Abstract

mutações somáticas desempenhar um papel importante na iniciação e progressão tumoral. O estado de mutação de um tumor pode predizer o prognóstico e orientar terapias direcionadas. A maioria das técnicas para estudar mutações oncogênicas exigem alta qualidade e DNA quantidade ou são analiticamente desafiador. Espectroscopia de massa de análise de mutação baseada no entanto, é um método relativamente simples e de alto rendimento apropriado para, (FFPE) material tumoral fixado com formalina embebido em parafina. painéis gene alvo usando esta técnica têm sido desenvolvidos para vários tipos de cancro. Estes painéis hotspot câncer atuais não estão centradas nos genes que são mais relevantes em cancros ginecológicos. Neste estudo, relatamos o design e validação de um painel com base novela, espectrometria de massa especificamente para doenças malignas ginecológicas e apresentar as frequências das mutações detectadas. Usando dados de frequência a partir do catálogo on-line da Somatic Mutações em Câncer, foram selecionados 171 mutações hotspot somáticas nos 13 genes mais importantes para cânceres ginecológicos, sendo

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS , ARN, PIK3CA, ppp2r1a

e

PTEN

. Um total de 546 tumores (205 cervicais, 227 endometrial, 89 ovário, e 25 carcinomas vulvares) foram usados ​​para testar e validar o nosso painel, e estudar a prevalência e espectro de mutações somáticas nestes tipos de câncer. Os resultados foram validados por meio de testes e amostras duplicadas por qPCR específico de alelo. O painel aqui apresentado utilizando espectrometria de massa mostra ser reprodutível e de alto rendimento, e é útil em material de FFPE de baixa qualidade e quantidade. Ele oferece novas possibilidades para o estudo de um grande número de amostras de tumores ginecológicos na prática diária, e poderia ser útil na seleção de terapia guiada

Citation:. Spaans VM, Trietsch MD, Crobach S, Stelloo E, Kremer D, Osse EM , et ai. (2014) Criando um Painel de Alto Rendimento Somatic Mutation Profiling Especificamente para os cancros ginecológicos. PLoS ONE 9 (3): e93451. doi: 10.1371 /journal.pone.0093451

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 18 de dezembro de 2013; Aceito: 04 de março de 2014; Publicação: 26 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Spaans et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Susanne Muller funciona como um cientista para Sequenom, Hamburgo Alemanha. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

genomas do câncer carregam mutações somáticas, eo espectro de mutação varia por tipo de tumor e subtipo [1] , [2]. Avaliando uma ampla variedade de mutações do gene do cancro chave em diversas cancros tem o potencial para a identificação de mutações clinicamente relevantes. Estudos de melanoma, do pulmão, colorectal, e carcinomas da mama têm demonstrado que o estado de mutação somática pode ser utilizado para predizer o prognóstico e guiar as estratégias de tratamento específicos de tumores [3] – [6]. malignidades ginecológicas representam 15-20% de todos os novos casos de câncer em mulheres em todo o mundo, e os números continuam a aumentar [7], mas a carcinogênese de malignidades ginecológicas é diversificada e o papel de mutações somáticas ainda não está totalmente elucidada [1].

ao longo da última década, as mutações somáticas e o seu papel na terapia-alvo foram estudadas em malignidades ginecológicas, mas ainda não na mesma extensão como em outros tipos de cancro tais como cancro da mama e cancro do cólon. profiling mutação de malignidades ginecológicas podem identificar alvos de drogas novas e ajudar a prever o prognóstico do paciente e da resposta do tumor ao tratamento. A pesquisa revelou alterações genéticas que se sobrepõem, bem vias de sinalização afetada semelhantes em diferentes tipos de tumores ginecológicos [8] – [14]

Ao estudar um grande número de material de pacientes, que enfrentar dois tipos de problemas:. Aplicabilidade técnica e especificidade do tumor. Hoje em dia, apenas um número limitado de genes é rastreado na prática clínica. Espera-se que esse número aumente consideravelmente no futuro próximo. Portanto, é necessário um método rápido e confiável para detectar mutações. Esta técnica tem de ser adequado para o ADN extraído a partir de tecido embebido (FFPE) formalina parafina e fixado, o qual é muitas vezes de má qualidade, ou a partir de pequenas biópsias de tecido, o qual é de baixa quantidade. assistida por matriz dessorção /ionização por laser espectrometria de massa de tempo de vôo (MALDI-TOF) provou para atender a todos esses critérios [15] – [17].

