Abstract

Fundo

No câncer de próstata, expressão tumoral de CB canabinóide

receptores 1 está associada a um mau prognóstico. Uma explicação para esta associação vem de experiências com células de astrocitoma transfectadas, em que uma expressão elevada do receptor de CB recruta o percurso de sobrevivência de sinalização de Akt. No presente estudo, investigamos a associação entre

1 expressão CB receptor eo Akt em uma próstata tissue microarray câncer bem caracterizada.

Metodologia /Principais Achados

fosforilada Akt imunorreatividade (pAkt-IR) marca estavam disponíveis no banco de dados. CB

1 imunorreactividade do receptor (CB

1IR) foi recodificados a partir de dados publicados anteriormente, utilizando a mesma escala que pAkt-IR. Houve uma correlação altamente significativa entre CB

1IR e pAkt-IR. Além disso, casos com elevados níveis de expressão de ambos os biomarcadores eram muito mais propensos a ter uma forma mais grave da doença no momento do diagnóstico do que aqueles com baixos níveis de expressão. Os dois biomarcadores teve efeitos aditivos, ao invés de uma interação, na sobrevivência específica da doença.

Conclusões /Significado

O presente estudo fornece dados que é consistente com a hipótese de que em um alto CB

1 expressão do receptor, a via de sinalização Akt torna-se operacional

Citation:. Cipriano M, Häggström J, Hammarsten P, Fowler CJ (2013) Associação entre canabinóide CB

1 receptor e Akt sinalização em Prostate Câncer. PLoS ONE 8 (6): e65798. doi: 10.1371 /journal.pone.0065798

editor: Vinod K. Yaragudri, Nathan Kline Instituto de Pesquisa Psiquiátrica e da Nova School of Medicine York, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de março de 2013; Aceito: 02 de maio de 2013; Publicação: 05 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cipriano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer ao Conselho de Pesquisa sueco (Grant não 12158, medicina.); Cancer Society Sueco (. Grant não CAN2010 /437); Fundação de leão Cancer Research, Universidade de Umeå e dos Fundos de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Umeå para apoio financeiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o sistema endocanabinóide (BCE), que compreende a acoplados à proteína G CB

1 e CB

2 receptores, sua endógena ligantes anandamida e 2-araquidonoilglicerol, e suas enzimas sintéticas e catabólicos, tem sido mostrado para ser envolvido no controlo da proliferação, migração e comportamento invasivo de uma ampla variedade de células cancerosas [1] – [5]. A próstata humana expressa funcionalmente activa CB

sub receptores 1 [6], e anandamida reduz a taxa de factor de crescimento epidérmico (EGF) e crescimento estimulado por prolactina de linhas celulares de cancro da próstata humano de uma forma que envolve a activação de CB

1 os receptores de [7], [8]. Em contraste, tanto mitogénico e, em concentrações elevadas, os efeitos antiproliferativos de canabinóides foram observados para células de cancro da próstata não estimuladas [9] – [14], bem como os efeitos não relacionadas com interacções com receptores CB [2], [14] – [16]. Uma variedade de mecanismos, incluindo a produção de ceramida, a sub-regulação de receptores de EGF (EGFR) e receptores de prolactina, a inibição da actividade de RhoA e activação sustentada das cinases reguladas por sinais extracelulares (ERK) foram implicadas nos efeitos inibitórios dos canabinoides em cima da próstata o crescimento das células do cancro ou da motilidade [7], [8], [12], [17].

Manipulação dos níveis de 2-araquidonoilglicerol e homólogos relacionados (por bloqueio ou eliminação do monoacilglicerol lipase enzima catabólico, que é responsável para a hidrólise desses lipídios) reduz a sobrevivência, mobilidade e as propriedades invasivas

in vitro

bem como o crescimento

in vivo

de PC-3 células de câncer de próstata andrógeno-insensitive em uma forma mediada em parte pela CB

receptores 1 [18], [19]. Por outro lado, a inibição da síntese de 2-araquidonoilglicerol ou transfecção de células com hidrolase de amida de ácido gordo (FAAH), a enzima responsável pela hidrólise da anandamida, aumenta a invasividade de células PC-3 in vitro [18], [20]. Estes dados são consistentes com a noção de que o sistema do BCE, para além de ter uma grande variedade de outras propriedades reguladoras no corpo [21], desempenha um papel no controle local de disseminação de células de cancro.

