Abstract

carcinoma da nasofaringe (NPC) está etiologicamente associado com o vírus Epstein-Barr (EBV). No entanto, o papel exacto do EBV no NPC patogênese permanece indefinida. A activação do transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) é comum em cancros humanos incluindo APN e desempenha um papel importante na patogénese e progressão de cancros humanos. A interleucina-6 (IL-6), um importante citocina inflamatória, é um potente activador da STAT3. Neste estudo, que relatam que as células infectadas pelo EBV imortalizada epitelial da nasofaringe (NPE) adquirem frequentemente uma resposta melhorada para a activação da STAT3 induzida por IL-6 para promover o seu crescimento e as propriedades invasivas. Curiosamente, esta resposta /STAT3 IL-6 reforçada foi mediada por sobre-expressão de receptor de IL-6 (IL-6R). Além disso, IL-6R superexpressão maior ativação STAT3 induzida por IL-6 em células imortalizadas NPE não infectados

in vitro

, e promoveu o crescimento e tumorigenicidade de linha de células NPC EBV-positivo (C666-1)

in vivo

. Além disso, mostra-se pela primeira vez que a IL-6R foi sobre-expresso em espécimes clínicos de NPC. IL-6 de expressão pode também ser fortemente detectada nas células do estroma da NPC e um nível de circulação mais elevada de IL-6 foi encontrada nos soros de doentes com NPC-encenado evolução em relação aos sujeitos de controlo. Portanto, a sobre-expressão de IL-6R, juntamente com a sinalização de IL-6 /STAT3 reforçada pode facilitar a transformação maligna de células pré-malignas NPE infectadas com EBV em células cancerosas, e melhorar as propriedades malignas de células NPC

citação:. Zhang L , Tsang CM, Deng W, Yip YL, Lui VW-Y, Wong SCC, et ai. (2013) aprimorado IL-6 /IL-6R Sinalização Para promover o crescimento e propriedades malignas em pré-malignas e cancerosas nasofaríngeo epiteliais células infectadas pelo EBV. PLoS ONE 8 (5): e62284. doi: 10.1371 /journal.pone.0062284

editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 de dezembro de 2012; Aceito: 19 de março de 2013; Publicado em: 01 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto é financiado por doações GRF concedidas pelo Conselho Hong Kong Research Grant (número Grant: 776608M; 779810M; 780911M para SWT) ea RGC patrocinado área de excelência Theme (número de concessão: AoE /M-06/08 a MLL). VWL é apoiado pelo Fundo L. Patricia Knebel da Fundação Pittsburgh, EUA, o Programa de Desenvolvimento de Carreira 512 do Programa Especializada de Investigação Excellence (SPORE) em Câncer de Cabeça e Pescoço (5P50CA097190-05), o Head and Neck Cancer SPORE Developmental Research Award (5P50CA097007). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma da nasofaringe (NPC) é um tipo distinto de cabeça de câncer de pescoço com alta prevalência no sudeste da Ásia [1]. Esta malignidade é caracterizado por o vírus de Epstein-Barr (EBV), bem como o seu estroma altamente inflamatória e natureza metastática [2]. EBV está presente em praticamente todos os casos de NPC indiferenciada em regiões endêmicas e tem sido postulada como sendo um fator etiológico crucial para NPC patogênese. No entanto, até à data, o papel exacto do EBV no NPC patogênese permanece incerto [3] – [5]. O papel das citocinas inflamatórias na patogênese do câncer está bem estabelecida, mas os seus efeitos sobre a pré-malignas infectados com EBV e epitélios de nasofaringe cancerosas são mal definidos.

