Abstract
Os três ligantes de fenda e seus receptores quatro ROBO têm papéis fundamentais no desenvolvimento dos mamíferos, promovendo apoptose e repelir a migração celular aberrante.
fendas
e
ROBOs
surgiram como genes supressores de tumor candidato cuja expressão é inibida de uma variedade de tumores epiteliais. Nós demonstramos que a sua expressão pode ser regulada negativamente pelo cortisol em células lútea ovarianos normais. Testar a hipótese de que após a ovulação o cortisol produzidos localmente seria inibir
expressão ITSL /ROBO
no epitélio de superfície do ovário (OSE) para facilitar a sua reparação e que esta via de regulamentação ainda estava presente, e pode ser manipulado, em células epiteliais do ovário células cancerosas. Aqui nós examinamos a expressão e regulação da via SLIT /ROBO no OSE, células epiteliais de cancro do ovário e linhas celulares de tumores ovarianos. Basal
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
expressão foi menor em culturas primárias de epitelial de cancro do ovário células quando comparado com a OSE normais (
P
0,05) e em células SKOV-3 pobremente diferenciadas em comparação com as células mais diferenciadas, PEO-14 (
P
0,05). Cortisol reduziu a expressão de certos
fendas Comprar e
ROBOs
em células OSE normal e PEO-14 (
P Art 0,05). Além disso bloquear a actividade de fender /ROBO reduziu a apoptose em ambas as células de PEO-14 e SKOV-3 de tumor (
P
0,05). Curiosamente
ITSL /ROBO
expressão pode ser aumentada através da redução da expressão do receptor de glucocorticóides utilizando siRNA (
P
0,05). Em geral os nossos resultados indicam que, na fase pós-ovulatória um papel do cortisol pode ser para inibir temporariamente expressão SLIT /ROBO para facilitar a regeneração da OSE. Portanto, esta via pode ser um alvo para o desenvolvimento de estratégias de manipular o sistema SLIT /ROBO no cancro do ovário
Citation:. Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011) Regulamento de glicocorticóides de SLIT /ROBO tumor genes supressores no epitélio de superfície do ovário e células do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10.1371 /journal.pone.0027792
editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de abril de 2011; Aceite: 25 de outubro de 2011; Publicado: November 23, 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Dickinson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. WCD é apoiado por uma bolsa Clínica Senior Scottish do Conselho de Financiamento do escocês e este trabalho foi financiado pelo CSO (SCD /02). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a glicoproteína Slit secretado e seu receptor Robo foram originalmente identificados como importantes moléculas de orientação axônio no desenvolvimento de
Drosophila
sistema nervoso [1], [2]. O seu papel é evolutiva conservada como SLIT vertebrados (SLIT1, Slit2, SLIT3) e ROBO (ROBO1, robo2, ROBO3, Robo4) também inibem a migração neuronal aberrante [3]. No entanto a maioria dos membros dos vertebrados fenda e ROBO famílias também são expressos no exterior do sistema nervoso e têm sido associados com o desenvolvimento de uma variedade de órgãos, incluindo a glândula mamaria e dos ovários [4], [5]. Durante a organogénese a interacção ITSL /ROBO é pensado para regular numerosos processos, incluindo a proliferação celular, a apoptose, a adesão e migração de células não-neuronais [6], [7].
moléculas que têm um papel importante no desenvolvimento são frequentemente desregulado no cancro [8]. Na verdade, o
fendas
e
ROBOs Quais são candidatos genes supressores de tumor cuja expressão é reduzida em numerosos tipos de células tumorais epiteliais, principalmente através de eliminação, perda de hipermetilação heterozigosidade e promotor região [9]. Isto inclui cancros derivados de tecidos reprodutores incluindo cervical, da próstata e tumores germinais do ovário [10] – [13]. Recentes estudos funcionais, também apoiaram a teoria de que as fendas e ROBOs têm actividades supressores de tumores. A via de fender /ROBO promoveu a morte celular programada e /ou reduzida proliferação de células de carcinoma de fibrossarcoma, esofágico, hepatocelulares, colorrectais, da próstata e da mama [14] – [17]. Slit2 também inibiu a invasão de inúmeros tipos diferentes de células tumorais, incluindo aqueles a partir da próstata, da mama, do endométrio e dos ovários [13], [18], [19].