O inverso do papel regulador do sistema BCE descrito acima é a possibilidade de que o sistema do BCE é disfuncional em tumores e que isso contribui para a patogênese da doença. Diversos estudos relataram que os marcadores do sistema BCE mostram uma expressão alterada em tipos de cancro, como o linfoma de culas do manto e cancro colorrectal [22] – [24], embora o sentido da alteração não é sempre o mesmo. Em um pequeno grupo de casos com câncer hepatocelular, por exemplo, uma baixa expressão de CB

receptores 1 está associada a um pior resultado do que nos casos com uma alta expressão de CB

1 receptores [25], ao passo que o inverso é verdadeiro para o câncer de pâncreas [26] e estágio do câncer colo-retal II microssatélites-estável [24]. No caso do cancro da próstata, tanto CB

1 receptores e FAAH são sobre-expressa no tecido do tumor em comparação com o tecido não maligno luminal células epiteliais ou [20], [27] – [29] e em um grande bem caracterizado coorte de pacientes com um longo follow-up, observamos uma maior frequência de casos graves (escore de Gleason 8-10) entre os casos com um CB alta tumor

1 receptor e /ou FAAH imunorreatividade [27], [29] . Além disso, para os casos seguidos pela esperança após o diagnóstico, CB tumor imuno

1 receptor (CB

1IR) fornece informação prognóstica robusta em relação a sobrevida específica da doença que é aditivo ao proporcionado pela escala de Gleason [27]. Assim, por exemplo, para os casos com escores de Gleason 6-7 no momento do diagnóstico, as probabilidades de 15 anos de sobrevida livre de eventos para CB1IR pontuações

vs.

≥ a pontuação mediana, respectivamente, foram de 85 ± 9%.

Embora o estudo acima claramente associa uma alta CB

1 receptor ± 9% vs. 44 [27] expressão com a gravidade da doença e os resultados no cancro da próstata, não fornece informações mecanicista a respeito de porque este é o caso. Um possível mecanismo é que o sistema BCE “switches” de ser prejudicial para as células cancerosas da próstata em baixa a moderada níveis

1 expressão do receptor CB a promover a sua sobrevivência em níveis de expressão elevados. A base teórica para esta sugestão vem de um estudo utilizando células de rato astrocitoma [30]. Neste estudo, as células foram transfectadas com plasmídeos contendo um gene repórter (eGFP, uma proteína fluorescente verde) e, ou nenhum, CB

1 ou

2 receptores. Os clones com baixa a moderada ou níveis elevados de receptor foram então seleccionados e tratados com o agonista do receptor de CB CP55,940. Em níveis baixos a moderados de receptores, o agonista causou apoptose, devido em parte a uma estimulação prolongada da via de sinalização de Erk. No entanto, os clones com níveis de expressão do receptor de alta mostraram, adicionalmente, uma activação da via de sinalização de Akt em resposta ao agonista do receptor CB. Esta via é uma via de “sobrevivência” regulação da proliferação celular e apoptose, e as células com níveis de expressão do receptor de elevada CB não apoptose na presença do agonista do receptor de CB, a menos que Akt foi inibida concomitantemente [30].

embora o estudo acima fornece uma explicação elegante quanto às razões pelas quais a expressão do receptor de alta CB pode ser prejudicial, se baseia em clones astrocitoma transfectadas seleccionadas em vez de câncer de próstata. No entanto, o relatório de que os agonistas do receptor de canabinóide Δ

9-tetra-hidrocanabinol e

R

– (+) – methananandamide aumentar a produção de Akt fosforilada (pAkt) em células PC-3 de um modo bloqueado pela CB

um receptor agonista inverso rimonabant, e que a concentração de Δ

9-tetra-hidrocanabinol usado (100 nM) aumenta a proliferação-3 PC de células [10] indica um “Akt-switch” (ou seja, um acoplamento de CB

1 aos receptores da via de sinalização de Akt) é operativo nesta linha de células sob as condições utilizadas por aqueles autores.

