Abstract

Fundo

fator de crescimento derivado das plaquetas aberrante (PDGF) de sinalização tem sido associada com o câncer de próstata (PCA) progressão. No entanto, o seu papel na regulação do crescimento celular CaP e sobrevivência não foi bem caracterizada.

Metodologia /Principais Achados

Usando modelos experimentais que perto imitar fisiopatologia clínica de progressão APC, nós demonstramos que O PDGF é um factor de sobrevivência em células CaP através de regulação positiva de leucemia mielóide-1 de células (Mcl-1). tratamento PDGF induzida translocação nuclear rápida de β-catenina, presumivelmente mediada por c-Abl e de sinalização de p68. Curiosamente, o PDGF promovida a formação de um complexo transcricional nuclear consistindo de β-catenina e -1α elemento indutível por hipoxia (HIF), e a sua ligação a Mcl-1 promotor. A deleção de um elemento de resposta de hipoxia putativo (HRE) dentro do promotor de Mcl-1 atenuou os efeitos de PDGF em Mcl-1. O bloqueio do receptor PDGF (PDGFR) de sinalização com um inibidor farmacológico AG-17 revogada indução PDGF de Mcl-1 e induziu apoptose em células CaP metastático.

Conclusões /Significado

Nosso estudo elucidou um mecanismo de sobrevivência essencial para células APC, indicando que a interrupção do sinal de sobrevivência de PDGF-Mcl-1 pode proporcionar uma nova estratégia para o tratamento de metástases CaP

citação:. Iqbal S, S Zhang, Driss a, Liu ZR, Kim H-RC, Wang Y, et al. (2012) PDGF upregulates Mcl-1 através da activação de β-catenina e Sinalização HIF-1α Dependente em células de cancro da próstata humano. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10.1371 /journal.pone.0030764

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de junho de 2011; Aceito: 20 de dezembro de 2011; Publicação: 20 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Iqbal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa PC060566, American Cancer Society RSG-10-140-01, Emory University Award Comité de Investigação, Seed Grant Kennedy (DW), Instituto Nacional do Câncer concessão 1R43CA141870 (AW), Instituto Nacional do Câncer concede P01 CA98912, R01 CA122602 , Departamento de Defesa PC060866 (LWKC), Geórgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Grant (OK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) da família consiste de cinco isoformas diméricas: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC e -DD [1], que exercem os seus efeitos celulares através de dois estruturalmente semelhante receptores de tirosina-quinase (PDGFR-a e -p), expresso por muitos tipos de células diferentes [2]. A ligação do ligando ao PDGFRs resulta na dimerização e autofosforilação de receptores das cinases, subsequentemente recrutamento certa homologia de Src 2 (SH2) contendo proteínas adaptadoras-domínio (por exemplo, Src, Grb2 e Shc) para resíduos de tirosina fosforilados específicos. Vários cascatas de sinalização, incluindo a proteína quinase Ras-activada por mitogénio (MAPK), fosfolipase-γ e fos-phatidyl-inositol-3′-quinase (PI3K) /Akt, foram caracterizadas como sendo as principais vias a jusante que medeiam as funções de PDGF [3] . Outras moléculas de adaptador (por exemplo, a Fer e Fes tirosina cinase familiar) e factores de transcrição (por exemplo, β-catenina) também estão envolvidos em PDGF sinalização em certos tipos celulares [4], [5], [6], [7], [8].