evidência cumulativa sugere que vários fatores estão envolvidos na patogênese NPC em complemento, quer em conjunto com infecção por EBV [4], [6]. activação da STAT3 é comum em cancros humanos, incluindo tanto os tumores sólidos e hematológicos [7]. A activação constitutiva de STAT3, indicado por um aumento da expressão de fosfo-STAT3 (p-STAT3), tem sido relatada em 70% dos espécimes de NPC [8] – [10]. Em condições fisiológicas normais, a activação STAT3 é geralmente transitória e é estreitamente regulada. Em células tumorais, a activação constitutiva de STAT3 pode ser causada por anormal e sustentada de sinalização autócrina e /ou parácrina, incluindo interleucina-6 (IL-6) de sinalização [11] – [13]. IL-6 ativa STAT3 por se ligar especificamente ao seu receptor cognato na membrana da célula, isto é, IL-6R. Após a ligação da IL-6, o receptor da IL-6 ativa as cinases associadas ao receptor (JAK1, JAK2 e Tyk2), que induz a fosforilação e dimerização subsequentemente da STAT3 (activação da STAT3). STAT3 activado é translocado, em seguida, para dentro do núcleo para induzir a transcrição do gene alvo [14], [15]. a activação constitutiva de STAT3 promove o crescimento do tumor e a sobrevivência, bem como a invasão, a transição epitelial-mesenquimatosa e a angiogénese [16] – [18]. Um estudo recente proposto que a activação da STAT3 IL-6 mediado podem mediar a indução de iNOS na NPC, resultando na formação de lesões no ADN mutagénicos que pode contribuir para a sua patogénese [19].

Apesar da importância biológica emergente da STAT3 activação na NPC, o mecanismo exacto da sua activação permanece mal definida, especialmente no contexto da infecção pelo EBV [20]. O promotor L1-TR de um oncogene codificados pelo EBV, LMP1, contém um elemento responsivo-STAT3 [21]. activação da STAT3 poderia induzir a transcrição de LMP1 em células infectadas com EBV NPC. Além disso, a expressão de LMP1 regula positivamente IL-6 produção [22], [23], o qual activa a STAT3 sinalização para estabelecer um circuito fechado de realimentação positiva da STAT3 /LMP1 /IL-6 /STAT3 activatioin para amplificar sinalização STAT3 em células NPC infectadas com EBV [22 ].

impulsionado IL-6-ativação STAT3 é de particular importância no NPC patogênese.

In vivo

, o estroma inflamatória pode representar uma fonte potente de IL-6 para conduzir a activação da STAT3 em células infectadas por EBV epitelial da nasofaringe (NPE) para promover a tumorigénese e progressão da doença. Embora a IL-6 é uma citoquina mediadora de sinalização STAT3 chave, o papel da IL-6 de sinalização /STAT3 em células pré-malignas NPE infectadas com EBV não foi previamente relatada. Temos anteriormente estabelecida a infecção por VEB estável em células imortalizadas NPE [24], [25]. Estas linhas de células infectadas com EBV NPE foram utilizados neste estudo para examinar a relação entre a activação da STAT3 intrincada e infecção pelo EBV. Curiosamente, foi observada pela primeira vez que a infecção pelo EBV estável em células imortalizadas NPE muitas vezes resultou em potenciação das respostas à activação da STAT3 induzida por IL-6. Além disso, a ativação STAT3 nestas células NPE infectadas com EBV potenciado a sua independência de ancoragem e propriedades invasivas

in vitro

. Os mecanismos subjacentes a sinalização de ativação STAT3 induzida por IL-6 reforçada em células nasofaríngeas infectadas com EBV foram examinados neste estudo e sua relevância clínica em NPC foram exploradas.

Materiais e Métodos

declarações Ética

os estudos envolvendo seres humanos foram aprovadas pelo Conselho de revisão Institucional da Universidade de Hong Kong /Hospital Autoridade de Hong Kong Oeste Cluster, e todos os assuntos previstos consentimento informado por escrito antes da participação no estudo. As investigações animais foram aprovados pela Comissão sobre a utilização de animais vivos em ensino Pesquisa da Universidade de Hong Kong. esforço maior foi utilizada para evitar o sofrimento e minimizar o número de ratos necessários para cada experimento.