Se a associação de um elevado CB

expressão do receptor de 1 com a gravidade da doença do cancro da próstata e o resultado é o resultado de um interruptor para a sinalização mediada por AKT, certas predições podem ser feitas: em primeiro lugar, os casos com um CB alta tumoral

um receptor de expressão seria esperado ter uma actividade mais elevada na via de Akt e, portanto, deve haver um positivo correlação entre a CB

pontuações 1IR e pontuações pAkt-IR no tecido tumoral. Em segundo lugar, as taxas de proliferação do tumor deve ser mais elevada em casos com elevada CB

1IR e pAkt-IR (i.e., em que um “interruptor” pode estar operativo) do que nos casos em que uma ou ambas destas duas variáveis ​​é baixo. Em consequência, no presente estudo, foram utilizados dados do nosso tissue microarray do cancro da próstata para explorar a interação entre CB

1 receptores e da via de sinalização Akt.

Métodos

Material do Paciente e imunoquímica

o tumor pEGFR-IR e pontuações de pAkt utilizados no presente estudo foram tomadas a partir de sua base de dados e foram publicados anteriormente [31], [32]. O material tecido (, amostras embebidos em parafina fixadas em formalina) foi coletado no Hospital Regional, Västerås, Suécia, entre 1975 e 1991, de um total de 419 pacientes diagnosticados com câncer de próstata em ressecção transuretral para os sintomas do trato urinário inferior [33]. Os pacientes foram acompanhados até 2003. microarrays de tecido foram construídos e, em geral, entre 1 e 8 núcleos (normalmente 5, incluindo áreas primário e secundário grau de Gleason; tecido tumoral) e 1-4 núcleos (tecido não maligno) pode ser marcado para o parâmetro em questão. Os núcleos foram pontuados com base na intensidade e distribuição para dar um valor que varia entre 0-4 compósito para pAkt-IR e 0-5 para pEGFR-IR 0-5 [31], [32]. dados inéditos para tumor ErbB2-IR (intervalo 0-4) foi também disponíveis no banco de dados. Em todos os casos, os núcleos foram marcados por investigadores que eram cegos para os dados do paciente. Os dados clínicos (a pontuação de Gleason, a pontuação tumor local, a presença de metástases ao diagnóstico como avaliado por uma varredura do osso, bem como a percentagem da amostra que continham tumor (% aa)) eo índice de Ki67, uma medida da proliferação celular foram todos disponíveis no banco de dados (ver [33], [34] para os relatórios publicados sobre algum deste material). O comitê de ética de pesquisa da Umeå University Hospital (Ethical Review Board Regional em Umeå, Suécia) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento informado.

Uma vez que o CB originais

pontuações 1IR foram devolvidos por uma investigador única usando um 0-3 escala [27], nós somos eleitos para Rescore os núcleos imunomarcadas tumorais ( “BCN