expressão aberrante PDGF tem sido frequentemente associado ao componente neoplásica de tumores humanos, enquanto PDGFRs são encontrados principalmente no fibroblástica e tumor vascular estroma [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Estas observações sugerem que o PDGF derivado de tumor pode actuar essencialmente como uma molécula de sinalização parácrina, em tumores sólidos. Apoiando esta noção, estudos recentes demonstraram que o PDGF é um factor pró-angiogénico potente, promovendo a admissão e de crescimento de fibroblastos estromais, células perivasculares e células endoteliais, assim, indirectamente afectam o crescimento de tumores, difusão metastática e resistência às drogas [2], [3 ], [14], [15], [16]. Curiosamente, a evidência emergente indicou que o PDGF sinalização autócrina pode também desempenhar um papel importante durante a progressão tumoral. activação mutacional ou co-expressão de ligandos de receptores de PDGF e são capazes de estimular o crescimento de células tumorais e a proliferação em várias malignidades não epiteliais, incluindo glioblastomas e osteossarcoma [17]. Mais recentemente, a sinalização de PDGF autócrino tem sido associada com epitelial para mesenquimal transição (EMT) em células de carcinoma da mama, cólon, próstata e fígado, sugerindo um papel causador da autócrino PDGF sinalização na metástase [7], [8], [18], [19]. No entanto, apesar da correlação bem estabelecida entre desregulada sinalização parácrina PDGF e na progressão do tumor, as funções e mecanismos de sinalização autócrina PDGF em células cancerosas epiteliais permanecem ainda desconhecidos [3], [17].

aquisição de resistência a apoptose é característica de células tumorais metastáticas, que pode conferir vantagens de sobrevivência durante a invasão, metástase e colonização [20]. Recentemente, a sobre-expressão correlaciona-1 de leucemia de células mielóides (Mcl-1), um membro da família Bcl-2, com a progressão do cancro da próstata (CaP) em direcção a metástases ósseas [21]. Neste estudo, que fornecem evidência que o PDGF-BB é um factor de sobrevivência em células metastáticas de CaP por regulação positiva de Mcl-1 de expressão por meio de um mecanismo de sinalização mediada por factores de transcrição de p-catenina e o factor (HIF) -1α hypoxia-inducible.

Materiais e Métodos

Cultura celular

linhas de células CaP Humano Arcap

e, Arcap

M [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), C4-2 [23] e PC3 (ATCC) foram mantidas rotineiramente em meio de t-(Invitrogen, Carlsbad, CA) com soro de bovino fetal a 5% (FBS). Para os tratamentos com as isoformas de PDGF, de células CaP semeadas em placas de 96 poços (3000 células /poço) foram durante a noite, substituído com T-meio fresco isento de soro e incubadas na presença de várias concentrações de PDGF- humana recombinante privadas de soro AA, -AB, -BB (R D Systems, Minneapolis, MN), solução salina, ou de fosfato tamponada (PBS) durante tempos indicados. Recombinante de interleucina-6 humana (IL-6) foi adquirido a R D Systems. Para o tratamento de quimioterapia de droga, o docetaxel (Sanofi Aventis, Bridgewater, NJ) ou sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionado às células e incubado durante 72 h. A proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de proliferação de CellTiter 96 AQ de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI). As células viáveis ​​foram contadas em triplicado utilizando um hemacitómetro e coloração com azul de tripano.

Plasmídeos e pequenos ARN interferentes (siRNAs)

O full-length região do promotor humano de Mcl-1 clonado num repórter de luciferase de pirilampo vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) foi gentilmente cedido pelo Dr. Steven W. Edwards (Universidade de Liverpool, Liverpool, Reino Unido) [24]. O elemento responsivo a hipóxia-(HRE) (fragmento de -900 a -884) construto -truncated foi obtido por digestão do promotor de comprimento completo usando Kpnl (a partir da posição -3914 a -855) e, em seguida, ligado utilizando ADN-ligase de T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA). Ambas as construções de plasmídeos foram confirmadas por análise de sequência. O repórter pHIF1-Luc foi comprado de Panomics (Fremont, CA). TOPFlash e o factor de células T FOPFlash repórteres (TCF) foram obtidos a partir de Upstate (Billerica, MA). plasmídeo pTK-RL foi adquirido a Promega. Humana Mcl-1 vector de expressão (pCMV-Mcl-1) foi obtida a partir de Origene, Inc. humano β-catenina plasmídeo de expressão foi fornecida pelo Dr. Zhi-Ren Liu. EM-ALVO

mais

SmartPool ARNsi contra β-catenina, p68, PDGFR-alfa e PDGFR-beta, e ARNsi de controlo foram obtidos a partir de Dharmacon, Inc. (Chicago, IL). HIF-1a e ARNsi de controlo foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). transfecção transiente de construções de DNA e os siRNAs foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 ou reagentes Oligofectamine (Invitrogen), de acordo com os protocolos do fabricante e os nossos procedimentos publicados [21], [25].

