Abstract

Fundo

Colorectal-cancer (CRC) a investigação tem beneficiado muito com a disponibilidade de modelos de tumores animais pequenos. CRC modelos espontâneos e quimicamente induzidos são amplamente utilizados ainda limitada na sua semelhança com a doença humana e são muitas vezes prolongada, não repetitiva com precisão, e associados a efeitos secundários inflamatórios. In situ de murino ou a implantação do tumor humano no tracto gastrointestinal de ratos é extremamente desafiador, e limitada pela variabilidade de animal para animal e complicações relacionadas com o procedimento e a mortalidade. Como resultado, em estudos frequentes CRC é implantado em locais distais, mais comumente a região subcutânea, uma abordagem que é muito limitado pela falta de meio de tumor gastrointestinal normal e tem efeitos substanciais sobre o desenvolvimento do tumor.

Objectivos

neste estudo teve como objetivo desenvolver uma ferramenta repetitivo bem tolerado para estudar CRC em pequenos animais, adaptando o sistema de colonoscopia murino para servir como uma plataforma para sub-mucosa implantação ortotópica colônica de células tumorais CRC humanos e de murino.

resultados

Nós relatamos o estabelecimento de um modelo CRC pequenos animais romance que é minimamente invasivo, rápido, bem tolerada, altamente reprodutível, e confere um controle preciso do número de tumor, localização e crescimento taxa. Além disso, mostramos que este modelo permite exclusivamente a indução side-by-side de tumores manipulados geneticamente distintos, permitindo o estudo mecanicista de interação tumor e cross-talk dentro do microambiente intestinal nativa.

Conclusões

o emprego desta nova abordagem pode representar um grande avanço técnico para a

in-vivo

estudo da CRC

Citation:. Zigmond E, Halpern Z, Elinav E, Brazowski E, Jung S , Utilização de murino colonoscopia para ortotópico Implantação de câncer colorretal Varol C (2011). PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10.1371 /journal.pone.0028858

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicação: 12 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Crohn Colite Fundação da América (CCFA) (para S. J., número – 7108160101; site: www.ccfa.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

colorectal-cancer (CRC) é a segunda principal causa de mortalidade por câncer em muitos países industrializados [1]. modelos CRC em pequenos animais forneceram importantes ferramentas para investigar os mecanismos etiológicos e fisiopatológicos subjacentes de desenvolvimento CRC e para a avaliação pré-clínica de novos tratamentos disponíveis. Numerosos modelos murinos CRC foram desenvolvidos e descritos na literatura [2], [3]. As principais abordagens incluem ratinhos mutantes espontâneos que desenvolvem tumores, o tratamento com uma vasta gama de agentes carcinogénicos, com ou sem indução de inflamação crónica, e o implante ectópico ou ortotópico de células tumorais.

espontâneas estirpes de ratinho transgénico CRC imitar de perto síndromes cancerosas humanas, como câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) [4] e familiar adenomatosis polipose (FAP) [5]. Estes modelos foram provados inestimáveis ​​para o estudo dos efeitos de alterações genéticas conhecidas sobre o curso da doença. No entanto, muitos desses modelos de rato formar adenomas, principalmente no intestino delgado, e são tipicamente associados com uma taxa de crescimento lento e considerável variabilidade inter-animais [3] O Apc

estirpe Min /+ mouse foi estabelecido com base nos resultados obtidos a partir de um estudo de mutagénese linha germinal com N-etil-N-nitrosoureia combinada com a triagem fenotípica [5]. Embora este modelo está associado com o aparecimento de um grande número de adenomas benignos do intestino delgado, tumores CRC desenvolver-se em menos de metade dos animais. No entanto, o tratamento destes ratos com o agente cancerígeno azoximetano (AOM) aumenta substancialmente a incidência de tumores nos dois pontos de estes ratos, e este modelo provou ser útil para estudar os efeitos dos compostos quimiopreventivos [6], [7].