1IR”), mas desta vez usando imagens digitalizadas, dois investigadores independentes (MC, CJF) e da mesma faixa de intensidade à medida que utilizado para pAkt-IV [32]. As distribuições em cada intensidade foram marcados como 0, 25, 50, 75 ou 100%. Assim, por exemplo, um núcleo marcou a 25% da intensidade de 1, 25% da intensidade de 2 e 50% da intensidade de 3 para o biomarcador em questão iria marcar 0,25 × 1 + 0,25 × 0,5 × + 3 = 2,25. Um investigador (MC) também marcou os núcleos não-malignas. Para 2594 núcleos marcados por ambas as investigadores (incluindo alguns núcleos não-malignas, inadvertidamente, marcados por CJF), uma análise de correlação intra-classe usando um modelo misto e teste de consistência deu alfa de Cronbach de 0,94, e 1.837 (71%) de os núcleos foram marcados ≤0.5 unidades um do outro. Tendo em conta que núcleos com coloração em algum lugar entre as unidades de intensidade (0, 1, 2, 3 e 4) e as parcelas de distribuição (0, 25, 50, 75 e 100%) utilizados não são incomuns, a diferença na pontuação de até 1 pode ser aceite. Um total de 95 (3,7%) dos núcleos teve diferenças nas pontuações superiores a 1. As diferenças nestes casos pode ser devido, por exemplo, devido a erros tipográficos ou padrões de imuno que eram difíceis de marcar. Em consequência destes foram recodificados, mais uma vez de forma independente e sem acessar as notas anteriores. Após a rescoring, 6 núcleos foram descartados devido à má qualidade (ou seja, não considera pontuação-able por ambos os investigadores), 88 núcleos já tinha pontuações dentro de 1 unidade do outro, e apenas 1 núcleo com uma diferença de pontuação superior a 1 permaneceu. Por conseguinte, foi excluída deste núcleo. O grande número de núcleos analisados ​​reflectiu o facto de várias lâminas foram coradas mais de uma vez, já que um erro técnico (falta de coloração) foi suspeitado nos primeiros três a quatro linhas do primeiro conjunto de núcleos em cada slide. Isto foi confirmado quando as pontuações individuais foram analisados: a distribuição dos escores para as posições 1-4 para o primeiro conjunto de núcleos foi consideravelmente esquerda deslocada (ou seja, muitas dezenas de 0-1 devolvidos) na primeira corrida em comparação com as execuções subsequentes, Considerando que as distribuições das pontuações para posições 5-fim (7 ou 8, dependendo da corrediça) foram muito semelhantes para os primeiro e subsequentes é executado. Em consequência, as partituras de todas as posições para a primeira execução e primeiro conjunto de pontuações foram descartados. Os valores medianos foram então determinado para as pontuações de cada investigador (somente núcleos sendo marcados por ambas as investigadores foram consideradas), e as pontuações foram, então, em média, antes de ser adicionado ao banco de dados. A correlação entre o CB originais

pontuações tumorais 1IR (escala 0-3) eo BCN

pontuações tumorais 1IR (escala 0-4) foi muito elevada (rho de Spearman = 0,81, P 0,0001 =, n 364) eo ideal (Youden) registos identificado por uma curva Reporter Operado Característica (ROC) do

dados 1IR BCN para os pacientes tratados com a expectativa após o diagnóstico com um 15 anos de corte foi em um split em dezenas de ≤2.75 e . 2.75

Estatísticas

foram utilizados três programas de software de estatística. Os coeficientes de correlação intraclasse, Cox de riscos proporcionais de regressão e de duas etapas análises de agrupamento foram realizadas usando o IBM SPSS versões de software 20 e 21. As análises de regressão ordinais foram realizadas utilizando o software desenvolvido no âmbito do projecto de I para computação estatística (versão 2.15.2) [ ,,,0],35]. Todos os outros cálculos estatísticos foram realizados com o pacote estatístico construído no GraphPad Prism 5 e 6 programas de computador para o Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Para as análises de sobrevivência, um evento foi definida como morte por câncer de próstata e entrou no banco de dados como “evento = 1”, permitindo assim a determinação da sobrevivência específica da doença. Morte por outras causas foi censurada, como foram os casos em que o paciente estava vivo na data do último seguimento. Três casos em que a evolução da doença era desconhecida foram excluídos da análise a sobrevivência.

Resultados

Correlação dos CB

1IR e pAkt-IR nas amostras de tissue microarray cancro da próstata

na Tabela 1, os valores do Spearman Rho são dadas para a correlação entre BCN

1IR e dezenas pAkt-IR nas amostras tumorais. Se um CB alta tumor

1 do receptor de expressão resulta em uma mudança para um Akt [30], uma correlação positiva entre o BCN

1IR e pAkt-IR seria esperado. Este foi realmente encontrado (rho de Spearman = 0,29, P 0,0001, n = 274) para os tumores. Um valor muito semelhante foi visto (rho de Spearman = 0,27) quando o CB originais

pontuações 1IR [27] foram usados ​​no lugar de BCN

1IR. Em teoria, esta correlação, embora significativo, pode ser induzida entre duas variáveis ​​independentes por um terceiro factor: se o parâmetro A, por exemplo, induzida tanto pAkt (utilizando-o como uma molécula de sinalização a jusante) e ao mesmo tempo aumento da síntese de CB