A via de fender /ROBO também foi agora mostrado ter funções fisiológicas em tecidos reprodutores normais [6]. sinalização ITSL /ROBO parece regular a angiogénese placentária e função trofoblasto de forma autócrina e /ou parácrina [20]. Além disso, a maior parte das fendas e ROBOs também são temporalmente regulados durante o ciclo menstrual normal no endométrio e são expressos na trompa de Falópio [21]. Além disso, há um aumento na expressão do
fendas
e
ROBOs
na lúteo adulto corpus durante a fase tardia-lútea do ciclo ovariano. Nesta altura, a interacção de fender /ROBO pode actuar para promover a sua desintegração por estimular a apoptose e inibir a migração de células lútea [22]. No corpo lúteo e expressão endométrio de fendas e ROBOs está regulado hormonalmente. Não foi reduzida
expressão SLIT /ROBO
no endométrio decidualizados da gravidez precoce [21]. Além disso, as moléculas luteotrófica, gonadotrofina coriónica humana [23] e cortisol [24], que são aumentados no início da gravidez, reduz a expressão de
fendas
e
ROBOs
em células lútea [22] .
Cerca de 90% das neoplasias malignas de ovário são classificados como tumores epiteliais que são pensados para derivar do epitélio ovariano de superfície (OSE) [25]. O risco de câncer de ovário é positivamente correlacionada com o número de ovulações [26]. Assim lesões recorrentes e subsequente reparação do OSE durante a ovulação pode predispor este tecido a neoplasia [27]. A ovulação é um evento inflamatório interromper o OSE, mas exigindo resolução. Este reparo é facilitada por um aumento da produção local do cortisol anti-inflamatório esteróide via aumento da regulação do 11ß-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 1 [28].
Nós a hipótese de que a OSE expressar fendas e ROBOs e que o cortisol poderia temporariamente reduzir a expressão destes genes supressores de tumores para facilitar a sobrevivência, a proliferação e a migração destas células durante o processo de reparação. Se fosse esse o caso, esta via pode ter um papel importante na progressão do cancro do ovário e se permanece activa em células malignas OSE pode oferecer estratégias terapêuticas para manipular esses genes. Por isso, investigaram a expressão, localização e regulação da via SLIT /ROBO no OSE. Nós também examinou se as fendas e ROBOs foram expressas de forma aberrante e hormonalmente regulada em células de cancro do ovário. Além disso, analisamos o significado funcional de uma perturbada via SLIT /ROBO em células de cancro do ovário.
Resultados
O caminho SLIT /ROBO é diferencialmente expressos em OSE humana, células de câncer de ovário e de células tumorais de ovário linhas
e Slit2 ROBO1 poderia ser immunolocalised ao epitélio do ovário humano normal à superfície (Fig. 1A-C). análise de RT-PCR confirmou a expressão de
Slit2
e
ROBO1
em culturas primárias de OSE e demonstrou que havia alguma expressão de
SLIT3
,
robo2
e
Robo4
nessas células (Fig. 1D). Em seguida, investigou a expressão destes genes em culturas primárias de células malignas derivadas a partir do fluido ascítico de mulheres com cancro do ovário epitelial.