modelos de ratinho CRC indutíveis, por outro lado, são geralmente baseados na utilização de vários compostos cancerígenos, tais como azoximetano (AOM), 1,2-dimetil-hidrazina (DMH) e outros [2]. Os tumores estabelecidos induzido quimicamente compartilham muitas das características histopatológicas do CRC humana não-hereditárias [2], [8]. O desenvolvimento de tumores nestes modelos tem sido relatado para estar no intervalo de 30 semanas. Notavelmente, a combinação do composto carcinogénico com inflamação crónica, tal como no caso do sulfato de OMA /dextrano de sódio modelo (DSS), tem provado para encurtar o tempo de latência observada no modelo clássico de cerca de 10 semanas e para atingir a indução de tumores principalmente no cólon distai [8], [9]. Estas vantagens, bem como a sua elevada potência, o modo simples de aplicação, ampla gama de susceptibilidades, e eficiência de custos relativa, fizeram deste modelo muito comum na pesquisa CRC, e uma excelente ferramenta de pesquisa para estudar eventos cancerígenos precoces e para avaliar o potencial terapêutico abordagens [2], [8]. No entanto, neste modelo os tumores se desenvolvem sob as influências ambientais de inflamação crónica, uma condição que imita a doença inflamatória do intestino (IBD) -associated CRC mas não o CRC humano esporádico muito mais comum. É importante ressaltar que todos CRC

in- vivo

modelos acima mencionados sofrem de uma incapacidade inerente de controlar o número de tumores e cinética de crescimento.

Vários modelos CRC murino ortotópicos foram descritos, a maioria dos quais requerem um agente abordagem para a injecção ou implantação de células de cancro no cólon ou camadas cecais [10], [11]. A complexidade do procedimento cirúrgico, trauma resultante, inflamação relacionada com o procedimento e a mortalidade, limitam severamente o valor desses sistemas para o estudo das respostas imunes anti-tumor inata e adaptativa.

Nos seres humanos, o exame endoscópico da cólon é o método mais importante para a descoberta e cuidados de acompanhamento da CRC. Recentemente,

in vivo

endoscopia murino foi desenvolvido permitindo que imagens de alta resolução do cólon em ratos vivos, e que permitam aos investigadores visualizar diretamente e marcar alterações do tecido patológico no cólon [12], [13] e no intra -abdominal órgãos [14]. Além disso intervenções como biópsias repetíveis de lesões no cólon em camundongos vivos durante o período de acompanhamento de uma experiência e sua posterior análise proteômica introduziram novas ferramentas poderosas para a investigação CRC [15].

Nós apresentamos aqui pela primeira vez uma adaptação do sistema de colonoscopia murino e seu emprego para o estabelecimento de um novo modelo de camundongo ortotópico de CRC. Esta abordagem fornece uma solução fácil e simples para as limitações técnicas associadas aos modelos CRC existentes.

Resultados

Estabelecimento de modelo de camundongo ortotópico de CRC utilizando o sistema de colonoscopia murino

Pequeno endoscopia animal é considerado hoje como a ferramenta padrão-ouro para a vigilância de doenças inflamatórias do cólon e CRC. A fim de adaptar este sistema com a finalidade de implante ortotópico de células tumorais de CRC na sub-mucosa do cólon que foram especialmente concebidos de uma agulha hipodérmica, que pode passar através da bainha do canal de trabalho do sistema endoscópico de Karl Storz miniendoscopic Coloview. As agulhas hipodérmicas foram feitos de acordo com nossa especificação pela Cadence Inc. USA, e são feitos de aço longo e flexível de 8 polegadas inoxidável flexível, com diâmetros externos de 30 calibre, e um bisel curto em um anjo de 45 graus (figura S1). Esta agulha hipodérmica confere várias vantagens de design; o aço flexível em conjunto com as dimensões da agulha aliviar a manobra de injecção e permitir a passagem suave através do canal de trabalho e o bloqueio Luer, que é enroscada sobre ele para evitar fugas de ar. Além disso, o bisel permite romba injecção na sub-mucosa, com o risco reduzido para a perfuração ou o derramamento do material injectado para o lúmen. Em primeiro lugar, examinou a distribuição do tecido de reagentes injectados e avaliou o volume de injeção adequada através da injeção de corante marcação nanquim para a camada de sub-mucosa do cólon. Um volume de injecção de 50 ul deu a melhor combinação de fuga mínima e espalhamento focal da tinta por baixo da camada epitelial (Figura 1A). Rubor da lúmen do cólon através da aplicação de solução salina através da bainha exame do endoscópio confirmou a localização da tinta injectada por baixo da camada epitelial (Filme S1). A análise histológica confirmou que a tinta da Índia é mantida dentro da lâmina própria do cólon até 5 dias após a sua injeção ortotópico (Figura S2A). Mais importante, a análise histológica dos ratos injectados com solução estéril de Dulbecco Salina Tamponada com Fosfato sem cálcio e sem magnésio (PBS