Células e cultura de células

O estabelecimento e caracterização de linha de células imortalizada NPE NP460hTert foi previamente descrito [26 ]. Criação de outras linhas celulares NPE incluindo NP550-cyclinD1-hTERT, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1-hTERT serão relatadas separadamente. infecção por EBV estável foi alcançado nestas células imortalizadas NPE e suas condições de cultura foram previamente relatada [24], [25]. infecção por EBV e células de cultura de células de NPE foram realizados como descrito anteriormente [24]. As linhas celulares humanas NPC CNE2, C666-1, HONE1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) contendo 10% de FBS a 5% de CO

2 a 37 ° C.

os plasmídeos

o plasmídeo para expressar um STAT3 mutante constitutivamente activo (pBabe-STAT3-C), o promotor da construção repórter de luciferase de IL-6 (pGL3-IL-6-Luc), e o plasmídeo repórter de luciferase M67 utilizados para a detecção de activação STAT3 (luc-M67) foram gentilmente cedidas pelo Dr. JF Bromberg, Departamento de Medicina, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, EUA [27]. O pUC-IL-6R utilizado para a expressão de IL-6R foi gentilmente fornecido pelo Dr. R. Stefan (Instituto de Bioquímica, Christian-Albrechts-Universidade, Alemanha) [28]. O vector de expressão retroviral (pBabe-IL-6R) utilizado para sobre-expressar a IL-6R foi gerado por inserção do fragmento de IL-6R desde o pUC-IL-6R no vector pBabe no sítio de Sall. O plasmídeo de expressão LMP1 (pcDNA 2117) que foi utilizada em estudo anterior [29] foi uma generosa oferta do Dr. D. P. Huang, da Universidade Chinesa de Hong Kong.

Western Blot Analysis

análises de Western blot foram realizadas como descrito anteriormente [26]. Os extractos nucleares foram preparados a partir da cultura de células usando o NE-PER citoplasmáticas de extracção Reagentes e Nucleares (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos utilizados para detectar IL-6R, ciclina D1 e β-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos contra a STAT3, p-STAT3 (Tyr705) e Bcl-2 foram adquiridos de sinalização celular (Danvers, MA, EUA). Os anticorpos contra c-myc, anti-Flag foram adquiridos da Sigma. O anticorpo contra LMP-1 foi comprado da Dako (Glostrup, Dinamarca). Os anticorpos secundários utilizados foram anticorpos ligados a peroxidase de rábano adquiridos na Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). A detecção do antígeno em Western blot foi por reagentes de quimioluminescência ECL Plus (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante.

teste de desvio de eletroforética-mobilidade (EMSA)

EMSA foi realizada de acordo a instrução de manufactor usando um kit disponível comercialmente para a ativação STAT3 (Thermo Scientific). Resumidamente, os extractos celulares totais de proteína (4 ug) preparada a partir de IL-6-tratadas e células não tratadas foram incubadas com soro de alta afinidade marcado com biotina elemento indutível (HSIE) oligonucleótido duplex (GATCCATTTCCCGTAAATC). Depois de eletroforese em gel, a STAT3 ligado: oligonucleotídeo foi electro em 350 mA para Biodyne B membrances (nylon) e calculadas segundo um reticulador UV. As membranas com o oligonucleotídeo ligado transferidas foram bloqueadas, marcado com estreptavidina-HPR conjugado, a 1:1000 concentração, e expostos a reagentes de quimioluminescência ECL Plus (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Supershifting da STAT3: complexos de oligonucleótido foram detectados após 30 min de pré-incubação com anticorpos anti-STAT3 (Santa Cruz)

Transwell Invasão ensaio

O ensaio de invasão na câmara de Boyden foi realizada utilizando câmara Transwell do. Milipore Company (6.4 mm de diâmetro com tamanho de poro de 8,0 ^ M) de acordo com um método previamente publicado [30]. A migração celular foi determinada pela média do número de células que migraram em dez campos microscópicos escolhidos aleatoriamente em × 400 de ampliação. Os dados apresentados são a média ± DP de poços em triplicado.

transfecção transitória o plasmídeo repórter de luciferase e ensaio de

Lipofectamina

™ foi usada 2000 (Invitrogen) para a transfecção transiente de ADN de plasmídeo de acordo com o fabricante do instrução. Para a medição da atividade STAT3 transativadora em HONE1 e células HONE1-EBV, 0,8 ug de repórter luciferase m67 (luc-m67) plasmídeo por amostra foi utilizada. A detecção da activação da STAT3 foi realizada com a co-transfecção de RcCMV STAT3-C ou vector de controlo com o plasmídeo repórter de luciferase. Para a medição de IL-6, a actividade do promotor de genes em células HONE1, 0,8 ug de pGL3-IL-6-Luc por amostra foi usada. A proporção de construção repórter de luciferase de pirilampo e Renilla utilizado foi de 200: 1. Trinta e seis horas após a transfecção, as células foram lisadas, e as actividades de luciferase foram medidas utilizando o kit Repórter Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). A actividade de luciferase foi normalizada em relação com o valor do sinal de luciferase de Renilla.

