realizados de forma semelhante com 1 ug /ml SS1-LR-GGS, resultando em KLM-1-R. Essas células foram expandidas em meio RIT-livre e armazenados de forma viável congelado em N

2 para estudos posteriores. identidades linha celular foram verificadas utilizando análise de repetição em tandem curtas (NCI, Frederick, MD). Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2.

A proliferação celular, morte celular e a síntese de proteínas ensaios de inibição

KLM-1 e KLM-1 crescimento celular -R foi comparada por meio da contagem de células viáveis ​​com uma visão Cellometer (Nexcelom). As células mortas foram excluídos usando coloração com azul de Tripano, e cada ponto no tempo foi contado em triplicado. Para avaliar o efeito do tratamento, rits foram adicionados cerca de 16 horas após a sementeira das células numa placa de 6 ou 96 poços. A inibição do crescimento foi avaliada medindo os níveis de ATP com o título-Glo Luminescent ensaio celular A viabilidade celular (Promega). Os valores foram normalizados entre os controlos de 1 uM estaurosporina (Sigma-Aldrich) e tampão (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem Ca e Mg (D-PBS), de qualidade biológica, Inc.) contendo albumina de soro humano 0,2% (Divisão de recursos veterinários, NIH , Bethesda, MD) ou médio. -Campo brilhante fotos foram tiradas em um microscópio Zeiss com um objetivo 10X CE Plan-Neofluar utilizar a câmara AxioCam MRc eo software de aquisição AxioVision 4.7.2. A morte celular foi avaliada usando a anexina V-PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen), de acordo com as instruções do fabricante. As células apoptóticas foram considerados Anexina V-positivo, tal como determinado por gating as células não tratadas. inibição da síntese de proteína foi quantificada medindo [

3H] leucina incorporação (Perkin Elmer) como feito anteriormente [22]. Os valores são apresentados relativamente aos controlos de D-PBS 0,2% de albumina de soro humano e controlos de 100 ug /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) tratado.

em tempo real de RT-qPCR

ARN

estava isolada e purificada a partir de células utilizando o kit RNeasy (Qiagen), de transcrição reversa foi realizada com o kit QuantiTect transcrição reversa (Qiagen), e a amplificação com o kit de PCR verde SYBR QuantiFast (Qiagen). As sequências dos iniciadores para DPH1-5, DPH7, mesotelina, e β-actina estão apresentados na Tabela S1. Real-time RT-qPCR foi realizada em um HT ABI 7900 máquina de RT-PCR, analisados ​​pelo comparativa C

método T (ΔΔ

C

T) método com o gerente de SDS (Applied Biosystems) . e normalizada para a β-actina endógena

expressão da proteína de superfície por citometria de fluxo

mesotelina rato anti-humano (MN; Rockland Immunochemicals, Inc.) e R-PE anti-humano CD71 ( BioLegend) foram usadas para avaliar a expressão da proteína de superfície. A IgG de ratinho-PE-R de controlo de isotipo (BD Biosciences) foi utilizado como um controlo negativo para a coloração mesotelina. Anti-mesotelina e o controlo de isotipo foram coradas com um secundário de cabra anti-IgG de ratinho-R-PE (diluição de 1: 250, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). A intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo num FACSCalibur. grânulos QuantiBRITE R-PE (BD Pharmingen) foram usadas para quantificar o número de locais de ligação mesothelin por célula.

Shed níveis mesothelin na célula médio

níveis mesothelin Solúvel em meio linha celular foram medidos em duplicado com uma mesothelin Meso Scale Assay (Morphotek, Inc.), utilizando a tecnologia eletroquimioluminescência de Meso Scale Discovery. As células foram semeadas em meio de cultura de células regular em uma placa de 12 poços. Depois de 20 horas, o meio foi recolhido, o volume foi medido e o número de células contadas por poço. Após a centrifugação o meio, os sobrenadantes foram armazenados a -80 ° C até à análise. sobrenadante celular foi diluído 50 vezes e adicionados a poços de uma placa de 96 poços previamente revestidas com anticorpo de captura. O procedimento foi realizado tal como descrito anteriormente [26], e os sinais foram medidos num MSD Descoberta Workbench (Meso Scale Discovery). A quantidade de mesothelin derramado por KLM-1 e KLM-1-R foi calculado multiplicando a concentração mesothelin obtido com o volume bem, e padronizado para o número de células contadas por poço.