Análise Western Blot

lisados ​​celulares totais foram preparados usando tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). As proteínas nucleares foram extraídas utilizando um kit Novagen (EMD Biosciences, San Diego, CA). análise de imunotransferência, seguido procedimentos padrão [25]. software ImageJ (National Institutes of Health) foi usada para quantificar a expressão relativa de proteína como normalizados para os controlos de carga. Informações para os anticorpos utilizados neste estudo foi descrito na Tabela Suplementar S1.

Immunoprecipitation

O Starter Pack Immunoprecipitation (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) foi utilizado de acordo com a as instruções do fabricante. Os lisados ​​nucleares Total (1 mg) foram imunoprecipitados com 5 coelho ug-anti-HIF 1α anticorpo, anticorpo de ratinho anti-β-catenina, de ratinho anti-c-Abl e anticorpo de coelho anti-p68 (informações suplementares, Tabela S1), ou normal IgG (R D Systems). Uma proteína G-Sepharose /4 Fast Flow grânulos foram adicionados para precipitar as proteínas, em seguida, lavadas e eluídas. As amostras foram depois processadas para análise de Western blot.

imunofluorescência e Imagem Confocal

A imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [21], usando o rato anti-β-catenina, de coelho anti-p68 e anti- anticorpos HIF-1a (Tabela suplementar S1). De qualquer Alexa 488 ou 555 anticorpos secundários (Invitrogen) foram utilizados a uma diluição de 1:500 e foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. A coloração nuclear foi realizada por incubação das células com 0,4 pmol /L 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a lâminas de montagem. As células foram fotografadas em uma Zeiss LSM 510 META. Em todos os casos, quer um objectivo óleo Zeiss Plano de Apo-63x ou 100x foi usada (abertura numérica de 1,3 e 1,4, respectivamente). Todas as imagens mostram expansão contraste realizada no Adobe Photoshop.

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e RT-PCR

O ARN total foi preparado com Qiagen RNeasy Kit (Valencia, CA). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando SuperScript First-Strand ®III Synthesis System (Invitrogen). PCR quantitativa foi realizada pelo sistema LightCycler 480 (Roche Applied Science) utilizando um Brilliant® SYBR® Master Mix verde QPCR (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Para ponto final de RT-PCR, o SuperScript® III One-Step RT-PCR kit (Invitrogen) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante. Os pares de iniciadores específicos são descritos na Tabela Suplementar S2. gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) mRNA foi amplificado com um par de primers descritos anteriormente [25] e utilizados para normalizar as entradas de ARN.

Cromatina imunoprecipitação Assay (CHIP)

O chip sequencial (cHIP-re-chip) experimento foi realizado utilizando o kit do Active Motif re-chip-IT® (Motif Ativo, Carlsbad, CA). Resumidamente, as células foram CaP durante a noite e substituído com meio fresco isento de soro, incubadas com PDGF-BB ou PBS durante tempos indicados privadas de soro. As células foram fixadas 10 min à temperatura ambiente por solução de formaldeído a 1% para as interacções ADN-proteína de reticulação. Cromatina foi cortado durante 8 minutos usando um kit ChIP-IT Expresso enzimática Shearing (Ativo Motif) [25]. Uma porção da cromatina foi invertido e utilizado como ADN de entrada. Para imunoprecipitação, 2? G de anticorpo anti-β-catenina e incubou-se durante a noite, com IgG normal, tal como o controlo (Tabela Suplementar S1). cromatina eluída foi dessalinizada, e uma alíquota foi usada como controlo para a primeira reacção de chip. A reacção de re-chip foi então realizada com 2? G de anticorpo anti-HIF-1α ou com IgG de controlo. Os iniciadores de PCR para a região do promotor em HRE Mcl-1 humano foram descritas na Tabela Suplementar S2. As reacções de PCR foram realizados durante 40 ciclos, com a concentração de iniciador de 10 pmol /20 ul, utilizando o kit AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Invitrogen).