-PCR quantitativo em tempo real

O ARN foi isolado a partir de amostras utilizando TRIzol (Invitrogen). O ARN foi transcrito reversamente em ADNc utilizando transcriptase reversa SuperScriptII (Invitrogen) de acordo com protocolos anteriormente publicados [26]. As sondas e os iniciadores foram concebidos utilizando o sistema universal de sonda da biblioteca (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de reacção consistiu em 0,4 ul de iniciador directo (10 uM), 0,4 ul de iniciador para trás (10 uM), 10 ul de mistura LightCycler mestre, 4 ul autoclavado água Milli-Q, sonda de ADNc de 0,2 ul e 5 ul. PCR em tempo real foi realizada em My Time Sistema IQTM2 real PCR Detection (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). iniciadores específicos de gene e sondas utilizados para o estudo são apresentados na Tabela 1. Os níveis relativos de transcritos de mRNA dos genes examinados foram normalizados para níveis de transcrição de controlo interno de GAPDH.

Anchorage crescimento independente

ensaio de colónias de agar macio-foi utilizado para determinar o crescimento independente de ancoragem das células infectadas e não infectadas com EBV. O ágar de baixo (0,6%) foi preparado por mistura de 6% de bacto-agar e forma na proporção 01:09. Dois ml de agar superior (0,3%) misturado com 1 × 10

5 células foram então semeadas em agar de topo da parte inferior. Os tamanhos de colónias foram contadas após 3 semanas de incubação. Apenas colónias 0,2 mm de diâmetro foram contadas. Os dados apresentados são a média ± DP de poços em triplicado.

tumorigenicidade em ratinhos nus ensaio

C666-1 células (1 × 10

6 células) ectopicamente que expressam a IL-6R foram colhidas e suspenso em 50 ul de PBS, e depois misturado com um volume igual de Matrigel

™ membrana basal da matriz (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). O volume total de 100 ul de suspensão de células foi injectado no flanco de ratinhos nus do sexo masculino de idade de 6-8 semanas. Uma vez que o crescimento do tumor foi estabelecida, os tamanhos do tumor foram medidos a cada dois dias. O volume tumoral (média ± SD) foi calculado como comprimento x largura

2/2 [31].

MTT ensaio

Resumidamente, 1 × 10

3 células por poço foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas durante a noite. Subsequentemente, os meios de cultura foram substituídos com meio RPMI contendo 1% de FBS com ou sem recombinante humana IL-6 e incubaram-se ainda mais para os pontos de tempo indicados. Em seguida, 20 ul de reagente de marcação de MTT (5 mg /ml em PBS; Sigma) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 horas a 37 ° C, seguido por adição de 200 ul de DMSO para dissolver os cristais de formazano. A absorvância foi medida a 570 nm utilizando um leitor multiplacas (Merck Eurolab, Dietikon, Suíça). Cada ponto de dados representaram a média ± SD de três poços por grupo de tratamento.

Imunohistoquímica

Tissue microarray (TMA) contendo controle e amostras de tecido NPC foram obtidos a partir de banco de tecidos NPC estabelecida pelo Centro de nasofaríngea Carcinoma Research (RGC financiado área de excelência Theme). Seções para imuno-histoquímica foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em álcool graduado. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação de lâminas com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. Para recuperação de antigénios, todas as lâminas foram incubadas com 10 mmol /L de tampão citrato (pH 6,0) a 93 ° C durante 10 min, e depois arrefecida até à temperatura ambiente. Depois disso, as secções foram lavadas com PBS e tratadas com soro de bloqueamento normal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) durante 30 min. IL-6 do anticorpo anti-humano e anticorpos para a IL-6R anti-humano (Santa Cruz) diluída em PBS (1:100) foram aplicados às secções e incubado a 4 ° C durante a noite. Após lavagem, todas as secções foram novamente incubadas durante 1 h com anticorpo e peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina secundário conjugado com biotina, seguido de um cromogénio, diaminobenzidina (Dako). Contracoloração foi realizada por hematoxilina antes da desidratação e de montagem. Os controlos negativos foram realizados por adição de péptido de bloqueio para substituir a ligação dos anticorpos primários para os antigénios.