captação celular RG7787

rits foram marcadas com Alexa Fluor 647 o kit de marcação (Invitrogen) durante 3,5 horas e purificou-se de acordo com as instruções do fabricante. As células colhidas foram incubadas durante 30, 75 e 150 min a 37 ° C, com um saturante de 2 ug /ml de SS1P-Alexa647 ou RG7787-Alexa647 e processado como anteriormente descrito [22]. A intensidade da fluorescência foi analisada num FACSCalibur. A absorção foi expressa em número de moléculas RG7787 internalizados, que foi calculada assumindo a expressão de superfície GEOMEAN RG7787-Alexa647 de KLM-1 igual a 60 x 10

3 moléculas RG7787 (= mesotelina superfície sítios por KLM-1 de células de ligação, tal como avaliadas por citometria de fluxo e esferas QuantiBRITE R-PE).

análise de metilação

Avaliação do estado de metilação de uma região no site do promotor do gene mesothelin foi feito por EpigenDx (Hopkinton, MA). modificação bissulfito foi executado usando o kit Zymo Research EZ metilação Gold. O ADN genómico (500 ng) foi utilizado para a modificação com bissulfito, seguido de amplificação por PCR usando Hot Star Taq polimerase (Qiagen). Pyrosequencing foi realizada utilizando o HS 96 pyrosequencing Sistema PSQ (Qiagen). A região analisada foi escolhido com base em iniciadores disponíveis (ADS2475-RS1 e RS2-ADS2475) em EpigenDx, que cobria uma região de 147 pb a montante do local de início da transcrição mesotelina (chr16: 808890-808742; ENST00000563941). A metilação quantificação foi realizada com o software PyroQCpG, que calcula para cada um de CpG a razão entre a sua forma metilado e não metilado, o que resulta na percentagem média de grau de metilação.

transfecção mesothelin em KLM-1-R

células KLM-1-R foram transfectadas por Lipofectamina (Invitrogen) com pcDNA3.1 de controlo (+) (Invitrogen) ou pMH107, um vector pcDNA3.1 (+) com o ADNc de comprimento completo mesotelina e Geneticina marcador seleccionável quanto [27]. As células foram transfectadas durante três dias, seleccionado com 6 ug /mL de geneticina, e mantidas em meio RPMI normal com 3 ug /mL de geneticina. uma única célula de triagem com um FACSVantage SE (BD Biosciences) e subsequente expansão subsequente resultou na linha celular monoclonal KLM-1-R-

MSLN

que altamente e homogeneamente expressa mesothelin em sua superfície.

induzida por toxina ADP-ribosilação de EF-2

As células foram lisadas em tampão RIPA, com inibidores de protease (Roche Applied Science), e 3 ug de lisado celular foi incubado com tampão de ADP-ribosilação [20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), EDTA 1 mM, e 50 mM de DTT], 5 pM 6-Biotina-17-NAD (Trevigen) e 10 ng de RG7787 para vários pontos de tempo a 25 ° C. As amostras foram sujeitas a SDS /PAGE seguida por transferência de Western com estreptavidina conjugada com HRP (Invitrogen) para detectar a biotina ADP-ribosylated EF-2.

Western blot

As células foram colhidas, lavadas com D- PBS, e solubilizado em tampão RIPA com inibidores da protease (Roche Applied Science). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um estojo Coomassie Plus (Pierce). Quantidades iguais de proteína foram carregadas numa NuPAGE 4% -12% de gel de Bis-Tris (Invitrogen) para SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Invitrogen). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: de ratinho anti-MN (Rockland), de coelho anti-EF-2 # ab33208 (Abcam) e rato-anti-actina β # 8226 (Abcam). anticorpos secundários rato conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology) foram visualizados com ECL ou ECL Além disso substratos (GE Healthcare). 2 EF-os níveis de proteína foram quantificados e ajustado para β-actina com imagem J [28].