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
também foram expressos nessas células, mas a análise quantitativa mostrou que eles foram reduzidos em 25-82% em comparação com culturas primárias de normais OSE (Fig 2A.) (
P Art 0,05).
a) a microscopia de luz-campo da exibição ovário específica coloração para Slit2 (marrom) no OSE. B) ROBO1 mesmo modo positivo (também foi observado) coloração marrom no OSE. C) Não se observou coloração nos controlos negativos. As barras de escala representam 100 um. D) RT-PCR para
fendas
e
ROBOs Online em mangueira culta. Com a exceção de
SLIT1
e
ROBO3
os membros do
SLIT
e
ROBO
famílias foram expressos em mangueira. FB = fetal Cérebro controlo positivo; -RT = RT controle negativo negativo.
A) PCR em tempo real quantitativa mostrando aumento
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
em culturas primárias de mangueira em comparação com células epiteliais malignos cultivadas a partir das ascite de pacientes com câncer ovariano. B) RT-PCR mostrando que ambas as linhas de células SKOV-3 e PEO-14 expresso
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
e
robo2
. C) PCR em tempo real quantitativa mostrando
Slit2
,
SLIT3
e
robo2
transcrições foram mais abundantes nos bem diferenciados células PEO-14 em comparação com o SKOV- pouco diferenciado 3 células. FB = fetal Cérebro controlo positivo; -RT = RT controle negativo negativo; – = DNA controle negativo negativo; * =
P Art 0,05; ** =
P Art 0,01; *** =
P Art 0,005
A fim de confirmar que as células malignas OSE tinha uma expressão reduzida de
fendas
e
ROBOs
examinámos a sua expressão em duas linhas celulares de tumores de ovário diferentes. A linha celular de PEO-14 é derivada de um adenocarcinoma do ovário bem diferenciado e tem semelhanças com as células epiteliais do ovário mais benignas e cancro do ovário fase precoce. Em contraste, a linha de células SKOV-3 é derivada de um adenocarcinoma de ovário pouco diferenciado e é mais característico de um tumor avançado [29]. Ambas as linhas celulares expressa
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
e
robo2
(Fig. 2B). No entanto, em paralelo com os nossos resultados na cultura de células primárias,
Slit2
,
SLIT3
e
robo2
expressão foi diminuiu entre 58% e 97% no SKOV- pouco diferenciado 3 células quando comparados às células PEO-14 bem diferenciados (Fig 2C). (
P
0,05). Embora PEO-14 e SKOV-3 de células pode ser diferente em outros aspectos, bem como o seu estado de diferenciação, estes dados sugerem que a expressão do
ITSL /ROBO
via de gene supressor de tumor pode ser reduzida durante o desenvolvimento e progressão tumoral.
bloquear a interacção de fender /ROBO diminui a apoptose em células de tumor dos ovários
o efeito da via de fender /ROBO sobre a sobrevivência das células foi investigada usando um ROBO1 recombinante /Fc quimera, que actua como um ligando armadilha para inibir a interação SLIT /ROBO e inibição direta da
Slit2
usando siRNA. Tratamento de PEO-14 e SKOV-3 células com o ROBO1 /quimera de Fc não afectou a proliferação de células (
P
0,05, dados não apresentados). Contudo, em ambos os PEO-14 e SKOV-3 células de bloqueio de acção com a ITSL ROBO1 /Fc quimera reduzida apoptose por 20-21%, conforme medido por uma caspase-3 activada /7 de ensaio (
P
0,05 ) (Fig. 3A). transfecção transitória de
Slit2
siRNA reduzida apenas
expressão Slit2
em ambas as células PEO-14 e SKOV-3. PEO-14 e Skov-3 células com reduzida
Slit2
expressão tiveram uma diminuição significativa 17-26% em caspase-3 clivada e -7 atividades (
P Art 0,05, emparelhado t- teste) (Fig. 3B). Isto sugere que uma redução na via gene ITSL /ROBO está associada com o aumento da sobrevivência das células.