– /-) revelaram uma arquitectura colónica normal e saudável no local da injecção, confirmando que este método é minimamente invasiva (Figura S2B)

(a) imagem colonoscopia apresentando injecção sub-mucosa do cólon de corante India de tinta em C57BL /6 do mouse para a avaliação do volume de injeção apropriado e sua distribuição na lâmina própria do cólon. (B) imagens colonoscopia representativos que indiquem o desenvolvimento progressivo do tumor CRC dentro do mesmo C57BL 6 mouse /após o implante ortotópico de 1 × 10

5 células MC38 CRC de dia 5, através de dia 12 a dia 19. (C-D) imagem representativa do espécime histológicos corados com hematoxilina e eosina (H e) e isolado a partir do cólon local da injecção no dia 14 após a injecção de 1 × 10

5 células MC38 CRC. Ampliações: C- [X40], D – [x 100]. Note-se a área de fronteira entre o tumor e a mucosa normal adjacente e a projecção do tumor através da camada epitelial para o lúmen. (E) Imagem representativa mostrando H E de coloração histológicos espécime de tumor murino-CRC gerados 5 dias após o implante ortotópico de células tumorais MC38 CRC em ratinhos C57BL /6 (ampliação de 40X). (F) imagem que mostra GFP rotulados células tumorais microscópicos fluorescentes e sua difusão através da camada epitelial em direção ao lúmen (Ampliação x100). Os dados são representativos de três experiências independentes.

O tumor do cólon de murino MC-38 é um adenocarcinoma de grau III, que foi quimicamente induzida em murganhos C57BL uma fêmea 6 do rato /e utilizada, desde então, como um tumor transplantáveis ​​rato modelo [16]. Para testar a viabilidade do método de implantação do tumor ortotópico, que injectado 1 × 10

5 células tumorais MC38 CRC na sub-mucosa do cólon de singeneicos C57BL /6. colonoscopia repetitiva de murganhos receptores revelou o rápido desenvolvimento progressivo do tumor invadir o lúmen do intestino especificamente no local da injecção. graduação endoscópica de acordo com o tamanho do tumor relativamente à circunferência do cólon, tal como estabelecido por Becker et al [12], revelaram um crescimento tumoral progressivo de grau 1 no dia 5 de grau 4 por dia 12 e atingindo o grau 5, ocupando a quase totalidade do cólon circunferência, por único dia 19 (Figura 1B e filme S2). Hematoxilina e eosina (H E) de coloração de secções histológicas revelaram uma arquitectura típica de CRC dos tumores com mucosa normal adjacente e a projecção do tumor através da camada epitelial para o lúmen (Figura 1C, D). A análise histológica de tecido do cólon isolado de ratos submetidos a implante ortotópico de 1 × 10

5 células de CRC MC38 que expressam GFP confirmados o estabelecimento de um tumor pequeno dentro da lâmina e a penetração de tumor derivado da GFP