ELISA para a IL-6

As concentrações circulantes de IL-6 no soro de controlos e pacientes APN e os sobrenadantes de linhas de células foram quantificados utilizando um ensaio de ELISA para a IL-6 (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras duplicadas foram estimadas e os valores médios foram usadas na análise.

A análise estatística

Os dados de cada experiência foram expressos como média ± desvio-padrão (DP).

t

teste de Student foi utilizado para avaliar as diferenças entre os grupos experimentais. A

p

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo ao longo deste estudo

Resultados

EBV-infecção de células imortalizadas NPE melhoradas as suas respostas à ativação STAT3 induzida por IL. -6

Temos relatado anteriormente o estabelecimento da infecção EBV estável em uma linha imortalizada-telomerase NPE celular (NP460hTert) [24]. Quando examinados para respostas a IL-6, observou-se que o NP460 EBV-infectado (NP460hTert-EBV) de células exibido consistentemente um nível muito mais elevado de p-STAT3 (Tyr 705) em comparação com células NP460hTert não infectados após exposição a IL-6 (Figura 1A ). Nós também foram capazes de mostrar uma indução sustentada de p-STAT3 em pontos de tempo prolongados após a IL-6 de tratamento (Figura 1B). O p-STAT3 pode ser detectada até 12 h, em células infectadas com EBV (Figura 1B). Em células não infectadas de controlo, o nível de p-STAT3 já retornou aos níveis basais em 0,5 horas (Figura 1A e B). Esta observação suporta ainda que a activação da STAT3 induzida por IL-6 é muito mais potenciada em células infectadas por EBV em comparação com as não infectadas. Fomos capazes de confirmar a activação melhorada do STAT3 com o tratamento de IL-6 em células NP460hTert-EBV por translocação nuclear de P-STAT3 (Figura 1C), indicando hiperactivação da STAT3 por IL-6 em células NPE infectados por EBV, mas não o EBV-negativo homólogo. Esta activação aumentada de STAT3 por tratamento com IL-6 em células-NP460hTert EBV foi ainda confirmada por EMSA (Figura 1D). A especificidade do EMSA para a activação da STAT3 foi confirmada por supershifting o complexo STAT3 /ADN após a ligação ao anticorpo específico para a STAT3 (Figura 1E). O aumento da activação da STAT3 induzida por IL-6 foi também observada em uma outra linha celular imortalizada NPE, NP550-cyclinD1-hTERT (recentemente imortalizados pela acção combinada de hTERT e ciclina D1; manuscrito em preparação) (Figura 1F). Uma activação da STAT3 melhorada também foi observado numa linha celular NPC infectados com EBV, CNE2, apesar de em menor grau (Figura 1G), quando comparada com a de linhas de células imortalizadas NPE. O maior nível de p-STAT3 em células de câncer após o tratamento IL-6 pode ser responsável por uma resposta fraca à ativação STAT3 reforçada após a infecção EBV. Esta resposta mais fraca no CNE2 EBV-infectadas foi demonstrada por experiências repetidas. Colectivamente, na presença de infecção por EBV (EBV-infectadas tanto NPE e NPC células infectadas com EBV), IL-6 induz a hiperactivação da STAT3.