Tal como para a especificidade do tumor, atualmente, vários painéis de oncogenes com base em diferentes técnicas são (comercialmente) disponível. Estes painéis foram usados ​​com sucesso no estudo de grandes quantidades de amostras de tumores, a fim de extrair as paisagens de mutações somáticas que caracterizam tipos de tumores [18] – [22]. A selecção de genes e mutações relevantes para os subtipos de tumor levou com sucesso para a criação de painéis específicos de tumor [15], [16], [23]. Até o momento, não há painéis disponíveis que são projetados especificamente para alvejar tumores ginecológicos. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver um painel de mutações de alto rendimento especificado para neoplasias ginecológicas.

Uma meta-análise do COSMIC (Catálogo do Somatic Mutações em Câncer) de banco de dados on-line [24], foi realizado para projetar um MALDI baseada em -TOF, painel de mutações de alto rendimento que cobre mutações somáticas em 13 genes que são mais frequentemente referida como estando envolvida em doenças malignas ginecológicas. Nós testado e validado este painel em um conjunto de 546 do colo do útero, do endométrio, do ovário e amostras de carcinoma vulvar. Aqui, apresentamos o projeto de um painel específico de câncer ginecológico e as frequências de mutações somáticas identificadas usá-lo.

Materiais e Métodos

foram usadas Todas as amostras de tecidos humanos neste estudo de acordo com o médico orientações éticas descritas no Código para uso secundário adequada do tecido humano estabelecido pela Federação holandesa de Ciências Médicas (www.federa.org, uma tradução em Inglês do Código pode ser encontrado here:

https://www.federa.org/sites/default/files/digital_version_first_part_code_of_conduct_in_uk_2011_12092012.pdf).

Patients receber informações sobre o uso secundário de tecido que é amostrado para uso em diagnóstico. Eles podem opor ativamente para uso secundário. Assim com estas orientações, todo o material humano utilizado neste estudo foi anónimos. Por causa deste procedimento anonimização, pesquisa retrospectiva não exige aprovação ética do Conselho de revisão Institucional e permissão dos pacientes individuais não é necessário.

projeto do painel

em primeiro lugar, PubMed e cósmica [24] pesquisas foram realizadas para selecionar genes e mutações para inclusão no painel de mutações específicas do ginecológica. a selecção foi baseada no facto de uma mutação foi repetidamente encontrado para ser mutado em doenças malignas ginecológicas. em segundo lugar, a fim de cobrir uma percentagem elevada das variantes relatados por gene, as mutações mais frequentes foram seleccionadas para se obter um justo ginecológico cobertura específicos de -tissue, como apenas as mutações de ponto de acesso eram adequados para análise com a técnica de MALDI-TOF. Procurou-se seleccionar genes nos quais há pelo menos um dos tipos de cancro ginecológico estudadas (por exemplo, vulvar, cervical, endometrial ou câncer de ovário), pelo menos 30% de todas as mutações relatado ocorreu em menos de 10 locais diferentes no gene

Estabelecer uma ginecológica ‘hotspot’ painel específico gene -. GynCarta 1.0

Consulting PubMed e bancos de dados COSMIC mostrou claramente uma sobreposição em dez melhores genes mutados no colo do útero, endométrio e do ovário. Poucos estudos de mutação somática têm sido realizados sobre o câncer vulvar e, portanto, para este tipo de tumor, invocados frequências encontradas em tipos de tumores semelhantes (por exemplo, carcinoma de células escamosas da pele em outros sites, e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço). Os genes mais frequentemente mutado que preencheram os critérios de inclusão foram selecionados para o painel. O primeiro painel nós designado ‘GynCarta 1.0’ (Sequenom, Hamburgo, Alemanha) consistiu de 89 ensaios (12 multiplexes) para detectar 154 mutações em 12 genes que preencheram os critérios de inclusão:

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS, ARN, PIK3CA

, e

PTEN

.

projeto Ensaio

MySequenom.com on-line foram utilizadas ferramentas de design de ensaio para a concepção do somáticas ensaios de detecção de mutações. Um nível multiplex máximo de 12 ensaios por poço foi aplicado. Se possível, os picos de extensão alelo mutante foram concebidos como detectado pela primeira vez picos de alelos e os picos de extensão do tipo selvagem como o último detectados picos de alelos para reduzir o perigo de falsos positivos a partir de produtos de adição de sal. Todos os ensaios foram validados no DNA tipo selvagem, controlos negativos e selecionou amostras de mutações positivas conhecidas.

Detecção de Mutação

detecção de mutações foi realizada no Centro Médico da Universidade de Leiden seguindo o protocolo do fabricante (Sequenom, Hamburgo , Alemanha), como descrito anteriormente [29]. Resumidamente, o ADN do tipo selvagem e mutante foi amplificado por PCR em multiplex. Fosfatase alcalina de camarão tratamento nucleótidos excedentes inactivado. A reacção de extensão do iniciador (Iplex Pro) foi realizada com os nucleótidos terminadores modificados em série, e o produto foi manchada sobre uma SpectroCHIP (Sequenom, Hamburgo, Alemanha). alelos mutantes e de tipo selvagem foram então discriminados utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa.

A análise dos dados

Os dados foram analisados ​​com o software MassARRAY Tipos Analyser (TYPER 4.0.22, Sequenom, Hamburgo, Alemanha). As mutações foram detectados por um limiar mínimo de 5% do pico do alelo mutante. Três investigadores cegos para a identificação do tumor revistos manualmente a saída, e uma determinação consenso foi alcançado. As análises estatísticas foram realizadas com estatísticas IBM SPSS Data Editor versão 20.0. Os estudantes independentes

t

-test foi utilizado para comparar variáveis ​​iniciais, eo teste exato de Fisher foi usado para analisar dados numéricos categóricas e normalmente distribuído.

P

-Valores ≤0.05, correspondendo a intervalos de confiança de 95%, foram considerados estatisticamente significativos. Todos os testes foram bicaudais.

Amostras

Em primeiro lugar, um conjunto de treinamento de 51 amostras de FFPE (26 cervicais, 17 de endométrio, ovário e 6 2 amostras de câncer vulvar) foi utilizado para testar a eficácia do painel concebido. Após ajustamentos técnicos menores e melhorias do painel, o número de pacientes para cada tipo de tecido foi estendido.

No total, o DNA de 548 amostras tumorais de cervical (

N =

209), endometrial (

N =

227), ovário (

N =

89) pacientes com carcinoma, e vulvar (

N =

25) foi isolado. Duas amostras de cancro do colo do útero não para todos os ensaios de espectrometria de massa e foram excluídos da análises posteriores. Os seguintes parâmetros da linha de base foram coletados: idade, FIGO (Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia) fase, o diagnóstico histopatológico, tumor de grau se for o caso, e papilomavírus humano (HPV) de positividade e digite nos casos de tumores cervicais e vulvares (Tabela 1)

isolamento de ADN

DNA foi isolado de blocos de tecido FFPE para 505 amostras e a partir de (FF) tecido fresco congelado por 43 carcinomas ovarianos. Três a cinco 0,6 mm de diâmetro de tecido núcleos de comprimento variável foram tomadas a partir dos blocos de FFPE a partir de uma área seleccionada compreendendo células tumorais ~ 70%. Em 34 amostras, as células de tumor foram distribuídos de forma difusa, e, por conseguinte, de micro-dissecção foi realizada em 10 secções coradas 10 mícrons-hematoxilina para obter uma elevada percentagem de células tumorais. o isolamento de ADN foi realizada como descrito anteriormente [25], seguido por purificação de ADN (kit de tecido NucleoSpin, Machery-Nagel, Alemanha) ou foi realizada totalmente automatizado usando o Preparação de tecidos do sistema (Siemens Healthcare Diagnostics, Nova Iorque, EUA) [28].