+ células através da camada epitelial já de dia 5 (Figura 1E, F). Usando este método, nós também foram capazes de induzir eficientemente a formação de tumores CRC humanos através da implantação de os humanos linhas celulares de CRC SW620, SW480, LS174T e HT-29 em ratinhos nus ou NOD /SCID receptores imunodeficientes (Figura S3A). avaliação patológica de tumores humanos CRC ortotopicamente estabelecida usando este modelo confirmaram alta semelhança com tumores CRC isolados de pacientes humanos (Figura S3B). Especificamente, os tumores CRC humanos formados pela implantação ortotópico de células LS174T e HT29 mostrou histológica traços característicos de adenocarcinoma diferenciado do cólon tais como estruturas glandulares alinhadas com epitélio neoplásico contendo células caliciformes e material necrótico luminal, enquanto o SW620 células CRC humanos formada uma morfologia do tumor típico de mal ao carcinoma indiferenciado com padrões aninhados e difusos e falta de formação tubular (Figura S3B). Interessantemente, ambas as linhas celulares HT29 e LS174T humanos CRC foram formados a partir de um adenocarcinoma primário do cólon, enquanto o SW620 foi estabelecida a partir de uma metástase de nó de linfa.

A fim de avaliar a cinética de crescimento dos tumores CRC utilizando este método que injetada camundongos C57BL /6 com quantidades distintas de células MC38 (células 10e3, 10e4 e 10E5) e seguiu a circunferência do cólon e grau de desenvolvimento de tumores estabelecidos ao longo do tempo por colonoscopia (Figura 2A). Os resultados graficamente resumidos na Figura 2B mostra que a cinética de crescimento do tumor estava em correlação directa com a quantidade de células injectadas atingindo circunferência do cólon de 21% (+/- 4,22), 54,1% (+/- 7,0), e 80% (+ /-7.2) 3 semanas após a injecção de 10

3, 10

4 e

células 5 MC38 10, respectivamente. A análise estatística comparando cada ponto de tempo (1,2 e 3 semanas) para os diferentes grupos (10e3, 10e4 e células 10E5) confirmou diferenças significativas (pelo menos p 0,05) em todos os pontos de tempo para a percentagem da circunferência do cólon, bem como para o grau do tumor. Excepcional foi a comparação do grau do tumor entre o 10E4 . Grupos 10E5 na semana 3, tal como a maior parte dos tumores nesses grupos já foram de grau 5, que inclui todos os tumores acima de 50% da circunferência do cólon

(A) representativas colonoscopia imagens que demonstram a correlação entre a quantidade de células tumorais MC38 injectados e o tamanho dos tumores estabelecidos CRC 3 semanas após a implantação de células tumorais ortotópico. (B) Os gráficos que resumem a cinética de crescimento, percentuais circunferência e grau de desenvolvimento do tumor do cólon em correlação com a quantidade de células MC38 CRC injetadas. Observe o rápido estabelecimento de grau 5 tumores já 2 semanas após a implantação de apenas 1 × 10

5 células MC38-CRC. Cada grupo consistiu de 5 ratos.

Coletivamente, nós estabelecemos aqui um novo método para a implantação ortotópica eficiente dos tumores CRC usando endoscopia murino de forma invasiva rápida e minimalista, com uma quantidade limitada de células exigida para injecção, e com um controle absoluto sobre o tumor de incidência, localização e crescimento cinética.

implante ortotópico de células CRC-tumorais geneticamente manipulados

um dos benefícios da implantação do câncer sobre os modelos de tumor em desenvolvimento espontâneos é a capacidade de modificar geneticamente a tumor estabelecido. Como prova de princípio, que injetaram em ratos BALB /c com 1 × 10