RNA sequenciação profunda e análise de dados

O RNA total foi extraído de KLM-1 e KLM-1 -R células utilizando digestão Qiagen RNeasy kit, e na coluna de ADN (Qiagen) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Após o controlo de qualidade de ARN com um Agilent Bioanalyzer, as amostras de RNA total foram enviados para a construção da biblioteca e a sequenciação de profundidade para a instalação de núcleo NCI (Bethesda, MD). As sequências brutos foram de qualidade controlada e alinhadas com RefSeq [29]. contagens brutas foram normalizados e carregado em v_3.0 Qlucore omics Explorer (35) para análise de expressão diferencial. A aplicação do filtro variância de Qlucore, uma lista dos 989 genes mais significativamente alterados foi gerado qual nos separamos em genes para cima e para baixo-regulados.

Gene Set Análise de Enriquecimento

(GSEA) O alinhamento foi realizado a partir de dentro Qlucore. Para o alinhamento de Gene ontologia (GO), Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) – e Reactome-vias, a lista gene para cima e para baixo-regulado foi carregado na string-db.org [30] e p-valores para conjuntos de dados com mudanças significativas foram extraídos.

a análise estatística

Os experimentos foram tipicamente realizadas de forma independente, pelo menos, duas vezes, e representativos ou médios dados são exibidos. Os dados são apresentados como média ± erro padrão de medição das experiências em replicado. Estatística Aplicada incluem testes t Student ou ANOVA de uma via com vários testes de comparação de Tukey. Análise e estatística figura elaboração foi realizada utilizando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.). A

p

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, salvo indicação contrária.

Resultados

células KLM-1 isolados depois SS1-LR-GGS de incubação são resistentes a Rits anti-mesothelin

Tal como descrito na secção de Métodos, as células KLM-1 foram intermitentemente exposta com SS1-LR-GGS e células sobreviventes (KLM-1-R) foram expandidas em meio RIT-free. células KLM-1 e KLM-1-R foram indistinguíveis por microscopia de campo brilhante (S2A Fig.) e em citometria de fluxo, dispersão frontal e lateral, indicando um tamanho de célula semelhante e granularidade (S2B Fig.). A proliferação celular foi comparada semeando 1 X 10

5 células no dia 0, e contando as células viáveis ​​ao dia durante 6 dias. células KLM-1-R cresceram significativamente mais rápido do que as células KLM-1 a partir do dia 2 de (

p Art 0,0001) (S2C Fig.). Para avaliar o nível de resistência, KLM-1 e KLM-1-R células foram incubadas durante 72 horas com anti-rits mesothelin. ensaios de viabilidade de ATP mostrou que as células KLM-1 foram sensíveis a SS1-LR-GGS (IC

50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) e RG7787 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml), de acordo com achados anteriores [19]. Em contraste, as células KLM-1-R foram altamente resistentes a ambos os rits (IC

50 1 ug /ml) (Fig. 1A) e SS1P (dados não mostrados). Em células resistentes, houve uma pequena diminuição na proliferação de células RIT em concentrações acima de 100 ng /ml. Como controlo, testou-se a actividade de LMB-2, um anticorpo anti-CD25 RIT [31], que não se liga a células KLM-1, e observou-se uma diminuição não-específica a 1 ug /ml LMB-2. Isto indica que a diminuição a 1 ug /ml em RG7787 KLM-1-R pode ser atribuída a absorção não específica (Fig. 1A). A resistência estabelecida era estável; nenhuma alteração foi observada quando as células KLM-1-R foram em cultura RIT-livre durante vários meses (dados não mostrados). Porque os ensaios de ATP não é possível diferenciar entre a paragem do crescimento celular e a morte celular [32], avaliou-se a resposta com o kit de Anexina V-PE de detecção da apoptose. Em contraste com a KLM-1 (

P

0,0001), células KLM-1-R não mostrou nenhuma ou apoptose limitada quando tratada durante 72 horas com 100 ng /ml (

p = 0,33

) ou 1 ug /ml RG7787 (

P

= 0,02), em comparação com células não tratadas (Fig. 1B). Estes dados confirmam que as células KLM-1-R são altamente resistentes à actividade de morte celular de anti-rits mesothelin

A:. Células resistentes KLM-1 (KLM-1-R) KLM-1 e foram incubadas durante 72 horas com o anti-mesothelin SS1-LR-GGS, RG7787 ou anti-CD25 LMB-2 como um controle. A inibição do crescimento foi avaliada com um ensaio de viabilidade celular de ATP. Com IC