Análise estatística

Todos os dados representam três ou mais experiências . Os erros são S.E. valores da média dos resultados. Para

t-teste

foi utilizado de cada aluno ensaio para comparação estatística com os grupos de controle. Os valores de

p

≤0.05 foram tomadas como uma diferença significativa entre as médias. A análise estatística foi realizada utilizando o software SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL).

Resultados

Mcl-1 é um fator de sobrevivência em células CaP

anteriormente demonstramos que Mcl-1 sobre-expressão está associada a

in vivo

óssea propensão metastático de células CaP humanos, e mais importante, correlacionada com metástase óssea clínica CaP [21]. Consistentemente, utilizando um modelo celular humana CaP Arcap que poderiam imitar de perto a fisiopatologia da metástase óssea em ratinhos imunocomprometidos [26], verificou-se que Mcl-1 expressão foi significativamente aumentada em altamente

células ósseas metastáticas Arcap M, quando comparada com a de as low-invasiva de contrapartida Arcap

células E (Figura 1A). Nossa hipótese é que a regulação positiva de Mcl-1 pode conferir metastáticos CaP vantagens células de sobrevivência, o que lhes permite escapar do destino de apoptose durante a invasão e disseminação e com sucesso estabelecer metástases à distância [20]. Apoiando esta noção, a expressão ectópica de Mcl-1 de células maior resistência ao docetaxel CaP (Figura 1B), uma droga quimioterapêutica utilizada no refractário a hormonas metastático e CaP [27]. Estes resultados indicaram que a regulação positiva de Mcl-1 podem ser responsáveis ​​por, pelo menos em parte, a resistência à apoptose em células metastáticas de CaP.

(A), a expressão da proteína de Mcl-1 na Arcap relacionados com linhagem

E e células Arcap

m. (B) A expressão ectópica de Mcl-1 em Arcap

células M e os efeitos sobre a citotoxicidade docetaxel em Arcap

células M. pCMV: controle do vetor. (C) Painel esquerdo: Os efeitos da dose e tempo-dependente de PDGF-BB sobre Mcl-1 expressão de mRNA em Arcap

células M; Painel médio: análise de qRT-PCR de Mcl-1 de expressão de mRNA em resposta ao tratamento com PDGF-BB em Arcap

células M (24 h); painel direito: Os efeitos do tratamento PDGF-BB (20 ng /mL, 72 h) na Mcl-1 expressão da proteína em Arcap

células M. ImageJ foi usado para quantificar a expressão relativa de Mcl-1 de proteína. (D) Os efeitos da exógeno PDGF-BB sobre a citotoxicidade de docetaxel em Arcap

células M, tal como determinado pelo ensaio de MTS.

PDGF-BB induz Mcl-1 e expressão antagoniza apoptose CaP em células

de forma intrigante, PDGF-BB foi encontrada para induzir significativamente Mcl-1 em células PCA (Figura 1C, a Figura suplementar S1). O tratamento com recombinante humano PDGF-BB aumentou Mcl-1 ARNm numa dose e modo dependente do tempo, apesar de as condições óptimas para a acumulação máxima de Mcl-1 ARNm variaram em diferentes linhas de células APC. A análise Western blot confirmou os efeitos indutivos de PDGF-BB na Mcl-1 ao nível da expressão da proteína. Estes dados identificado PDGF-BB como um novo regulador de Mcl-1 de expressão, que poderia proporcionar um mecanismo de sobrevivência para proteger as células da apoptose CaP. De facto, a adição de PDGF-BB em culturas de células eficazmente CaP antagonizou a citotoxicidade de docetaxel numa gama larga de doses (Figura 1D).

perfil de expressão de PDGF em células autócrino componentes CaP sinalização

Examinámos o padrão de expressão de PDGFs e seus receptores em células de CaP (Figura 2A). As análises RT-PCR demonstrou que as isoformas de PDGF foram diferencialmente expressos ao nível do mRNA, e, entre elas, aumentado PDGF-B e PDGF-D foram observados em

células C4-2 e Arcap M, quando comparado com o LNCaP parentais e Arcap

células E, respectivamente. Consistente com estudos anteriores [19], as células PC3 foram encontrados para expressar elevados níveis de PDGF-D, PDGFR-α e -β. Curiosamente, PDGFR-alfa mRNAs parecia ser expresso em células substancialmente APC, que foi confirmada a nível da proteína por análise de Western blot. Em contrário, embora mRNAs PDGFR-beta foram detectados por RT-PCR na maioria das linhas de células APC, imunotransferência análise só podia confirmar a expressão de proteínas em Arcap

E e Arcap

células M (Figura 2A, painel da direita). Tomados em conjunto, estes dados sugerem uma autócrino PDGF funcional sinalização em certas células APC.