5 CT26 células CRC murino, que já havia sido manipuladas geneticamente para expressar luciferase. Total das bioluminescência corpo de imagiologia óptica (Biospace Photon Imager) revelou a existência de um tumor CRC especificamente em torno do local de injecção que poderia estar mais semi-quantificados de acordo com a sua luminescência emitida (Figura 3A). Notavelmente, esta abordagem pode ser útil para a avaliação da carga de tumor, sem a necessidade de sacrificar os ratinhos. Uma verdadeira vantagem adicional do modelo de implantação endoscópica é a capacidade de implantar vários tumores ainda distintas adjacentes no mesmo rato, que foram geneticamente modificados para sobre-expressas ou silenciar genes de interesse, permitindo a sua comparação direta em um ambiente de acolhimento idênticas. Usando um sistema repórter de lentivírus, que transduzidas dois genes repórter fluorescentes distintos na linha de células MC38 para estabelecer o MC38-GFP e linhas MC38-RFP (Figura 3B painel superior esquerdo). A injecção de células MC38-GFP e adjacentes a elas as células MC38-RFP resultou na co-formação de dois tumores geneticamente idênticas que variam apenas pela sua localização e a expressão dos genes repórter inserido (Figura 3B painel e o painel direito inferior esquerdo) .

imagem representativa de corpo inteiro bioluminescência imageamento óptico de camundongos BALB /c (A) com código de cores 2 semanas após a injeção sub-mucosa do PBS

– /- (mouse esquerda) ou 1 × 10

5 células tumorais CT26 CRC expressando luciferase e 10 minutos após a injeção ip de D-luciferina. Note-se a emissão de luminescência especificamente a partir da área das células de tumor injectadas CRC (ratinho da direita). (B) superior do painel à esquerda – imagem estéreo-microscópio fluorescente sobrepostos em uma imagem gráfica foto de receptor C57BL /6 do cólon do rato 3 semanas após a sua injeção ortotópico com células MC38 CRC que foram geneticamente manipulados pelo sistema repórter lentiviral expressar RFP, x10 ampliação. painel para baixo à esquerda – imagem colonoscopia de C57BL cólon /6 rato após implante ortotópico de 2 células tumorais MC38 CRC adjacentes; MC38-RFP (seta vermelha) e MC38-GFP (seta verde). Painel direito – imagem estéreo-microscópio fluorescente sobrepostos em uma imagem gráfica foto de receptor C57BL /6 do mouse abriu cólon 2 semanas seguintes side-by-side injeção ortotópico de MC38-RFP (distal) e células tumorais CRC (proximais) MC38-GFP, X10 ampliação. Note-se a indução de tumores CRC 2 adjacentes, que diferem apenas por a expressão do gene repórter transduzidas. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Discussão

Nós descrevemos aqui um romance ortotópico modelo CRC murino baseado na adaptação do sistema miniendoscopy disponível comercialmente que confere muitas vantagens em comparação com conhecidos CRC modelos murinos. É um fácil de empregar, minimamente invasiva, e um procedimento altamente reprodutível que pode ser usado em ratos a partir de qualquer fundo genético. Neste modelo, tanto CRC-tumores murinos e humanos pode ser induzida. O modelo permite também o controle preciso da incidência de tumores e localização no interior do cólon. Além disso, este método permite um controlo absoluto sobre a cinética do crescimento do tumor; ela pode ser muito rápida grau atingindo 5 em 2 semanas após a implantação de apenas 1 × 10

5 células de tumor, ou pode-se retardar para baixo através da injecção de número de células. É importante ressaltar que esta abordagem evita danos colaterais e inflamação visto em muitos dos outros modelos atualmente empregados. Além disso, ele permite excepcionalmente a indução de CRC-tumores geneticamente manipuladas e a comparação de vários tumores distintos lado-a-lado estabelecidos no mesmo rato evitando a variabilidade inter-animal.

implantação subcutânea ectópica de linhas celulares tumorais é amplamente utilizado como uma ferramenta de investigação, especialmente para a avaliação das intervenções terapêuticas citostáticos [17]. No entanto, o implante ectópico ignora a complexidade da composição característica única do microambiente nativa. De facto, tem sido bem estabelecido que o estroma hospedeiro incongruente pode afectar a tumorigenicidade e regulação do ciclo celular em comparação com o implante no leito do tecido nativo [18], [19]. A vantagem de escolher uma abordagem ortotópico é de particular importância para o meio intestinal, que é a casa de entidades moleculares e celulares imunológicos únicas que reside na contínua interação com a microbiota ea exposição constitutiva aos antígenos alimentares.