A) O tratamento com o ROBO1 /quimera de Fc reduziu a actividade da caspase-3/7, quando comparado com o tratamento de PBS /0,1% (w /v) de BSA (controlo) tanto em células de PEO-14 e SKOV-3. B) Transfecção com
Slit2
siARN reduzida actividade da caspase-3/7, quando comparado com o tratamento com um ARNsi de controlo scrambled. * =
P
. 0,05
O cortisol regula negativamente a expressão de
fendas
e
ROBOs Online em OSE e uma bem diferenciados linha de células de cancro do ovário
em seguida, investigaram se a expressão da via SLIT /ROBO em células epiteliais ovarianos foi regulamentada. Em células de ovário humano lútea a via de fender /ROBO poderia ser inibida pelo cortisol f isiologicamente [22]. Como o cortisol é produzido localmente no OSE, e tem um papel anti-inflamatório após a ovulação [30], examinamos se cortisol poderia regular a expressão SLIT /ROBO no OSE.
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
expressão foi reduzida em 25-30% em cortisol ( 1000 nm) tratados culturas primárias de OSE normal (
P
. 0,05) (Fig 4A). No entanto, em culturas primárias de células epiteliais malignas cortisol não resultou em qualquer redução adicional na expressão destes genes (
P
0,05) (Figura 4B).
A) real. -time PCR quantitativa mostrando que Cortisol (1000 nM), em relação ao controle transportadora etanol, reduziu
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
expressão Robo4
em culturas primárias de mangueira. B) O cortisol não alterou a expressão de
fendas
e
ROBOs
em culturas primárias de células cancerosas epiteliais ovarianos. C)
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
e
robo2
expressão foi significativamente reduzida em Cortisol em células mais diferenciadas PEO-14. D) No entanto expressão destes
fendas Comprar e
ROBOs
não foi regulamentada pelo cortisol nas células pouco diferenciados SKOV-3. E) O cortisol reduziu os níveis de proteína segregada Slit2 nas células PEO-14 (secreção de controlo é de 0,5 ng /ml). F) O cortisol não afectou os níveis de proteína segregada Slit2 nas células SKOV-3 (secreção de controlo é de 0,5 ng /ml). * =
P Art 0,05; ** =
P
. 0,01
As linhas de células tumorais PEO-14 e SKOV-3 ovarianos também têm o potencial de responder ao tratamento cortisol como eles expressam o receptor glicocorticóide (GR). Além disso, eles expressam o receptor de mineralocorticóide (MR), mas não expressam o receptor de progesterona (PR) (Fig. 5A). Nas células mais diferenciadas PEO-14, cortisol reduzida a expressão de
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
e
robo2
por 13-31% (
P Art 0,05) (Fig. 4C). Além disso o tratamento de cortisol reduzida concentração de proteína secretada Slit2 por 53% (
P
0,05) (Fig. 4E). Como as culturas de células primárias, o regulamento destes
fendas
e
ROBOs
, bem como a proteína Slit2 secretada, foi perdido no SKOV-3 mais células malignas, e menos diferenciados, (
P Art 0,05) (Fig 4D, F).. Isto sugere que o cortisol pode ter um papel fisiológico na redução da interacção ITSL /ROBO durante a reparação do OSE e ainda que esta via pode ser activa em alguns tipos de cancro do ovário fase inicial.