1 receptores, uma correlação entre pAkt-IR e BCN

1IR seria visto. Um candidato óbvio a este respeito seria receptores EGF e os receptores ErbB2 estreitamente relacionados, uma vez que a par de Akt sinalização em células de cancro da próstata [36], [37]. Com efeito, na micromatriz de tecido, as pontuações pEGFR-IR e IR-ErbB2 foram correlacionados com pAkt-IV no tecido do tumor (Tabela 1 e [32]). No entanto, os coeficientes de correlação de primeira e de segunda ordem para pAkt-IR e CB

1IR, calculados como descrito em [38], permaneceu significativa quando controlados para pEGFR-IR e ErbB2-IR (Tabela 1). Não houve correlação significativa entre a não-malignas pAkt-IR e BCN

pontuações 1IR (Rho de Spearman = 0,066, n = 232, P = 0,32).

As pontuações individuais utilizados neste de correlação foram obtidos a partir de 1-8 núcleos tumorais por caso (ver Métodos). No entanto, dado que os núcleos compreendendo um caso de tumores consistem em ambas as áreas de Gleason primárias e secundárias [33], é possível que uma correlação pode ser visto a nível do núcleo, isto é, que um núcleo a partir de um dado caso com um baixo CB

1IR terá um menor pAkt-IR do que o outro núcleo a partir do mesmo caso com um alto CB

1IR (ver Fig. 1A para exemplos de dois núcleos do mesmo caso com CB dramaticamente diferente

1IR) . Em consequência, foi investigada a correlação entre BCN

1IR e pAkt-IR nos núcleos individuais. Tendo em vista o grande número de núcleos marcados para ambos os parâmetros (n = 892), poderíamos dividir os dados aleatoriamente em um conjunto de teste (n = 594) e conjunto de validação (n = 298) de núcleos. Em ambos os conjuntos, uma correlação significativa foi observada, com núcleos no quartil superior da CB

1IR com uma significativamente maior pAkt-IR do que aqueles na parte inferior dois quartis (Fig. 1B, C).

o painel a mostra dois núcleos de tumor do mesmo caso (Gleason score 7) que mostra uma grande variação no CB

intensidade 1IR. Eles tinham posições 1 e 5 da série tumor arrowed. O núcleo esquerda foi marcado 0,75 (50% de marcar 0, 25% escore 1, 25% pontuação 2) por um investigador, e 1 (25% marcar 0, 50% escore 1, 25% pontuação 2) pela outra. O núcleo direito foi marcado 2,75 por ambos os investigadores (50% escore 2, 25% de classificação: 3, 25% marcar 4 por um investigador; 25% escore 2, 75% marcar 3 por outro investigador). Painel B e C mostram as pontuações PAKT para núcleos individuais no teste (n = 595, Painel B) e validação (n = 297, Painel C) conjuntos de dados, divididos em BCN aproximada

1IR quadrantes. O número de casos em cada quadrante é mostrado no gráfico, juntamente com a mediana e gamas interquartil. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 para as comparações mostradas, de outra forma não significativa (teste de comparação múltipla de Dunn seguinte significativa (P . Teste 0,0001) de Kruskal-Wallis Rho de Spearman para as correlações entre o núcleo BCN

1IR eo núcleo pAkt-IR foram de 0,29 e 0,28 (ambos P 0,0001). para os conjuntos de teste e validação, respectivamente

estudos

Associação não indicam a causalidade, mas as informações sobre este pode ser adquirida a partir dos dados por utilização de técnicas de regressão não-paramétricos. uma amostra (80%) do conjunto de dados foi escolhida de forma aleatória e uma regressão múltipla não-linear (npreg no pacote estatístico R) foi, em seguida, executar para ver quais as variáveis eram relevantes e que não foram. Este processo foi repetido 1000 vezes, para identificar variáveis ​​robustamente associados. Quando pAkt-IR foi a variável dependente em resposta a BCN