Desempenho de mais de 200 implantes CRC ortotópicos utilizando este método tem assegurado que este modelo é bem tolerada e altamente reprodutível. No entanto, uma complicação possível do processo é a perfuração do cólon e, potencialmente, o vazamento de ar e células para a cavidade peritoneal. Atualmente, em nossas mãos, esta complicação é rara, constituindo menos de 5 por cento de todos os procedimentos. A mortalidade durante o procedimento é extremamente raro e pode acontecer devido à anestesia ou perfuração. a incidência de tumores em ratinhos sobreviventes (95%) é 100%, sempre culminando num desenvolvimento do tumor único especificamente no local da injecção. É de notar que o uso de um âmbito de aplicação rígida permite o acesso apenas à metade distai do cólon e, assim, restringe o implante ortotópico, por esta abordagem a esta área.

CRC ainda é a segunda causa principal de mortalidade por cancro nas muitos países industrializados. Experiências feitas em pequenos animais têm provado ser essencial para a compreensão da patofisiologia da doença, bem como para a avaliação pré-clínica de novos tratamentos. No entanto, os modelos murinos de CRC são limitados na sua semelhança com a doença humana. Isto é especialmente verdadeiro com respeito à formação de metástases tumorais CRC. Uma desvantagem notável de modelos murinos CRC é a falta geral de fenótipo invasivo e metastático [2]. No modelo /DSS AOM cabos infiltrativa de células epiteliais foram descritas para quebrar a mucosa muscular e alcançar também o sistema linfático sub-mucosa, embora muito raro [20]. Da mesma forma, nós raramente testemunhar invasão local de células derivadas de tumores, mas nunca detectar metástases distantes usando nossa abordagem. A cinética de crescimento relativamente rápido associados com o nosso modelo, que coage o sacrifício precoce de camundongos implantados cuidam um tumor grau 5 CRC, é, provavelmente, tornar-se uma desvantagem para a indução de um tumor metastático. Com efeito, mesmo implante ortotópico de células de CRC humanos, conhecido por ser agressivamente metastático, falharam na indução de um tumor metastático. O obstáculo comum compartilhada por modelos CRC murino para estabelecer um tumor metastático pode implicar que o meio murino intestinal não é favorável à formação de metástases. No entanto, isso pode ser transformar em um sistema modelo desejado para aqueles que desejam para investigar o papel potencial dos genes malignas. Em apoio a este, o nosso sistema pode ser utilizado para induzir a formação de tumores manipulados geneticamente em que nós genes sobre-expressos ou o silêncio de interesse.

Acreditamos que este novo modelo CRC ortotópico representa um grande avanço técnico para

in vivo

estudo da CRC, e pode ser particularmente utilizadas para investigar novas modalidades terapêuticas, genética do tumor e os mecanismos de crescimento, e suas interações no contexto do microambiente intestinal nativa.

Métodos

Ética Declaração

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo comité de ética centro Sourasky Medical Tel Aviv para estudos com animais e conformado com os mais altos padrões internacionais de cuidado humano de animais em pesquisa biomédica. Comitê número de aprovação -. 037_b3428_8

Animais

8-10 machos semanas de idade C57BL /6, Balb C e ratos nus atímicos foram obtidos de Harlan biotecnologia (Rehovot, Israel). machos NOD 8-10 semanas de idade SCID foram gentilmente cedidas pelo prof. Tsvee Lapidot (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

ratinhos nus atímicos foram sub-lethaly irradiados (450 rad) antes do implante ortotópico de linhas celulares de CRC humanos para eliminar imuno-rejeição. Os animais tiveram livre acesso a comida e água, foram alojados em temperatura e quartos umidade controlada, e foram mantidos em uma luz de 12 horas ciclo /escuro.