qualidade do DNA

DNA de todas as amostras foi isolado e testado para a qualidade; 493 (90%) das amostras teve ≥1 para a qualidade do ADN utilizando PCR, e esta foi considerada suficiente. Duas amostras, ambos os carcinomas do colo do útero com uma pontuação de 0 a qualidade do DNA, falhou em todos os ensaios, dando uma taxa de sucesso de 99,99%. Ambas as amostras foram excluídos de análises posteriores. Em geral, as amostras com DNA de baixa qualidade eram mais propensos a falhar em alguns ensaios, mas 27 dos 48 amostras (56%) com pontuação de 0 a qualidade do DNA foram analisados ​​com sucesso em todos os ensaios, e 40 de 48 (83%) de baixo as amostras foram analisadas de qualidade com êxito em mais de 90% dos ensaios. A percentagem de amostras analisadas com sucesso não diferiram significativamente entre FFPE e amostras congeladas frescas. Isto confirma que o método de detecção da mutação MALDI-TOF é altamente adequada para a análise de ADN de menor qualidade, FFPE-extraída.

Validação

No total, 546 amostras de tumor foram incluídos neste estudo. Para avaliar a reprodutibilidade do ensaio, 57 (10%) amostras foram testadas em duplicado e outro 26 (5%) em triplicado. Das mutações inicialmente detectadas nestas amostras, 95% (40/42) foi confirmada em duplicado e 97% (30/31) foi confirmada em triplicado. Non-modelo (

N

= 4) e DNA de leucócitos tipo selvagem (

N

= 2) controles foram incluídos em cada multiplex para obter espectros tipo MALDI-TOF negativo e selvagem. Além disso, para uma random30% (163 amostras),

KRAS Comprar e

PIK3CA

mutações foram validados utilizando qPCR alelo-específico, como descrito anteriormente [26], em 7 de variantes de mutação de

KRAS

(p.G12C, p.G12R, p.G12S, p.G12V, p.G12A, p.G12D, p.G13D) e 3 variantes de mutação de

PIK3CA

(p.E542K, p. E545K, p.H1047R), e uma taxa de concordância de 99,4% foi alcançada. (Figura 1) O painel GynCarta detectado mais mutações do alelo específico qPCR fez. Isto poderia ser explicado pelo fato de que a espectrometria de massa é capaz de detectar alelos mutantes com uma frequência mais baixa (até 5%) do que a PCR específica para o alelo é (até 20%). O fato de que nós não encontrou quaisquer mutações no DNA de controle do tipo selvagem, ou em qualquer um dos H

2O controles negativos reforça a nossa convicção de que estas mutações adicionais são verdadeiros mutações em vez de falsos positivos.

A concordância entre MALDI-TOF mutação genotipagem (GynCarta, Sequenom, Hamburgo, Alemanha) e alelo-específico qPCR para 3

PIK3CA

e 7

KRAS

mutações foi determinada para 164 (30% do total coorte de 546 carcinomas) amostras para validar os resultados. Concordância foi calculado para todos os jogos de tipo selvagem-wild type (1546 no total) e todos os jogos mutação mutação (45 no total) em todas as reações (164 * 10, 1640 no total). reacções falhadas foram excluídos porque a comparação não era possível (4 * 3 para

PIK3CA Comprar e 4 * 7 para

KRAS

; 40 no total). Isso levou a uma concordância de (1546 + 45) /(1640-40) = 0,994. WT = tipo selvagem; MUT = mutante.

Melhorar o painel e criando GynCarta 2.0

Com os primeiros dados de mutação de GynCarta 1.0 e relatos na literatura de novas mutações oncogênicas, fomos capazes de melhorar a GynCarta 1,0 painel, removendo ensaios de mutações que não foram detectados (

D108Y CDKN2A

, D108XA, Y108XC;

FGFR3

Y373C, A391E, K650Q, K650E, K650T, K650M, S371C;

G13S e

ARN

G13V, G13a, G13D, G13C, G13R, G13S) e pela adição de 10 novas mutações hotspot dos genes já incluídos. Desta forma, a cobertura da