A) RT-PCR que mostra que PEO células -14 e SKOV-3 expresso
GR Comprar e
MR
mas não
PR
. A linha celular de tumor da mama HTB-19 foi utilizado como um controlo positivo e -RT foi utilizado como um controlo negativo. B) PCR em tempo real quantitativa demonstrando que a transfecção com o
GR
siRNA reduziu
expressão GR
em ambas as linhas celulares quando comparado com o sc mexidos) controle siRNA (. C) A confirmação de que
GR
siRNA não afetou
expressão MR
em PEO-14 e células SKOV-3. D) Quantitative PCR em tempo real, mostrando um aumento no
Slit2
,
ROBO1
e
expressão robo2
depois
GR
derrubar pela
GR
siRNA em células de PEO-14. E) Demonstração de que
GR
siRNA transfectadas células SKOV-3 também aumentaram
Slit2
e
expressão ROBO1
. * =
P Art 0,05
Manipulação de
fendas
e
ROBOs
em células de tumor de ovário por alvo o receptor glicocorticóide
Assim, embora os glucocorticóides têm um efeito prejudicial teórico em células de cancro do ovário início, isso significa que a manipulação do GR, com o objectivo de aumentar
ITSL /ROBO
expressão do gene, é um alvo terapêutico potencial. Nós, portanto, “derrubado”
GR
usando
GR
siRNA em células PEO-14 de cortisol-responsivo. Transfecção do
GR
siRNA por 48 horas causou uma redução significativa de 63% no
GR
expressão (
P Art 0,001) (Fig. 5B) sem influenciar
MR
expressão (Fig. 5C). Isto aumentou a expressão do
Slit2
,
ROBO1
e
genes robo2
supressores de tumor (
P Art 0,05) (Fig. 5D). Além disso, transfecção do
GR
siRNA resultou em uma redução similar em
expressão GR
nas células SKOV-3 cortisol-sem resposta (
P Art 0,01) ( A Fig. 5B). É importante salientar a expressão do
Slit2
e
genes supressores tumorais ROBO1
também foi reforçada pela
GR
siRNA transfecção (
P Art 0,05) (Fig . 5E).
PEO-14 e SKOV-3 células também foram tratados com mifepristona (RU486), que funciona como um antagonista de GR. tratamento RU486 sozinho não influenciou a expressão de
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
ou
robo2
em qualquer linha de células (
P
0,05, dados não apresentados). No entanto o tratamento com RU486 aboliu a regulação negativa mediada cortisol de
expressão ITSL /ROBO
em células de PEO-14 (dados não mostrados). Isso sugere que pode haver efeitos independentes do ligando de GR na expressão SLIT /ROBO e confirma que, mesmo em pouco diferenciado células cancerosas manipulação de GR pode regular a expressão de genes supressores de tumor.
Discussão
neste estudo nós estabelecemos que o adulto humano normal OSE expressa, no nível de RNA,
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2 Comprar e
Robo4
. Utilizando imunohistoquímica, também mostraram que Slit2 e ROBO1 também são expressos ao nível da proteína. Como cada uma das ranhuras é capaz de interagir com cada um dos ROBOs, com a possível excepção de Robo4, é provável que a interacção de fender /ROBO está a ocorrer no OSE. Isto não é surpreendente, uma vez que estas moléculas são expressas em outras células do ovário que inclui a luteína granulosa, luteína teca e células de fibroblastos lútea do lúteo adulto corpus [22] e as pré-células da granulosa e oócitos de folículos primordiais dentro do ovário fetal em desenvolvimento [5 ]. O ovário normal é, portanto, um local das ações autócrinos ou parácrinos fisiológicas do sistema SLIT /ROBO.
Nós descobrimos que no OSE normal, o sistema SLIT /ROBO pode ser regulada pelo cortisol. Cortisol reduziu a expressão de
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
em culturas primárias de células OSE . Nós mostramos anteriormente que a mesma concentração de cortisol pode inibir a expressão de
Slit2
e
SLIT3
em culturas primárias de células da granulosa luteinised e células semelhantes a fibroblastos lútea [22]. Após a ovulação, há um aumento na produção local de cortisol no OSE que pode actuar para estimular a reparação e renovação dos tecidos [28]. Ao longo da gama de concentrações fisiologicamente relevantes em células OSE cortisol tem sido demonstrado que possuem uma acção anti-inflamatória e podem bloquear a interleucina-1 estimulou a expressão de MMP-9 [30], [31]. Além disso, têm mostrado previamente que o cortisol, regulando negativamente a expressão de fendas e ROBOs, inibe a apoptose e facilita a migração de células [22]. Isto implica que, após a ovulação um dos efeitos do cortisol produzido localmente pode ser o de reduzir, temporariamente, a expressão dos genes supressores de tumor ITSL /ROBO para facilitar a reparação do OSE danificado.