Colo-Rectal células tumorais

Murino C57BL /6 células tumorais CRC (MC38) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Avi Eisenthal (Tel Aviv Sourasky Medical Center). Luciferase stably- transfectadas células tumorais CRC murino (CT26) foram gentilmente cedido pelo Prof. Lea Eisenbach (Instituto de Ciência Weizmann, em Rehovot, Israel). Os tumores CRC linhagens de células humanas SW620, SW480 e LS174T foram gentilmente cedidas pelo prof. Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). A célula-line CRC humano HT-29 foi a generosa oferta do Dr. Isabel Zvibel (Tel-Aviv Sourasky Medical Center, Tel-Aviv, Israel). Todas as linhas celulares foram mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C em alto DMEM glucose no meio suplementado com: 10% de soro fetal bovino, 1% de Penicilina solução de antibiótico estreptomicina, solução de L-glutamina 1%, e 1% de sódio solução de piruvato.

Geração de células tumorais MC38 CRC expressando GFP ou

células tumorais MC38-GFP e MC38-RFP CRC RFP

foram geradas por transdução com PCSC-SP-PW-IRES-GFP /lentivírus RFP concebido para expressar GFP ou RFP com MOI de 50 (gentilmente cedido pelo Dr. Alon Chen, do Instituto de Ciência Weizmann, em Rehovot, Israel). Posteriormente, as células MC38 expressando GFP ou RFP foram classificadas para alta pureza usando uma alta velocidade FACSAria II classificador (Beckton-Dickinson).

sistema endoscópico Murino

Foi utilizado um sistema endoscópico de vídeo do mouse alta resolução ( ” sistema Coloview ”) anteriormente descrito para os procedimentos endoscópicos de murino [12] – [14], que consiste de um endoscópio miniatura (escopo diâmetro externo 1,9 milímetros), uma fonte de luz xénon, uma câmara de chip tripla, e uma bomba de ar para alcançar a inflação regulamentada do intestino do rato (Karl Storz, Tuttlingen, Alemanha). O procedimento endoscópico foi visto em um monitor a cores e digitalmente gravado na fita.

sub-mucosa do cólon implante ortotópico de células CRC

Os ratos foram anestesiados usando ketamina /xilazina. injecções sub-mucosa foram realizados usando o aço inoxidável flexível inoxidável; 8 polegadas de comprimento, 30 de calibre e 45 graus bisel agulhas hipodérmicas feitos de acordo com nossa especificação (Cadence Inc. U.S.A.). A agulha foi inserida através do bloqueio Luer (Söllner, GmbH) aparafusado no canal de trabalho do âmbito a evitar fugas de ar. Subsequentemente, o âmbito foi inserido no cólon do rato e na sequência da sua inflação da agulha foi trazida através do canal de trabalho para a frente do escopo. O procedimento de implante de células CRC foi realizada por duas pessoas coordenados; uma pessoa foi navegar na colonoscopia, enquanto que a outra pessoa estava operando a manobra de injeção. A injeção foi realizada sob observação por uma penetração sub-mucosa muito suave com o lado aberto do bisel dirigindo-se em um ângulo raso. Um volume de 50 microlitros CRC células tumorais foi então injetado na sub-mucosa do cólon.

In-vivo

imagem

Para acompanhar a implantação do tumor CT26 CRC-expressando luciferase e o crescimento em murganhos BALB /c, 50 ul de D-luciferina (30 ug /ml) foi ip injectados 10 minutos antes e, subsequentemente, os ratinhos foram inseridos na câmara escura fechado de todo o corpo da câmara CCD sistema Photon Imager arrefecida (Biospace Lab, França) . Para

in-vivo visualização

da GFP e RFP tumores positivos Leica MZ16F sistema fluorescente estereomicroscópio foi usada (Leica Microsystems, Alemanha).

Histologia

Os tecidos foram fixados em 4% paraformaldeído durante a noite a 4 ° C, embebidos em parafina, seccionados em série (15 uM), e corados com hematoxilina e eosina (Sigma).

as lâminas foram observadas utilizando um microscópio Olympus BX51 e aquisição de imagem foi realizada com o Olympus câmera DP70 e software DP-Manager.