FGFR2

e

PIK3CA

foi aumentada de 59% para 71% e de 72% para 76%, respectivamente. Além disso, os ensaios que mostraram ser difícil de interpretar devido a pequenos picos produto manufacturado foram melhorados. Durante o período de teste e validação,

ppp2r1a

, um novo gene de interesse, havia surgido a partir da literatura [27] – [29]. Nove mutações deste gene também foram adicionados ao painel, criando, assim, ‘GynCarta versão 2.0’. Uma visão completa das mutações incluídos no painel 2,0 mutação do GynCarta é dada na tabela 2, com os ensaios adicionadas em negrito. Os ensaios para GynCarta 2.0 foram organizados de tal modo, que um total de 13 multiplex pode ser utilizada para analisar o painel completo, a concentração dos novos ensaios em 4 multiplexes. Estes 4 multiplexes foram utilizados para analisar as 497 amostras do conjunto de confirmação.

Resultados

As mutações identificadas usando GynCarta 1.0 e 2.0

genotipagem Mutation usando GynCarta 1,0 revelado 395 mutações em 273 (50%) amostras. As maioria das mutações foram detectadas nos carcinomas do endométrio (177 amostras (64%)), seguido de carcinomas do ovário (33 amostras (37%)), carcinomas do colo do útero (67 amostras (33%)), e carcinoma vulvar (5 amostras (20% )).

PIK3CA

foi mutado com mais frequência (122 amostras), seguida pela

PTEN

(97 amostras) e

KRAS

(64 amostras). Nenhuma mutação foi encontrada em

BRAF

e

FOXL2

genotipagem Mutation usando GynCarta 2.0 detectado um adicional de 36 mutações:. 4 em

FGFR2 Comprar e 5 na

PIK3CA

.

ppp2r1a

mutações foram detectados em 27 amostras (7 cervicais, 18 de endométrio, ovário e 2 0 amostras vulvares).

Uma vez que o painel versão 1.0 e 2.0 teve alguns ensaios que se sobrepõem, fomos capazes de comparar os resultados de ambos os painéis. Não detectamos nenhuma chamada de mutação discrepantes, mas fomos capazes de analisar ensaios que eram difíceis de interpretar em GynCarta 1.0, porque esses ensaios tinha melhorado em GynCarta 2.0. Obtivemos também a saída bem-sucedida para 3 amostras que falharam em GynCarta 1.0. As frequências de mutação para cada locus são resumidos no Quadro 3. O espectro de mutações é visualizada na figura 2.

e O espectro de frequências de mutações identificadas utilizando MALDI-TOF em 546 carcinomas ginecológicos. O espectro de mutação é mostrado (de cima para baixo) para cervical (

N

= 205), endometrial (

N

= 227), ovário (

N

= 89) e carcinomas vulvares (

N

= 25). Da esquerda para a direita,

N

é o número de amostras com a mutação, “%” é a percentagem de amostras mutantes dentro da coorte, e barras representam as percentagens graficamente: azul, 4 mutações por amostra (

N

= 6); vermelho, 3 mutações por amostra (

N =

29); verdes, 2 mutações por amostra (

N =

65); e amarelo, uma mutação por amostra (

N =

189).

As frequências de mutação detectadas foram comparados com os números previstos de mutações com base nas frequências indicadas na banco de dados CÓSMICA [23], e corrigida para a cobertura do painel (Tabela 4).

PIK3CA

mutações foram detectadas duas vezes mais que previsto no cancro do colo do útero (

N

= 23 previsto e

N =

51 detectado) e no câncer endometrial (

N

= 32 previsto e

N =

71 detectado).

PTEN

mutações também foram detectados com maior freqüência no câncer endometrial do que o previsto (

N =

35 previsto e

N =

104 detectado). No entanto, nenhum

PTEN

mutações foram detectadas em câncer vulvar embora

N =

8 mutações foram previstos [19].