1IR e pEGFR-IR, as duas variáveis ​​independentes nunca foram excluídos. o mesmo aconteceu quando pAkt-IR foi a variável dependente em resposta a BCN

1IR e ErbB2-IR, e quando BCN

1IR foi a variável dependente e pAkt-IR e quer pEGFR-IR ou ErbB2-IR foram o variáveis ​​independentes. Estes dados não adicionar informações sobre a causalidade. No entanto, quando BCN

1IR foi a variável dependente e pAkt-IR, pEGFR-IR e ErbB2-IR foram variáveis ​​independentes, pAkt-IR foi excluído em 100% dos casos (as outras duas variáveis ​​não foram excluídos). Na análise inversa (quando pAkt-IR foi a variável dependente e BCN

1IR, pEGFR-IR e ErbB2-IR as variáveis ​​independentes), BCN

1IR foi excluído em 80% dos casos, enquanto os outros dois variáveis ​​não foram excluídos. Uma vez que a taxa de exclusão foi maior para pAkt-IR com BCN

1IR como variável dependente do que para BCN

1IR com pAkt-IR como variável dependente, os dados sugerem que o cenário em que a activação da Akt é a jusante da CB

1 receptores é mais provável do que no sentido inverso.

Associação de tumor BCN

1IR e pAkt-IR com a gravidade da doença no momento do diagnóstico

Temos relatado anteriormente que ambos tumor CB

pontuações 1IR e pAkt-IR neste material paciente está associada com a gravidade da doença no diagnóstico [27], [32]. A combinação dos dois parâmetros, no entanto, não foi estudada. Na Fig. 2, os valores individuais para os casos marcou para ambos CB

1IR e pAkt-IR são codificados por cores com base em seus dados clínicos /histopatológico (escore de Gleason, a incidência de metástases ao diagnóstico, estágio do tumor eo índice de Ki67 [a medida da proliferação celular]). Os gráficos são divididos em quadrantes com base nas pontuações medianas para os dois parâmetros. Os gráficos de dispersão servir o objectivo adicional de demonstrar que, embora o coeficiente de correlação entre CB

1IR e pAkt-IR é altamente significativa (ver acima), é um longo caminho na verdade, de explicar a variância biológica do conjunto de dados. Para os casos agrupados como Gleason pontuação 4-5, 6 ou 7, não houve relação óbvia entre a pontuação de Gleason ea posição no gráfico. No entanto, casos com Gleason pontuação 8-10 congregados no quadrante superior direito do gráfico (Fig. 3A). Da mesma forma, os casos em que as metástases foram encontrados no momento do diagnóstico, também tendiam a reunir na parte superior do lado direito do gráfico (Fig. 2B), assim como os casos com uma maior taxa de proliferação celular (Fig. 2C) e o grau do tumor (Fig . 2D).

o índice Ki67 é uma variável contínua que varia de 0-48% no conjunto de dados [34]. As parcelas foram escolhidos aqui para fins ilustrativos, mas representam a parte inferior de 50% ( “Ki67 Low”), a 50-75% ( “Ki67 intermediária”) e os 25% ( “Ki67 alto”). As linhas pontilhadas nos números mostram as pontuações medianas para BCN

1IR e pAkt-IR para o conjunto de dados.

O painel A mostra um gráfico de dispersão dos casos individuais, de modo que os nomes dos grupos em os outros painéis são mais fáceis de seguir. Nas parcelas de Kaplan-Meier exibidos nos Painéis B para D,

† Pca se refere ao número de pacientes que morreram como resultado de seu câncer de próstata durante o período de acompanhamento. Os

2 valores são para os testes de log-rank (Mantel-Cox), com os valores de P apresentados. Painel B, todos os casos; Painel C, Gleason score 4-6 casos; Painel D, Gleason score 7-10 casos.

Os quadrantes nos números são baseados em splits medianos dos dois parâmetros, e análises de contingência dos dados indicou que a distribuição dos parâmetros clínicos foi significativamente diferente nos quadrantes (Tabela 2). Assim, por exemplo, a% dos casos com pontuações Gleason 8-10 variou de 19% (quadrante inferior esquerdo) a 59% (quadrante superior direito) e padrões semelhantes foram observados para a incidência de metástases no momento do diagnóstico, a fase do tumor, a percentagem das amostras que continham tumoral (% de Ca) e o índice de Ki67-(Tabela 2).