células infectadas com EBV e NP460hTert não infectados foram tratados com IL-6 em 50 ng /ml para (A) 10, 20 ou 30 minutos, e para (b) de 0,5, 1, 2, 4, 8 ou 12 horas. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e a expressão de p-STAT3 (Tyr 705) foi analisada por Western blot. STAT3 total foi detectado como o controlo para a carga de proteína. (C) Os extractos nucleares foram preparados a partir de células infectadas com EBV e não infectado NP460hTert com ou sem tratamento com IL-6 (50 ng /ml durante 30 minutos) e sujeitas a análise de Western blot, para a expressão de p-STAT3. Histona 1 foi detectado como o controlo para o extrato de carga nuclear. (D) Os lisados ​​proteicos de células inteiras foram preparados seguindo o tratamento com a IL-6 durante o tempo indicado e, em seguida, foram submetidas a análise de EMSA usando sonda HSIE marcado com biotina (contendo elementos de ligação de ADN STAT). Para a competição “frio”, extractos foram pré-incubados com sonda não marcada em excesso HSIE molar de 200 vezes durante 20 minutos antes da análise. O ensaio supershift (E) foi realizada por incubação do extracto com um anticorpo anti-STAT3 durante 30 minutos antes da análise EMSA. O complexo supershifted específica STAT3 foi observado que confirmou a especificidade do EMSA para a activação da STAT3 melhorada em NP460hTert infectados pelo EBV para a estimulação de IL-6. (F) NP550-cyclinD1-hTERT e EBV infectados NP550hTert-cyclinD1 foram ou não tratados ou tratados com IL-6 a uma concentração final de 50 ng /ml durante 30 minutos. A expressão de p-STAT3 (Tyr 705) foi analisada por Western blotting. STAT3 expressão foi sondada como um controlo de carga de proteínas. (G) As células infectadas com EBV CNE2 CNE2 e foram tratadas ou não tratadas com IL-6 a uma concentração final de 50 ng /ml durante 30 minutos. A expressão de p-STAT3 (Tyr 705) foi analisada por Western blotting. STAT3 expressão foi sondada como um controlo de carga de proteínas a partir de diferentes populações de células.

superexpressão de IL-6R está envolvido na potenciação da activação da STAT3 IL-6-mediada em células imortalizadas NPE infectadas com EBV

em seguida, examinou-se o mecanismo subjacente para tal uma resposta aumentada de células infectadas com EBV NPE a IL-6. Tal como a IL-6 transmite a sinalização através da interacção directa da superfície celular com o IL-6R, examinámos a expressão de IL-6R nas células infectadas com EBV NPE e os homólogos não infectadas. Inesperadamente, a sobre-expressão da proteína IL-6R, bem como o aumento dos níveis de transcritos de ARNm de IL-6R foram detectados por transferência de Western e PCR em tempo real, respectivamente, em células NP460hTert-EBV (Figura 2A 2B). Curiosamente, o nível de proteína de IL-6R não era directamente proporcional ao seu nível de transcrição. No entanto, o nível de proteína de um gene particular pode não ser completamente dependente do nível de transcrição. O nível de expressão de uma proteína particular podem também ser regulada pela degradação pós-translacional. Além disso, a sobre-expressão de IL-6R por transferência de genes retroviral em células NP460hTert também conferida a capacidade de resposta aumentada à activação da STAT3 induzida por IL-6 (Figura 2C). Além disso, a activação da STAT3 aumentada por IL-6 em células NP460 com EBV podiam ser neutralizados por anti-IL-6R tratamento com o anticorpo (Figura 2D). Todos estes resultados indicam que a sobre-expressão de IL-6R nas células EBV-NP460hTert desempenhar um papel fundamental na mediação da capacidade de resposta aumentada à activação da STAT3 ao tratamento com IL-6.

(A), a expressão de IL-6R em EBV células não infectados e infectados NP460hTert foi analisada por Western blot. Imunotransferência para β-actina foi fornecido como controlo de carga de proteína. (B) O ARN total foi extraído e os níveis de expressão de mRNA de IL-6R em NP460hTert e células EBV-NP460hTert foram analisados ​​por quantitativa em tempo real de RT-PCR. Os níveis de ARNm de IL-6Ra foram normalizadas para GAPDH mRNA celular. Os dados foram coletados a partir de experiências separadas em triplicado. *