50s abaixo de 10 ng /ml, KLM-1 é sensível às rits anti-mesothelin, o que não é o caso para a KLM-1-R (IC

50 1 ug /ml). 1 ug /ml LMB-2 diminuiu a viabilidade celular, indicando que esta concentração RIT induz a absorção não específica. B: células KLM-1 e KLM-1-R foram incubadas durante 72 horas com 100 ou 1000 ng /ml RG7787. A apoptose foi avaliada com a Anexina V-PE Apoptosis Detection Kit I. RG7787 induz um aumento significativo em células apoptóticas KLM-1, enquanto que as células KLM-1-R mostra nenhum aumento significativo na apoptose. C: células KLM-1 e KLM-1-R foram incubadas durante 72 horas com HB21 (Fv) -PE40. A inibição do crescimento foi avaliada com um ensaio de viabilidade celular de ATP. Ambas as linhas celulares são altamente sensíveis a esta RIT.

Resistência em células KLM-1-R é específico para Rits anti-mesothelin

Para avaliar se a resistência na KLM-1- R também se aplica a rits dirigidas contra outros receptores em células KLM-1-R, testou-HB21 (Fv) -PE40 que tem como alvo CD71 [33]. CD71 é expresso à superfície a um nível igualmente elevado em KLM-1 e KLM-1-R (dados não mostrados), e ambas as linhas celulares tinham uma sensibilidade semelhante à HB21 (Fv) -PE40 após uma incubação de 72 horas (Fig. 1C). Para avaliar a sensibilidade a outros agentes terapêuticos, as células também foram tratadas durante 72 horas com paclitaxel, um inibidor mitótico, e gemcitabina, um análogo de nucleósido. ensaios de viabilidade mostrou nenhuma diferença na sensibilidade entre a paclitaxel KLM-1 e KLM-1-R (IC

50 KLM-1 = 3,0 ± 1,6 ng /mL vs IC

50 KLM-1-R = 3,7 ± 1,7 ng /ml) (

p

= 0,80). KLM-1-R (IC

50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) era 3 vezes menos sensível a gemcitabina que KLM-1 (IC

50 = 15,2 ± 1,9 ng /mL) (

P

= 0,04), que é muito menos pronunciada do que a resistência à RG7787. Estes resultados mostram que a resistência na KLM-1-R não é geral e, portanto, específico para Rits anti-mesothelin.

expressão mesothelin e absorção RG7787 é diminuído em KLM-1-R

A primeiro passo no mecanismo de acção está RIT de ligação ao antigénio de superfície da célula alvo, seguido por internalização RIT. expressão na superfície mesotelina, como avaliado por citometria de fluxo, foi de 4,9 ± 0,5 vezes inferior em KLM-1-R (12 x 10

3 locais por célula) em comparação com a KLM-1 (60 x 10

3 sítios por célula) (Fig. 2A). A citometria de fluxo mostrou uma população homogénea de células KLM-1-R, sugerindo uma diminuição uniforme na expressão de superfície mesotelina. Análise das células A431 mesothelin-negativa e a utilização de um controlo de anticorpo de isotipo confirmou que o sinal em células mesotelina KLM-1-R era específica. Como esperado, as transferências Western mostrou que as células KLM-1 continha uma banda principal de mesotelina madura a 37 kDa e uma banda mais fraca a precursora de 72 kDa. As células resistentes com pequenas quantidades de mesotelina madura, mas o precursor não foi detectado, provavelmente devido à sua fraca abundância (Fig. 2B). Excesso de derramamento de mesothelin na KLM-1-R poderia ser responsável por níveis baixos de superfície mesothelin. Usando o Meso Scale Ensaio, descobrimos que mesothelin derramado foi de 4,8 ± 0,03 vezes menor nos meios de comunicação da KLM-1-R (40,7 ± 5,3 pg /10