Além disso, nenhum

BRAF

ou

FOXL2

mutações foram detectados nesta coorte, apesar da alta cobertura de ambos os genes pelo painel. Isto poderia ser explicado pelo facto de

FOXL2

está fortemente associado com tumores de células da granulosa do ovário [30], um subtipo de cancro do ovário, que foi incluído na nossa coorte de estudo

GynCarta 2.0. pode ser utilizado para diferenciar tipos de tumores

uma ilustração visual resumindo as frequências de mutação nos diferentes tipos de tumor é mostrada na Figura 2. Como se mostra na figura 2, tumores ginecológicos mostram sobreposição considerável em mutações somáticas, que os perfis de tecidos específicos também pode ser apreciado.

cancros do endométrio tem a mais alta frequência de mutação, com 78% das amostras que transportam pelo menos uma mutação. Como previsto, os genes mais frequentemente mutados em cancros ginecológicos são genes da via de pAKT /mTOR, mas dentro desta via, as frequências de mutação variar entre tipos de tumores. Para o câncer de ovário,

KRAS

é o gene mais frequentemente mutado (18%), enquanto

PIK3CA

é o mais afetado no cancro do colo do útero (24%) e

PTEN

em endometrial cancro (39%). Embora os números de carcinomas vulvares são incluídas pequenas, cancro vulvar parece ter um espectro mutacional diferente, em comparação com outras doenças malignas ginecológicas com

CDKN2A

(12%) e

HRAS

(8%) mais frequentemente afectadas.

Uma diferença interessante pode ser observado quando se compara

PIK3CA

distribuição entre os cancros cervicais e os outros tipos de tumores. Em endometrial (e de ovário),

PIK3CA

mutações são encontrados com mais freqüência em hotspots localizados no exão 9 e exão 20, com uma distribuição uniforme entre esses exons (33% e 45%). No cancro do colo do útero no entanto, as mutações ocorrem quase exclusivamente em loci no exão 9 (47 de 50 (94%)

PIK3CA

mutações). Esta diferença clara (

p Art 0,0001) pode ser utilizado na prática clínica, ao diferenciar o cancro cervical primária de câncer endometrial primária

Discussão

A demanda por câncer individualizada. a terapia tem aumentado nos últimos anos. Novas técnicas de genotipagem permitir que os tumores sejam caracterizados com base em seus perfis genômicos, que revelou novos alvos para o tratamento específico do tumor, desde insights sobre a resposta do tumor à quimioterapia e radioterapias, e ajudou a prever o resultado do paciente [3] – [6], [ ,,,0],9], [12], [14]. malignidades ginecológicas são responsáveis ​​por 15-20% de todos os tumores malignos em mulheres em todo o mundo [7]. As consequências clínicas de mutações somáticas em várias malignidades ginecológicas ainda não são totalmente compreendidos. No presente estudo, foi elaborado um painel que é altamente específica para uma ampla gama de cancros ginecológicos, para investigar o espectro de mutações específicas do tumor de 162 mutações de 13 genes. Usando este painel, verificou-se que nesta série de mutações somáticas estavam presentes em 36% de todos os carcinomas do colo do útero, em 78% dos carcinomas do endométrio, em 37% dos carcinomas do ovário e em 20% dos carcinomas vulvares.

somática Os espectros de mutação foram investigados anteriormente em cancros ginecológicos também usando MALDI-TOF [17], [18], [22], [31] – [33]. No entanto, a maioria desses estudos utilizaram painéis do gene do cancro genéricos com base nas frequências indicadas em todos os tumores sólidos ou utilizados painéis pré-existentes que foram projetados para oncologia geral [17], [22], [31] – [33]. Estes, painéis disponíveis comercialmente pré-existentes não são ajustados para o campo da oncologia ginecológica, com a desvantagem de conter genes que não estão envolvidos em cânceres ginecológicos, tais como

FLT3

e

KIT

, ou omitindo genes que mostraram estar envolvido relativamente freqüente em câncer ginecológico, como

PIK3CA

. Por conseguinte, foi criado um painel de mutação à base de MALDI-TOF concebido especificamente para detectar uma grande variedade de mutações de ponto de acesso os mais comuns que foram relatados em diferentes tipos de tumores ginecológicos. painéis de mutação semelhantes foram projetados especificamente para melanomas, carcinomas do cólon e cancro do pulmão de não pequenas células [15], [16], [20]. Usando um painel específico ginecológico, estudamos apenas as mutações relevantes, incluindo, por exemplo,