em muitos cancros epiteliais existe uma associada a perda da expressão de membros da família de fender /ROBO [9]. Por exemplo a diminuição da expressão de
ITSL
e
ROBO
transcritos tem sido observada em esofágico de células escamosas, hepatocelular, do pulmão, da próstata e do carcinoma da mama [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Esta redução na expressão no entanto, não é universal e alguns tipos de câncer, como gliomas [34] e cancro do endométrio recorrente [35] manter ou aumentar a via SLIT /ROBO. No entanto as alterações na expressão da via em células epiteliais malignas de cancro do ovário não foi anteriormente estudado.
cultivadas células epiteliais malignas a partir do fluido ascítico de pacientes com cancro epitelial do ovário avançado e em comparação expressão ITSL /ROBO para em que OSE normal. Encontramos expressão reduzida de
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
em células malignas. Embora nós acreditamos que estas culturas são culturas puras de células do ovário malignos [36], é possível que possa haver células contaminantes não-malignas em algumas culturas. Estamos, portanto, também comparou as células PEO-14 bem diferenciados com as células pouco diferenciados SKOV-3. Em ambos os casos, as células mais malignos teve menor expressão das fendas e algumas das ROBOs. Portanto, é provável que o câncer de ovário pode ser adicionado à lista de tumores com reduzida expressão SLIT /ROBO.
Fomos para investigar os efeitos que uma fenda /ROBO via menos ativo pode ter sobre a função das células. Estudos recentes implicaram que Slit2 pode inibir a invasão de linhas celulares de tumores do endométrio e do ovário [19]. Também mostramos que a inibição da sinalização de fender /ROBO em culturas primárias de fibroblastos lútea promovidos a migração de células [22]. Além disso bloqueio acção ITSL em células lútea do ovário normal inibida e apoptose reduzida em caspase-3/7 actividade [22]. Houve uma redução na Caspase-3/7 em apoptose mediada por PEO-14 e SKOV-3 células de sinalização quando ITSL /ROBO foi inibida pelo bloqueio da actividade ITSL usando um ROBO1 /Fc quimera e síntese Slit2 usando tecnologia de siRNA. O aumento da apoptose, associada com uma expressão reduzida da Bcl-2 e moléculas anti-apoptóticos Bcl-xl, foi visto em fibrossarcomas Slit2 transfectadas e carcinomas de células escamosas esofágicas [16]. Slit2 também pode induzir apoptose associada com a activação de caspase 3 em linhas celulares da mama e de tumores do pulmão [37]. No geral, uma redução na atividade SLIT /ROBO está associada com aumento da sobrevivência e migração celular e isso é provável que seja relevante no cancro do ovário e sua progressão.
Se a inibição mediada por glucocorticóides da via SLIT /ROBO ainda é manifestados em células epiteliais malignas no cancro do ovário, em seguida, o cortisol pode ter efeitos sobre a sobrevivência das células e a migração que seria prejudicial para o paciente. Nas nossas culturas primárias de cancro avançado do ovário, assim como a linha celular de cancro fracamente diferenciado SKOV-3 de ovário, a regulação de fendas e ROBOs pelo cortisol foi perdida. No entanto, foi mantido na linha de células de tumor de PEO-14 mais diferenciada. Isto implica que a via pode ainda estar activo nas fases iniciais do cancro do ovário ou menos em fenótipos malignas. Curiosamente glucocorticóides pode inibir a apoptose durante o desenvolvimento fibrossarcoma [38] e em linhas de células de tumor de ovário e células a partir do fluido ascítico de pacientes com cancro do ovário [39]. A dexametasona pode também reduzir a apoptose induzida por quimioterapia em uma variedade de diferentes tipos de tumor, incluindo mama, próstata, células de carcinoma do colo do útero e dos ovários [40] – [42]. Portanto a inibição de glucocorticóides de fendas e ROBOs ainda pode ser possível em algumas células malignas.