5 células) em comparação com a KLM-1 (149,0 ± 23,4 pg /10

5 células). No meio sem células (controlo negativo), não foi detectada nenhuma mesotelina. Estes dados são consistentes com a diferença dos níveis de superfície e indicam que a baixa mesotelina na KLM-1-R não é devido a um aumento da excreção. Para determinar se a diminuição mesotelina era devido a uma menor ARNm, foi realizada RT-PCR e verificou que ARN mesotelina foi de 7,3 ± 4,3 vezes inferior em KLM-1-R (C

T = 24,1 ± 0,09) em comparação com a KLM-1 (C

T = 21,54 ± 0,73). Para avaliar se o mesothelin permanecendo na superfície da KLM-1-R podia ligar e internalizar Rits anti-mesothelin, foi avaliada a internalização celular de RG7787-Alexa647. A captação KLM-1-R aumentou ao longo do tempo, mas foi significativamente menor do que KLM-1 em cada ponto de tempo (4 a 5 vezes,

P

0,01). Após 150 minutos de incubação, por exemplo, 1-KLM internalizado cerca de 40 x 10

moléculas RG7787 3, em comparação com apenas 8 x 10

3 em KLM-1-R (Fig. 2C). Estes dados demonstram que as células KLM-1-R tem uma regulação negativa parcial no mesotelina e, por conseguinte, internalizar significativamente menos RG7787, proporcionando uma explicação para o potencial de resistência observado

A:. Mesothelin níveis de superfície são 5 vezes mais baixa em resistente KLM-1 (KLM-1-R) comparado a KLM-1. mesothelin expressão de KLM-1, KLM-1-R e células A431 mesothelin-negativos (controlo negativo) foram avaliadas utilizando citometria de fluxo. histogramas cheias são controles de anticorpos secundários. B: nível de proteína mesotelina inteiro é diminuída em KLM-1-R. Precursor (72 kDa) e mesothelin madura clivada (37 kDa) estavam presentes em KLM-1. Em KLM-1-R, a parte clivada foi detectada em níveis baixos. Os níveis de proteína não tratada foram sondadas em KLM-1 e KLM-1-R ligado de células por Western Blot. p-actina actua como controlo de carga. C: Em cada ponto de tempo, a absorção celular de RG7787-Alexa647 em KLM-1 é significativamente mais elevada do que em KLM-1-R, e significativamente menor do que em KLM-1-R-

MSLN

(transfectadas com mesotelina ). A absorção foi avaliada a 30, 75 e 150 min. A média intensidades de fluorescência GEOMEAN convertido em quantidade de moléculas RG7787.

AZA parcialmente restaura a expressão de superfície mesothelin na KLM-1-R com efeito limitado sobre a sensibilidade à RG7787

expressão

mesothelin pode ser silenciado por metilação do ADN de locais CpG na sua região promotora [34-37]. AZA, um inibidor da DNA metiltransferase, pode reverter a possuem. Demos células 500 nM AZA por dia durante 3 semanas, e descobriu que a expressão mesotelina foi aumentada em KLM-1-R (KLM-1-R-AZA) em cerca de 3 vezes, até 34 x 10

3 sítios por celular, que é muito menos do que os 60 x 10

3 locais por célula em KLM-1 (Fig. 3A). AZA melhorou a sensibilidade à RG7787 em KLM-1 e KLM-1-R, embora este último permaneceram altamente resistentes após uma incubação de 72 horas (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml) (Fig. 3B). Estes dados vincular mesothelin infra-regulação para hipermetilação

A:. AZA leva a um aumento de 2,8 vezes da expressão de superfície mesothelin em resistente KLM-1 (KLM-1-R). A citometria de fluxo histograma da KLM-1, KLM-1-R, e KLM-1-R-aza. histogramas cheios representam controles de anticorpos secundários. B: Três semanas de incubação com AZA, um inibidor da metiltransferase de ADN, aumenta a sensibilidade à RG7787. KLM-1, KLM-1-R, e as células tratadas com AZA (KLM-1-aza-KLM e 1-R-AZA) foram tratadas durante 72 horas com RG7787. A inibição do crescimento foi avaliada com um ensaio de viabilidade celular de ATP. As linhas pontilhadas representam células tratadas com AZA. C: CpG em uma região a montante do local de início da transcrição mesotelina são mais metilado em KLM-1-R do que em KLM-1. Três semanas de incubação com AZA diminui metilação em células KLM-1-R. A região analisada está localizado na chr16: 808.890-808.742 e se estende por 147 pb e sete CpGs. D: transfecção mesothelin em KLM-1-R resulta em sobre-expressão significativa de mesotelina comparação com KLM-1 (5 vezes) e KLM-1-R (23 vezes). A citometria de fluxo em níveis mesothelin superfície KLM-1, KLM-1-R e as células resistentes transfectadas com mesothelin (KLM-1-R-