(A) perfil de expressão de PDGFR componentes de sinalização em células APC, tal como analisado por RT-PCR e transferência de Western. (B) Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a fosforilação de PDGFR-α e -β em Arcap

células M. (C) Os efeitos do empobrecimento do PDGFR-α ou /e -p sobre Mcl-1 expressão da proteína em Arcap

células M. As células foram transfectadas com ARNsi específicos do isotipo de segmentação PDGFR-α (painel esquerdo, 30 nM) ou β PDGFR- (painel central, 100 nM), ou uma mistura de PDGFR-α e siRNAs -p (painel direito) para 48 h, durante a noite, e incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 72 h privadas de soro. (D) do painel superior: Os efeitos dependentes do tempo de AG-17 (100 nm) sobre Mcl-1 expressão de mRNA em

células Arcap M; painel inferior: Os efeitos do tratamento AG-17 sobre a expressão de Mcl-1 e PARP clivada na presença (20 ng /ml) ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) em Arcap

células M. (E) Os efeitos da AG-17 tratamento (100 nm, 72 h) sobre a viabilidade de Arcap

E e Arcap

células M.

Um autócrinos medeia sinalização PDGFR PDGF- BB regulação de Mcl-1 em células CaP

Ambos PDGFR-α e -β foram altamente expresso no osso metastático Arcap

células M, e rapidamente fosforilada de um modo dependente do tempo em resposta à estimulação de exógeno PDGF-BB (Figura 2B). Interessante, a depleção de qualquer das PDGFR-α ou -β por ARNsi específicos de isoforma não bloquear o efeito indutivo de PDGF-BB na Mcl-1 expressão (Figura 2C, à esquerda e painéis centrais), sugerindo que a activação de receptores tanto pode ser suficiente para o supra-regulação de Mcl-1. Apoiando esta hipótese, transfecção transiente com uma mistura de siRNAs segmentação tanto PDGFR-α e -β inibiu a expressão basal de Mcl-1, e revogada a indução PDGF-BB de Mcl-1 Arcap

células M (Figura 2C, painel direito ). Alternativamente, o tratamento com AG-17 (Tirfostina), um inibidor farmacológico selectivo de PDGFRs [28], a expressão reduzida de Mcl-1 em ambos os ARNm e os níveis de proteína e markably aumento de clivagem de poli-ADP ribose polimerase (PARP), um indicador de apoptose . Estes efeitos foram atenuados pela presença de PDGF-BB em culturas (Figura 2D). Consistentemente, AG-17 o tratamento com doses baixas (tais como 100 nM) efetivamente induzida apoptose em Arcap

E e Arcap

células M (Figura 2E), indicando um papel fundamental de PDGFR sinalização na sobrevivência das células APC.

β-catenina medeia a regulação de PDGF de Mcl-1 em células CaP

a activação da via β-catenina é um evento a jusante de sinalização de PDGF em certas células cancerosas epiteliais [7], [ ,,,0],8], [29]. A análise Western blot verificou que β-catenina e TCF4, um importante factor de transcrição β-interagindo-catenina [30], foram diferencialmente expressos em células CaP (Figura 3A), sugerindo um funcional β-catenina-TCF4 sinalização nestas células. Na verdade, um promotor TCF artificial foi ativado em ambos os LNCaP-C4-2 e Arcap

E-Arcap

linhagens de células M, e as atividades repórter pareceu estar associado com o aumento da

in vivo

potencial metastático em C4-2 e Arcap

células M (Figura 3B). É interessante notar que tanto β-catenina e TCF4 foram substancialmente apresentada no núcleo de Arcap

E e

células Arcap M (Figura 3A, baixa painel), que exibiu atividades TCF basais significativamente mais elevadas do que qualquer LNCaP ou C4 -2 células (por ~ 100 vezes) (Figura 3B).