Como a sobre-regulação de fendas tem sido demonstrado ter efeitos inibitórios sobre o crescimento de tumores e invasão é possível que a manipulação da via de glucocorticóides tem utilidade terapêutica. RU486, um antagonista de GR e PR, pode induzir a apoptose em células cancerosas da próstata e do ovário [43], [44]. O bloqueio da atividade de cortisol em PEO-14 e células SKOV-3, que carecem PR, usando RU486 não influenciou a expressão de
fendas
e
ROBOs
em qualquer linha de células. No entanto RU486 aboliu a regulação negativa da
expressão SLIT /ROBO
em células PEO-14.
Mais importante quando inibida endógena
GR
expressão, usando siRNA, houve um aumento na expressão de certos
fendas
e
ROBOs Online em ambas as células de PEO-14 e SKOV-3. Isto implica que o
fendas
e
ROBOs
poderão ser regulamentadas, ao nível da transcrição, por GR e que um papel importante para a GR no controle da expressão
SLIT /ROBO o mundo Mai ser independente do ligando. Nossa análise bioinformática revelou vários elementos GR-responsivos e afins (GRES) nas regiões promotoras dos
Slit2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
robo2
e
Robo4
. Curiosamente, em células de neuroblastoma, o GR activado interage directamente com p53 e p53 dependente inibe a paragem do ciclo celular e apoptose [45]. No entanto GR pode actuar como um supressor tumoral em outros tipos de tumores, incluindo cancro da pele [46]. Por conseguinte, a função exacta de GR no cancro pode ser dependente do tipo de tumor.
Em resumo, este estudo forneceu mais evidência de que a via de fender /ROBO tem um papel na fisiologia normal do ovário e é regulada por hormonas incluindo glicocorticóides. Também mostrámos que as fendas e ROBOs parecem ser expressas de forma aberrante em cancro do ovário. Além disso, a redução desta via pode aumentar tumorigénese e na progressão através de uma desregulação de processos celulares incluindo apoptose e repulsão da migração celular. Globalmente, estes dados apoiam o conceito de que a redução da via de fender /ROBO é importante no desenvolvimento e progressão maligna. Esta pesquisa também sugere que a segmentação sua regulação fisiológica por esteróides pode ter utilidade no câncer de ovário.
Materiais e Métodos
células e tecidos coleção
Todas as células e tecidos foram obtidos com consentimento informado por escrito após a aprovação do Comitê de Ética Lothian Medical Research. OSE células humanas foram obtidas a partir dos ovários de mulheres pré-menopausa (n = 5) submetidos a cirurgia electiva de condições ginecológicas não-malignas, como descrito anteriormente [29]. células epiteliais malignos foram obtidos a partir do fluido ascítico de mulheres (n = 8) ter a cirurgia para cancro epitelial do ovário avançado como descrito anteriormente [36]. tecido ovariano humano normal foram coletados para um estudo de cortesia [47]. linhas de células A Skov-3 e PEO-14 foram gentilmente cedidas por P. Pujol, INSERM, Montpellier, França e S. Langdon, da Universidade de Edimburgo, Edinburgh, Reino Unido.
cultura celular e tratamentos
OSE células primárias e as células de cancro do ovário primárias foram mantidas rotineiramente em meio de cultura consistindo em meio 199 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) e MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp., Gillingham, Reino Unido) (pH 7,3, 01:01 vv
-1) suplementado com 15% (v /v) de soro bovino fetal, 50 UI /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e 2 mM de L-Glutamina. PEO-14 e SKOV-3 foram cultivadas no mesmo meio no entanto, foi suplementado com 10% (v /v) de FBS. Para as células de estudos de tratamento de cortisol foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 2 × 10
5 células /poço. Após 24 horas meio fresco contendo ou 1000 nM de cortisol [22], [30], [31] em etanol ou com o volume equivalente de etanol (0,001% v /v) foi adicionado às células. Em outras experiências foi utilizado 50 uM RU486 [24] (Sigma) com e sem o cortisol. Cada tratamento foi realizado em triplicado técnica. Após 24 horas 1 ml de meio foi removido de cada poço e armazenados a -20 ° C durante o ensaio de imuno-ensaio (ELISA) e o RNA foi extraído das células como descrito abaixo ligado a enzima.