Embora dramática, os dados mostrados na Fig. 2 e na Tabela 2 não indicam se as associações entre os dois marcadores bioquímicos e os dados clínicos são simplesmente aditivo, ou se existe uma interacção presente. Isto foi investigado por três dos parâmetros (pontuação de Gleason,% ca eo Ki67-index) por meio de regressão ordinal (modelo logit cumulativo). Para regressões, sem um parâmetro de interacção, as contribuições de pAkt-IR e NCB

1IR foram significativas, como esperado (Tabela 3). No entanto, as contribuições significativas do termo de interação pAkt-IR × BCN

1IR também foram observados para a escala de Gleason e% ca quando foram incluídos na análise (Tabela 3).

Associação dos BCN

1IR e pAkt-IR com a sobrevivência específica da doença

Cerca de dois terços dos casos na base de dados tinha sido seguido pela esperança após o diagnóstico, sendo este o protocolo de tratamento padrão na época, na Suécia. Estes casos podem proporcionar informação útil no que diz respeito à associação de um determinado biomarcador com a sobrevivência de doenças específicas. Este tem sido relatado previamente para ambos pAkt-IR ea CB originais

pontuações 1IR [27], [32]. A interacção entre as duas variáveis ​​tem, no entanto, não foi investigada. A fim de fazer isso, temos usado o cut-offs ideais para os dois parâmetros ( 2,75 e ≥2.75 para pAkt-IR [32] e o valor Youdin de corte para BCN

1IR (≤2.75 e .. 2,75) para todos os 196 pacientes acompanhados pela esperança e teve tanto para BCN

1IR e pAkt-IR (Fig 3A mostra a distribuição dos valores), não havia um padrão claro em que os casos com pontuações de ambos os parâmetros acima do os valores de corte teve um prognóstico pior do que os outros três grupos (Fig. 3b). a análise de regressão de riscos proporcionais de bivariada de Cox indicaram que as informações de prognóstico fornecido pelo BCN

1IR foi aditivo ao fornecido pelo pAkt-IR (Tabela 4). no entanto, isto não é surpreendente, dado que os grupos têm diferentes proporções de casos com diferentes graus de Gleason (ver Fig. 2A). no entanto, com pontuações de Gleason (como uma separação mediana) foram tidos em consideração, os dois parâmetros retiveram a sua aditividade (trivariado análise de efeitos principais, Tabela 4), e isso se reflete nas parcelas de Kaplan-Meier da escala de Gleason 7-10 casos (Fig. 3D). O termo de interação pAkt-IR × BCN

1IR, no entanto, não foi significativa tanto no bivariada ou análises trivariado (Tabela 4).

Discussão

No presente estudo temos explorado o relacionamento entre pAkt e CB

1 em tumores de cancro da próstata e linhas de células, a fim de investigar a possibilidade de que existe um “interruptor de Akt” no cancro da próstata. No início, talvez valha a pena comentar o fato de que a ativação de CB

receptores 1 é aqui considerado em termos de sobrevivência de células cancerosas, ao passo que muitos (mas não todos) os estudos em linhas celulares apontam para efeitos deletérios de canabinóides sobre câncer células de [1] – [5], [39]. No entanto, os efeitos dos canabinoides sobre células tumorais pode ser mais complicada. Isto tem sido demonstrado elegantemente em células de cancro do pulmão NCI-H292 privadas de soro: 300 nM Δ