CRC cinética do crescimento tumoral

camundongos C57BL /6 foram ortotopicamente sub-mucosa injetados com 10

3, 10

4, ou 10 células

5 MC38. circunferência do cólon do tumor eo estágio de desenvolvimento foram monitorados ao longo do tempo pela colonoscopia a cada semana durante 3 semanas após a implantação de células. graduação endoscópica foi feito de acordo com o tamanho do tumor relativamente à circunferência do cólon como estabelecido por Becker et al [12]. Em resumo, o tamanho do tumor foi classificada como segue: Grau 1 (apenas tumor detectável), Grau 2 (tumor cobrindo até 1/8 da circunferência do cólon), Grau 3 (tumor cobrindo até 1/4 da circunferência do cólon), Grau 4 (tumor cobrindo até 1/2 da circunferência do cólon) e Grau 5 (tumor cobrindo mais de 1/2 da circunferência do cólon).

Análise estatística

os resultados foram analisados ​​por one-way ANOVA e análise post com testes de comparações múltiplas de Bonferroni.

Informações de Apoio

Figura S1.

especialmente concebida agulhas hipodérmicas utilizadas para injetar ortotopicamente as células tumorais na sub-mucosa do cólon. As agulhas hipodérmicas são feitos de aço inoxidável flexível longa de 8 polegadas, com diâmetros externos de 30 calibre, e um bisel curto em um anjo de 45 graus. Note-se que a agulha é inserida através do bloqueio Luer que é subsequentemente aparafusada no canal de trabalho do endoscópio para evitar fugas de ar

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s001

(TIF)

figura S2.

injeções Sub-mucosas da PBS

– /- e nanquim. Imagens representativas de espécimes histológicos corados com hematoxilina e eosina (H E) e isolada do local da injeção do cólon no dia 5 após a injecção de 50 ul de (A) nanquim (aumento de 40X), (B) Índia tinta (x100 Ampliação), (C) PBS

– /-, observe a arquitetura normal e saudável do cólon. Os dados são representativos de três experiências independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s002

(TIF)

Figura S3. indução

ortotópico de tumores CRC humanos em ratinhos imunodeficientes. (A) Imagens representativas de espécimes histológicos corados com hematoxilina e eosina (H E) e isolados no dia 35 após a injecção ortotópica (2 × 10

5 células cada) das linhas celulares de CRC humanos: SW620, SW480, LS174T e HT29 em ratinhos nus irradiados NOD /SCID ou sub-letalmente. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) Comparação Histo-patológica entre tumores CRC humanos estabelecidos pela implantação ortotópica da SW620, HT29, e LS174T em ratinhos imunodeficientes e adenocarcinoma colorretal humano

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s003

(TIF)

filme S1.

endoscópica imagens ao vivo da injecção sub-mucosa de tinta corante Índia. imagens de vídeo endoscópica representativas mostrando o procedimento de injecção de corante Índia-tinta para o sub-mucosa do cólon de ratinhos C57BL /6 que utilizam o sistema do rato colonoscopia. Note-se a distribuição de sub-epitelial focal de corante injetada e sua restante após a lavagem do cólon

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s004

(WMV)

Filme S2.

endoscópica imagens ao vivo do crescimento localizado progressiva de uma CRC-tumor após a sua implantação ortotópica. endoscópica imagens de vídeo que mostra o implante ortotópico de células BF-tumor e o crescimento progressivo do tumor resultou, especificamente no local da injecção e em momentos diferentes dentro do mesmo recipiente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s005

(WMV)

Reconhecimentos

gostaríamos de agradecer profundamente Elinor Elmaliah para a assistência de cultura de tecidos, Michael Kaplan para pecuária, Elias Shezen para o trabalho histológico e Ido Kilemnik (Medi CEO -Tate, Israel) por sua generosa contribuição para a formulação das agulhas hipodérmicas. Gostaríamos também de agradecer ao Prof. Lea Eisenbach e Prof Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) para a linha celular CT26-luciferase murino CRC eo SW480, SW620 humanos linhas celulares de CRC LS174T, respectivamente.