MSLN

). E: superexpressão mesothelin em KLM-1-R restaura a sensibilidade a RG7787. KLM-1 e KLM-1-R-

MSLN

células foram incubadas durante 72 horas com RG7787. A inibição do crescimento foi avaliada com um ensaio de viabilidade celular ATP.

CpGs na região promotora mesothelin são hipermetilado na KLM-1-R

Para confirmar que o gene mesothelin é realmente sujeitos a hipermetilação na KLM-1-R, foi realizada uma análise exploratória do estado de metilação de sete CpGs na região promotora mesothelin (chr16:. 808.890-808.742, S3 Fig), utilizando sequenciamento bissulfito. Esta região de 147 pb local foi escolhido com base nos iniciadores disponíveis no EpigenDx. Os resultados demonstraram que estas CpGs tinha uma metilação significativamente maior em KLM-1-R (59 ± 3,6%) em comparação com a KLM-1 (41 ± 4,8%) (

P

0,05) (Fig. 3C) . O tratamento com AZA trazido os níveis de metilação em KLM-1-R de volta para aqueles de KLM-1 (P 0,05). Estes dados suportam ainda mais que a regulação negativa mesotelina em KLM-1-R está associado com a hipermetilação do gene mesotelina.

A sobre-expressão de mesotelina em KLM-1-R restaura a sensibilidade a RG7787

Para restaurar mesotelina expressão na KLM-1-R, introduzimos full-length mesothelin cDNA (KLM-1-R-

MSLN

). Superfície de expressão mesotelina KLM-1-R-

MSLN

foi de 22,6 ± 5,3 vezes maior do que a de KLM-1-R, e excedeu a expressão original em KLM-1 5,3 ± 1,3 vezes, resultando em cerca de 300 x 10

3 locais por célula (Fig. 3D). Como consequência, a absorção de RG7787-Alexa647 em KLM-1-R-

MSLN

em cada ponto de tempo foi significativamente maior do que em KLM-1 (5 a 10 vezes,

p

0,05) e KLM-1-R (24 a 46 vezes,

P

. 0,001) (Figura 2C). Após uma incubação de 72 horas, tinha um IC RG7787 semelhante

50 em KLM-1-R-

MSLN

(4,49 ± 1,11 ng /ml) como no KLM-1 (4,41 ± 0,38 ng /ml) (

p

= 0,80). No entanto, a KLM-1-R-

MSLN

foi mais sensível do que KLM-1 em concentrações mais elevadas RG7787, com a viabilidade celular decrescente para zero a 100 ng /ml (Fig. 3E). Introdução de controlo pcDNA3.1 (+) não teve efeito sobre os níveis de mesothelin ou resistência à RG7787 (dados não mostrados). Estes dados confirmam que a resistência em KLM-1-R está associado a uma diminuição no mesotelina. A fim de alcançar um nível similar de sensibilidade para RG7787 visto na KLM-1, 1-KLM-R requer níveis mesothelin significativamente maiores do que KLM-1. Esta constatação sugere que a resistência pode também ser ligada a tráfico ineficiente de RG7787 para o citosol, ou que a inibição da síntese de proteínas é afectada em KLM-1-R.

inibição da síntese de proteínas por RG7787 é limitado em KLM-1- R, EF-2 ribosilação de ADP está intacta

inibição da síntese de proteínas é iniciada após os trânsitos da toxina a partir da superfície da célula para o citossol e inactiva o EF-2 pela ADP-ribosilação. células KLM-1 foram incubadas com RG7787 durante 16 horas, e KLM-1-R células durante 16 e 48 horas, após o que a síntese de proteína foi examinada pela medida [

3H] leucina incorporação (Fig. 4A). Após 16 horas, RG7787 induziu um decréscimo dependente da dose da síntese de proteínas em KLM-1, mas não em KLM-1-R.