9-tetra-hidrocanabinol (THC) produz um aumento robusto na proliferação celular, tal como avaliado por um ensaio de incorporação de timidina, enquanto que as concentrações mais elevadas de THC ( 4-10 M) produzir uma apoptose significativa [40]. Um efeito mitogénico de concentrações submicromolares de 50 e 100 nM de THC com a incorporação de timidina foi visto em células de cancro da próstata PC-3 enquanto que 500 nM de THC foi sem efeito [10]. Concentrações mais elevadas de THC produzir apoptose nestas células, embora isto parece ser mediada por um mecanismo independente do receptor de CB [15]. É notável que os estudos que investigam os efeitos antiproliferativos dos canabinóides costumam usar concentrações micro ao invés de nano-molar dos ligantes (para discussão, ver [2], [39]). Finalmente, os antagonistas do receptor de efeitos antiproliferativos do BC

1 /agonistas inversos, tais como rimonabant têm também sido relatados para as linhas celulares de cancro [41], [42], embora não seja claro se estes efeitos são devidos ao bloqueio do BC

1 receptores ou ações fora do alvo dos compostos

Existem duas principais conclusões do estudo, que são discutidos por sua vez:.

CB

1 receptor expressão e de expressão são pAkt correlacionada positivamente no cancro da próstata

Uma das previsões do modelo de switch pAkt é que a expressão de CB

receptores 1 deve ser positivamente correlacionada com pAkt nas células tumorais. pAkt é uma molécula efectora a jusante para uma ampla variedade de vias de sinalização. Isso aumenta o risco de um falso negativo, em que uma associação entre CB

1 e os receptores de pAkt é perdido no ruído. No entanto, uma correlação positiva altamente significativa entre CB

1IR e pAktIR foi visto e a correlação foi mantido no nível de núcleos individuais. Além disso, a correlação permaneceu significativo mesmo quando controlado por dois outros receptores conhecidos para acoplar a Akt, ou seja, pEGFR e ErbB2 [36], [37].

CB

1IR e pAkt-IR associado com a gravidade da doença no momento do diagnóstico

Vários estudos têm investigado a associação de pAkt-IR com a gravidade da doença avaliada pelo escore de Gleason, o estágio do tumor eo índice Ki67 [32], [43] – [46]. Em geral, uma alta pAkt-IV está associado a uma forma mais grave da doença no momento do diagnóstico, embora existam diferenças entre os grupos (para discussão, ver [32]). Com relação à CB

1IR, duas coortes foram investigados. Em nosso estudo, utilizando a presente grande coorte de amostras obtidas no momento do diagnóstico seguintes ressecção transuretral para os sintomas do trato urinário inferior, uma clara associação com o escore de Gleason e as outras medidas histopatológicos foi encontrado [27]. Em contraste, numa (n = 35) coorte muito menor de amostras obtidas a prostatectomia, nenhuma associação clara entre CB

expressão do receptor de 1 (avaliada em experiências de Western blot e por QT-PCR) e o grau de Gleason foi visto, embora os níveis de expressão foram maiores do que a observada para o tecido de controle [28] quer ou não os pacientes receberam outros tratamentos antes da prostatectomia não foi indicado.

Dado que tanto CB

1IR e pAkt-IR estão associados à doença severidade em nossa coorte, seria de esperar que os casos com altos escores de ambos os marcadores teria uma representação excessiva de Gleason pontuação de 8-10 e os outros parâmetros histopatológicos da gravidade da doença. Este foi realmente encontrado. No entanto, no que diz respeito à pontuação de Gleason ea percentagem da amostra que foi associado a tumor, uma interação entre BCN

1IR e pAkt-IR foi visto. A activação de Akt produz uma variedade de efeitos celulares, incluindo a inactivação da proteína Bad pró-apoptótica e um aumento do crescimento de células de cancro da próstata num modelo de xenoenxerto de [47], [48]. Nossas descobertas são consistentes com um modelo em que um elevado CB

uma expressão do receptor alimentar para aumentar Akt sinalização [30], acima de que devido a outras vias de sinalização, aumentando assim a natureza patológica das células de tumor e, portanto, a gravidade da doença . Exatamente como CB

activação 1 receptor alimenta-se para afetar a sinalização Akt poderia ser melhor investigado em linhas celulares de cancro. No entanto, em células de ovário de hamster chinês transfectadas com CB

sub receptores 1, agonistas do receptor CB tais como THC (1 uM), CP55,940 (25 nM) e HU-210 (25 nM) produzem uma activação de Akt robusta.