PIK3CA

e

ppp2r1a

que não são incorporadas em painéis gerais, tais como o OncoCarta (Sequenom, Hamburgo, Alemanha) e com uma melhor e mais específico de cobertura (por exemplo,

CTNNB1

). Como resultado, as frequências indicadas de gene envolvimento podem diferir substancialmente. Por exemplo, em nossa série de cancro do endométrio, um

foi detectado KRAS

taxa de mutação de 17%. Isto está em contraste com o estudo de Cote et al [32] que, utilizando um painel de onco-genérico, relata um

KRAS

taxa de mutação de apenas 1% em cancro do endométrio. De outros estudos utilizando diferentes técnicas, sabe-se que

KRAS

é mutado em 15-20% de todos os cânceres de endométrio [18], [34]. Este exemplo mostra que a fiabilidade dos estudos que utilizam uma abordagem MALDI-TOF é seriamente influenciada pela escolha e a extensão da cobertura dos genes incorporados no painel.

cobertura satisfatória dos genes no nosso painel foi conseguida por as mutações estudadas, e os espectros de mutação gerada neste estudo são, portanto, uma representação fiável das frequências de mutação em tumores ginecológicos nos genes que são selecionados para este painel. No entanto, alguns genes relevantes, tais como

TP53

e

ARID1A

, [8], [13], [34] – [39] não foram incluídos no nosso painel, porque não fez cumprir o critério de um “gene de ponto de acesso”. Ambos os genes têm mutações espalhados amplamente em todo o gene e foram, portanto, não é adequado para uma abordagem MALDI-TOF. Há alguns loci no

TP53

e

ARID1A

que são mais frequentemente mutado; no entanto estes abrangem não mais do que 20% de todas as suas mutações conhecidas. Incluindo alguns desses loci em nosso painel seria subestimar a verdadeira freqüência de mutações desses genes em cancros ginecológicas. Suas frequências de mutação poderia ser melhor estudados usando outros métodos de detecção, tais como seqüenciamento Sanger ou no próximo sequenciamento geração (NGS).

Fizemos decidir incluir 22 ensaios para o gene supressor de tumor

PTEN

, resultando em uma cobertura de 40%, o que poderia ser considerada sub-óptima utilizando esta abordagem. A frequência de mutação aqui relatado é provável, portanto, subestimando a verdadeira freqüência de mutações somáticas de

PTEN

. Além disso, a perda de PTEN também pode ser causada por outras alterações moleculares, tais como LOH e hipermetilação do promotor [40]. Portanto, o uso adicional de outras técnicas como a imunohistoquímica é aconselhável avaliar o verdadeiro estado das PTEN.

CDKN2A

não é verdadeiramente um gene mutado hotspot também, mas ele foi adicionado ao painel devido à sua elevada relevância previsto no cancro vulvar, e porque se esperava para se obter uma cobertura justa do gene. Tumores incluídos no banco de dados COSMIC freqüentemente mostram perda completa de, ou grandes deleções no

CDKN2A

gene, um tipo de mutação que não é facilmente detectável por espectrometria de massa MALDI-TOF. No entanto, desde

CDKN2A

mutações em carcinoma de células escamosas da pele são relatados para ser mais frequentemente mutações pontuais de (grandes) exclusões, acreditamos que a adição de

CDKN2A

mutações pontuais para o painel pode dar informação valiosa, especialmente para câncer vulvar. Embora os números são muito baixos, os resultados de pesquisa sobre

CDKN2A

imutations em vulvar e carcinoma de células escamosas do pênis reforçar esta hipótese [41].

FBXW7

parece ter um baixo cobertura de painel, mas este é influenciada pelo facto de que ele tem sido investigada e verificou-se ser mutado em números relativamente pequenos de tumores ginecológicos. Ao considerar o grande número de dados disponíveis de pesquisas em câncer de cólon, a cobertura esperada é de aproximadamente 35%.