(A) perfil de expressão de componentes de sinalização β-catenina-TCF em células APC. atividade de repórter (B) TCF na LNCaP-C4-2 e Arcap

E-Arcap

células M. (C) Painel superior: Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a translocação nuclear de β-catenina em células de>

células M. As células foram transfectadas com β-catenina ou ARNsi de controlo (30 nM) durante 48 h, durante a noite, e incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 72 h privadas de soro. (F) Os efeitos da depleção de β-catenina na actividade repórter Mcl-1 em Arcap

células M. As células foram transfectadas com β-catenina ou ARNsi de controlo (30 nM) durante 48 h, e ainda mais transfectadas com um Mcl-1 repórter humano durante 24 h. Após privação de soro durante a noite, as células foram incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h.

Após tratamento PDGF-BB, a presença nuclear de β-catenina foi aumentado rapidamente nos Arcap

células M (Figura 3C, painel superior). Consistentemente, actividade repórter TCF foi também significativamente aumentada a seguir à estimulação do FCDP-BB, que foi atenuada por pré-tratamento com AG-17 (Figura 3C, painel inferior). Estes dados indicaram que o PDGF-BB activado sinalização β-catenina de um modo dependente-PDGFR.

Para investigar o papel de β-catenina na regulação da expressão de Mcl-1,

sub células Arcap M foram transientemente transfectadas com uma construção de expressão de tipo selvagem β-catenina. RT-PCR e análises de Western blot mostrou que epression ectópica de β-catenina increseased Mcl-1 em ambos os níveis de proteína (Figura 3D) e ARNm. Em contrário, depleção β-catenina utilizando um conjunto de siRNA eficientemente inibida tanto a expressão basal de Mcl-1 e a sua indução por PDGF-BB (Figura 3E). Consistentemente, ao passo que o PDGF-BB induziu significativamente a actividade de luciferase de um promotor de Mcl-1 humano de comprimento completo em Arcap

células M transfectadas com não-alvo ARNsi de controlo, este efeito foi anulada pela depleção transitória de endógena β-catenina (Figura 3F). Estes resultados sugerem que a activação da sinalização de β-catenina pode ser suficiente e necessária para Mcl-1 em células APC.

PDGF activa a sinalização de p68-β-catenina em células de CaP

Nós investigamos se uma via c-Abl-dependente de p68 está envolvido na activação de sinalização de PDGF β-catenina em células de CaP [7]. As análises Western blot verificou que c-Abl e p68 foram diferencialmente expressos em células CaP (Figura 4A). No momento do tratamento de PDGF-BB, a fosforilação da tirosina do c-Abl de p68 e foram rapidamente activado, como evidenciado por ensaios de imunoprecipitação-imunotransferência (Figura 4B, esquerda e painéis de meio). Importante, a presença de β-catenina em imunoprecipitados de p68 também foi aumentada de uma maneira dependente do tempo, o que sugere uma associação física melhorada entre β-catenina e proteínas p68 (Figura 4B, painel do meio), o qual foi adicionalmente confirmada por uma experiência de imunoprecipitação recíproco (Figura 4B, painel da direita). De facto, o PDGF-BB induziu translocação nuclear rápida de p68 dentro de 30 min (Figura 4C), o que foi associado com o aumento da co-localização de p68 e β-catenina no núcleo (Figura 4D). Estes dados indicaram que o PDGF-BB pode activar a cascata de c-Abl-p68 e a subsequente sinalização β-catenina em células APC.