p Art

0,05

. células (C) NP460hTert foram infectadas com vectores de expressão retrovirais, pBabe-IL-6Ra ou vectores vazios pBabe. Estavelmente transduzidas células foram tratadas com IL-6 na concentração de 50 ng /ml durante 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram preparados e analisados ​​para a expressão de IL-6Ra e p-STAT3 (Tyr 705) por transferência de Western. Immunoblottings para STAT3 e β-actina estão apresentados como controlos para a carga de proteína. (D) As células NP460hTert e NP460hTert com EBV foram pré-tratados com anticorpo anti-IL-6R a 5 ug /ml durante 30 minutos, antes de tratamento com IL-6. A expressão de p-STAT3 foi analisada por Western blot. Imunotransferência para os níveis totais de proteína STAT3 é mostrado como controlos para a carga de proteína. (E) Após a infecção por EBV, as células infectadas com EBV NP460hTert e suas células parentais não infectadas foram subcultivadas de forma contínua. Células lisados ​​foram preparados a partir de células que tinham sido subculturas por 56, 99 e 133 vezes (designados mais cedo, passagem média e tardia). A expressão de IL-6R foi analisada por Western blotting. Imunotransferência para β-actina foi incluída como controlo para a carga de proteína. (F) Os níveis de expressão de IL-6R em culas foram detectadas por Western Blot em várias linhas celulares emparelhado não infectados e infectados com EBV, incluindo infectadas com EBV e não-infectadas pares de NP460hTert, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1- hTERT, NP550-cyclinD1-hTERT. β-actina expressões foram mostrados como controle de carga de proteína.

Em seguida, procurou examinar se IL-6R superexpressão foi uma consequência directa da infecção pelo EBV ou o resultado da seleção progressiva de células NP460hTert infectadas com EBV superexpressão IL-6R mediante passagens prolongadas. Os níveis de expressão de IL-6R em diferentes passagens de células infectadas com EBV e não infectado foram comparados NP460hTert. Observou-se um aumento muito moderado na expressão de IL-6R no início da passagem de células NP460hTert infectadas com EBV, e houve um aumento gradual na expressão de IL-6R nas células NP460hTert com EBV mediante cultura prolongada (Figura 2E). Note-se que uma tal alteração dos níveis de IL-6R não foi observado nas células não infectadas NP460hTert culturas mais prolongadas (Figura 2E). Isto indicou fortemente que a superexpressão de IL-6R tem a vantagem de crescimento selectivo para células infectadas com EBV NP460hTert e foi seleccionado activamente em cultura. Superexpressão de IL-6R foi também detectada em outras três linhas de células estavelmente EBV infectados imortalizadas NPE recentemente estabelecidos em nosso laboratório por ações combinadas de telomerase com CDK4 ou ciclina D1 (NP550-CDK4-hTERT-EBV; NP361-cyclinD1-hTERT-EBV ; NP550-cyclinD1-hTERT-EBV) [25], mas não em homólogos não infectadas (NP550-CDK4-hTERT; NP361-cyclinD1-hTERT; NP550-cyclinD1-hTERT) (Figura 2F). características detalhadas destes linhas celulares NPE recentemente imortalizados serão publicados separadamente. Estas observações sugerem que a sobre-expressão de IL-6R tem vantagem de crescimento selectivo nas células NPE infectadas com EBV e está ativamente selecionado sobre passagens prolongadas.

A activação constitutiva da STAT3 potencializa o crescimento e propriedades malignas das células infectadas com EBV