Para o ROBO1 /Fc células estudos de tratamento foram semeadas a 2 x 10
4 células /poço em placas de 96 poços. Após 24 horas meios frescos contendo quer ROBO1 de rato recombinante /Fc quimera (R D Systems, Inc., Abingdon, Reino Unido; 1 ug /ml) ou o volume equivalente de PBS /0,1% (w /v) de BSA foi adicionada à células. Os tratamentos foram efectuados em quadruplicado técnica. Quarenta e oito horas mais tarde as células foram analisadas quanto a apoptose utilizando o ensaio da caspase-3/7 Glo tal como descrito abaixo.
interferência curto tecnologia de RNA
Vinte e quatro horas antes da transfecção PEO-14 ou as células SKOV-3 foram cultivadas em meios isentos de antibióticos para que as células eram 50% confluentes no momento da transfecção. Curtas oligonucleótidos de ARN interferentes contra GR e Slit2, bem como um controlo negativo, sem semelhança de sequência significativa com sequências de genes humanos, foram obtidos de Applied Biosystems (Warrington, UK). Eles foram transientemente transfectadas em células utilizando o reagente de transfecção Oligofectamine de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Em resumo, os oligonucleótidos de siRNA foram diluídos para uma concentração final de 200 nM em Opti-MEM I Reduced meio de soro (Invitrogen) e combinado com Oligofectamine diluídos para permitir que os complexos siRNA:Oligofectamine para formar à temperatura ambiente. O complexo siRNA:Oligofectamine foi então adicionada gota a gota a cada poço e as células foram então incubadas a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 48-72 horas. Para as experiências de análise de expressão, as células foram cultivadas em placas de 6 poços e cada transfeco foi realizada em triplicado. Para as experiências de ensaio de actividade da caspase-3/7, as células foram cultivadas em placas de 96 poços e cada transfeco foi realizada em quadruplicado.
Análise da expressão
O ARN foi extraído de cada poço das células utilizando o kit RNeasy mini (QIAGEN Ltd., Crawley, Reino Unido) e tratada com desoxirribonuclease I (QIAGEN). O ARN foi utilizado como um molde para a síntese de ADNc utilizando reagentes Taqman da transcriptase reversa (Applied Biosystems). Primers específicos para o
fendas
e
ROBOs
foram previamente descritos em detalhe [22]. A PCR foi realizada em um termociclador Eppendorf Mastercycler gradiente autorizado (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA), utilizando polimerase do ADN GoTaq Flexi (Promega Ltd, Southampton, Reino Unido). O thermocycle de PCR consistiu de uma desnaturação inicial de 5 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, temperatura de emparelhamento durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, e uma extensão final de 10 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram visualizados sobre um 2% (w /v) de gel de agarose com brometo de etídio adicionado.
quantitativa de ARN-PCR em tempo real
e extraiu-se a transcrição reversa, como descrito acima. Uma curva padrão foi gerada com diluições em série de ADNc sintetizado a partir de cérebro fetal de ARN total humano (Stratagene Europe, Amsterdão, Países Baixos). Em tempo real a amplificação por PCR foi então realizada em reacções de 10 ul em duplicado utilizando
poder
SYBR Green PCR mestre Mix (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante e usando o instrumento em tempo real do sistema de PCR rápidos ABI 7500HT (Applied Biosystems) . Os iniciadores utilizados foram os mesmos que para a análise de expressão e foram descritos anteriormente [22].