As novas tecnologias, como a próxima geração de sequenciamento são capazes de detectar mutações em vários genes, sem pré-selecção e pode, portanto, superar a limitações de uma abordagem espectrometria de massa. Com NGS, genes completos de interesse pode ser analisado e, portanto, todas as mutações serão encontrados. No entanto, a análise bioinformática dos dados produzidos pelo NGS pode ser desafiador e ainda está em desenvolvimento. Além disso, a diferenciação entre as variantes somáticas não patogénicas e as mutações patogénicas pode ser demorado e complexo de [42]. Em comparação, a análise de dados MALDI-TOF é muito mais simples, especialmente quando se analisa mutações com relevância clínica conhecida. O painel que apresentamos aqui abrange as mutações mais frequentes em cânceres ginecológicos, com algumas exceções. Os espectros de mutação temos detectado são comparáveis ​​aos espectros relatados em NGS e estudos exome seqüenciamento que incidem sobre cânceres ginecológicos [8], [43], [44]. Portanto, MALDI-TOF espectrometria de massa tem potencial para uso em um ambiente clínico, para detectar o estado mutacional dos genes relevantes de uma maneira rápida e fiável. Outra vantagem clara de análise de mutação baseado espectrometria de massa é a flexibilidade para adicionar e excluir os ensaios a partir de um painel, como também mostrado neste relatório, para novos insights ou demandas clínicas pode ser adotada facilmente.

A paisagem mutação somática de cancros ginecológicas produzidos por este estudo (figura 2) e pelas bibliotecas de mutação publicamente disponíveis mostram perfis de mutação sobrepostas e distinguir entre tumores ginecológicos. Mutações no PI3K /Akt-via são frequentes e se sobrepõem, porém foram identificadas algumas mutações que distinguem. Um exemplo é a constatação de que

PIK3CA

exon 20 mutações raramente ocorrem em câncer cervical, enquanto eles são um achado freqüente em câncer de endométrio. Este achado pode ser de valor em um ambiente clínico, quando há incerteza sobre a tumores origem primária, particularmente em adenocarcinomas do colo do útero que são HPV negativo e localizado no segmento de baixa uterina do útero. Ele ilustra que a informação mutacional somática pode ser útil para tumores classificando [45].

somática perfis mutação também pode revelar novas perspectivas sobre os tipos de tumores que não se encontram bem caracterizados, no entanto, tal como o cancro vulvar. câncer vulvar é uma doença rara que pode surgir através de um-HPV dependente ou de uma via independente de HPV. A carcinogênese dos carcinomas vulvares independente de HPV é em grande parte desconhecido. No presente estudo, 25 carcinomas vulvares (dos quais 19 tumores HPV-negativos) foram analisados, e um

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, 3

CDKN2A

, e 2

HRAS

mutações eram detectada nos carcinomas de HPV-negativos. Não foram detectadas mutações em qualquer um dos 13 genes investigados nos 6 tumores HPV-positivos. O espectro de mutações de câncer vulvar parece diferente do espectro de outros cancros ginecológicos, mas mostra semelhanças com o espectro de mutações de células escamosas carcinoma do da cabeça e pescoço [46], um tipo de tumor que compartilha características morfológicas e etiológicas com carcinoma epidermóide vulvar . O facto de o cancro vulvar não se coloca em Mullarian originado estruturas, como os outros três tipos de tumor neste estudo faz, também poderia ser uma explicação para as diferenças no espectro que temos detectado. Os resultados do nosso estudo prompt de uma investigação mais aprofundada dos papéis do

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e

CDKN2A

no câncer vulvar.

Em conclusão, nós projetamos, validado e utilizado um romance espectrometria de massa painel de mutação baseado para identificar mutações somáticas em um grande grupo de doenças malignas ginecológicas. Demonstrámos que este novo painel é reprodutível, de elevado rendimento, e adequado para baixa qualidade e quantidade de DNA a partir de amostras de FFPE. Os nossos dados suportam a possibilidade de perfis de mutações somáticas como ferramenta para classificar os tipos de tumores dentro do tracto ginecológica. Além disso, nossos resultados revelaram que a via de sinalização PI3K-Akt é o mais proeminente afetados em malignidades ginecológicas, justificando uma investigação mais aprofundada da

PI3K

/AKT /mTOR segmentação terapias em oncologia ginecológica.