Procuramos explorar alguns de importância biológica desta seleção ativa de expressão IL-6R em células NPE infectadas com EBV. Uma hipótese é que a infecção por EBV pode induzir estresse para as células imortalizadas NPE [5] e activação STAT3 pode superar a parada do crescimento induzido pelo estresse em células NPE após a infecção EBV e promover a sua sobrevivência. A activação da STAT3 é conhecida para activar uma variedade de eventos alvo a jusante para potenciar o crescimento e as propriedades malignas de células cancerosas [16]. Estudámos, portanto, se a ativação STAT3 pode potenciar o crescimento e propriedades malignas de células NPE infectadas com EBV. Uma forma mutante dominante activa da STAT3 (STAT3C) foi transfectado em células infectadas com EBV e NP460hTert não infectado, de modo a conseguir a activação constitutiva de STAT3 (Figura 3A). Fomos capazes de observar um aumento moderado na expressão de c-myc e Bcl-2, sob a activação constitutiva de STAT3 nas células infectadas com EBV em comparação com células de controlo não infectados (Figura 3A). IL-6 de tratamento também sofreu uma expressão mais longa e mais forte de ciclina D1 em células infectadas com EBV (Figura 3B). A densitometria foi usada para análise dos níveis de ciclina D1 em 0.5, 1, 2, 4 hora (s) em células infectadas por EBV e células não infectadas após tratamento com IL-6. O nível de ciclina D1 foi regulada positivamente em células infectadas com EBV-tratados com IL-6 por dobras 2 a 4 horas ponto de tempo (Figura 3B). Em contraste, os níveis de ciclina D1 em IL-6-tratados células não infectadas apenas marginalmente regulados positivamente em 0,5 horas e deixou de aumentar em outros pontos de tempo (Figura 3B). Estes dados sugerem que a IL-6 pode diferencialmente elevar a expressão de ciclina D1 em células infectadas por EBV, mas não em células não infectadas. Curiosamente, a activação constitutiva de STAT3 por expressão STAT3C também reforçada as propriedades invasivas de NP460hTert-EBV em comparação com células de controlo não infectadas NP460hTert como ensaiado pelo ensaio de invasão de Matrigel (Figura 3C). Além disso, a IL-6, também o tratamento melhorou as propriedades invasivas das células NP460hTert-EBV (Figura 3D). A activação constitutiva de STAT3 por expressão em células STAT3C NP460hTert-EBV também induziu o crescimento independente de ancoragem robusta em agar mole, sugerindo um papel da activação da STAT3 para promover a transformação tumorigénico de células imortalizadas NPE infectadas com EBV (Figura 3E). Os números, bem como os tamanhos das colónias independente de ancoragem em células NP460hTert por EBV que expressam STAT3C foram aumentadas em comparação com células de controlo infectadas com o vector pBabe vazio (Figura 3E). Todas estas observações mostraram que a activação da STAT3 melhora as propriedades de crescimento em células de NPE imortalizadas infectadas com EBV, o que pode explicar a selecção de IL-6R fenótipo sobreexpressão em células NPE infectadas com EBV tornando-as mais sensíveis à activação da STAT3 induzida por IL-6.

(a) c-Myc e Bcl-2 foram induzidos por expressão STAT3-C em células NP460hTert e NP460hTert-EBV. A marcado com FLAG STAT3-C foi transduzida e seleccionadas em células NP460hTert e NP460hTert-EBV. análise de Western blot revelou a expressão de FLAG indicando expressão bem sucedida de STAT3C. Expressão de c-myc e bcl-2 foi induzida em ambas as células e NP460hTert NP460hTert-EBV após expressão STAT3-C. (B) A expressão intensificada de ciclina D1 em células NP460hTert-EBV-tratados com IL-6 foi observado em comparação com células de controlo NP460hTert. As células foram tratadas ou não tratadas com IL-6 a uma concentração final de 50 ng /ml durante o tempo indicado. No painel da esquerda, a expressão de ciclina D1 foi analisada por Western blot para a expressão da proteína. No painel da direita, densitometria foi utilizado para quantificar a expressão de ciclina D1 com referência à actina. prolongada expressão da ciclina D1 foi observada em células infectadas com EBV-tratados com IL-6, mas não nas células NP460hTert-tratados com IL-6. (C) STAT3-C-expressando NP460hTert e células NP460hTert-EBV se observado aumento na capacidade de invasão em comparação com células de controlo de vector. A capacidade invasiva foi medida por contagem do número de células que atravessaram a membrana revestida de Matrigel em 24 horas. Os dados apresentados são a média ± DP de poços em triplicado de experiências em triplicado. *,

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p Art 0,05. (D) IL-6 tratamento invasão celular aumentada de células NP460hTert-EBV

in vitro

. células NP460hTert com EBV foram carregados para a câmara de invasão superior, com ou sem tratamento de IL-6 (50 ng /ml). Após 24 horas, as células de penetração dentro da câmara inferior foram corados e contados. Os dados apresentados são a média ± DP de poços em triplicado de experiências em triplicado. *

p Art 0,05. controle- vetor (E) pBabe e células STAT3-expressando-C (1 × 10

5) foram semeadas em agar mole. Três semanas mais tarde, foram tiradas fotos das colônias. As colónias com diâmetro (≥0.2 mm) foram contadas. Os números de colónias mostrados são as médias ± DP a partir dos resultados em triplicado. *

p Art 0,05

IL-6 aumenta a expressão LMP1 em células NPE e NPC infectadas com EBV

Temos relatado anteriormente que a ativação do STAT3 poderia upregulate LMP1