(A) Expressão de c-Abl e p68 em células APC. (B) Painel esquerdo: Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a fosforilação de c-Abl; Painel médio: Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a fosforilação da p68 e a expressão de β-catenina nos imunoprecipitados de p68 em Arcap

células M. Fosforilação de p68 nos sítios de tirosina foi detectada utilizando um anticorpo pan-fosforilada-Tyr; Painel direito: Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a expressão de p68 nos imunoprecipitados β-catenina em Arcap

células M. (C) Os efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a translocação nuclear de p68 em Arcap

células M. (D) confocal microscopia análise dos efeitos de PDGF-BB na co-localização de β-catenina e p68 no núcleo numa experiência ao longo do tempo em Arcap

células M. (E) Os efeitos da depleção de p68 sobre a regulamentação PDGF de Mcl-1 em Arcap

células M. As células foram transfectadas com p68 ou ARNsi de controlo (30 nM) durante 48 h, durante a noite, e incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h (painel superior) ou 72 h (privadas de soro painel inferior). Painel superior: A análise de RT-PCR da expressão de ARNm de p68 e de Mcl-1; painel inferior: Análise Western blot da expressão da proteína de p68, β-catenina e Mcl-1. (F) Os efeitos da depleção de p68 sobre a atividade de repórter Mcl-1 em Arcap

células M. As células foram transfectadas com p68 ou ARNsi de controlo (30 nM) durante 48 h, e ainda mais transfectadas com Mcl-1 repórter humano durante 24 h. Após privação de soro durante a noite, as células foram incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h.

Para examinar se a p68 é necessária para a regulação de Mcl-1 expressão, Arcap

M células foram transfectadas com ARNsi de p68 ou ARNsi de controlo, e analisados ​​para a expressão de Mcl-1 no ARNm e os níveis de proteína. Tal como mostrado na Figura 4E, depleção de p68 endógena inibida β-catenina e eficazmente atenuadas indução de PDGF-BB de Mcl-1 de expressão. Consistentemente, Mcl-1 actividade do promotor foi significativamente inibida pelo tratamento com ARNsi de p68 em Arcap

células M, com ou sem a presença de PDGF-BB nas culturas (Figura 4F). Estes dados indicam uma função indispensável de p68 na regulação de Mcl-1 em células APC.

PDGF-BB promove a interação de proteínas entre β-catenina e HIF-1α em CaP células

O nosso anterior estudos demonstraram um papel importante de HIF-1α em células CaP óssea metastática [25]. Curiosamente, a transfecção de um siRNA de HIF-1α-específica reduzida significativamente de Mcl-1 em expressão de proteína Arcap

células M (Figura 5A), o que sugere que o HIF-1α pode ser necessário para Mcl-1 em células de regulação APC. Para examinar se o PDGF-BB pode induzir a interacção física entre HIF-1α e β-catenina, as proteínas nucleares foram preparados a partir de células

Arcap M tratadas com PDGF-BB durante tempos que variam. A análise Western blot descobriram que tanto o HIF-1α e β-catenina foram aumentou rapidamente no núcleo (Figura 5B). Um ensaio de co-imunoprecipitação mostraram que, em resposta à estimulação com PDGF-BB, a presença nuclear de β-catenina aumentou rapidamente nos imunoprecipitados de HIF-1a (Figura 5C, painel superior). co-imunoprecipitação recíproco com um anticorpo anti-β-catenina confirmou um aumento da associação de HIF-1α nuclear com β-catenina a seguir ao tratamento de PDGF-BB (Figura 5C, painel inferior). A co-localização aumentada de β-catenina e proteínas HIF-1α foi ainda demonstrada por microscopia confocal, que apareceu para conseguir a intensidade máxima aos 30 min após a estimulação com PDGF-BB (Figura 5D). Estes resultados indicaram que, em repsonse à estimulação com PDGF-BB, β-catenina interage fisicamente com o HIF-1α no núcleo, que pode conduzir à activação de Mcl-1 de transcrição em células APC.

(A) O efeitos de depleção de HIF-1α de Mcl-1 em expressão Arcap

células M. As células foram transfectadas com o HIF-1α ou ARNsi de controlo (30 nM) durante 72 h, e analisadas quanto à expressão de Mcl-1 por imunotransferência. (B) análise por Western blot dos efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a translocação nuclear de β-catenina e HIF-1α em Arcap

células M. (C) Ensaios de Co-imunoprecipitação dos efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a interacção entre β-catenina e HIF-1α no núcleo em Arcap

células M. (D) A microscopia confocal dos efeitos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a co-localização de β-catenina e HIF-1α no núcleo em Arcap

células M.

Um motivo HRE putativa é necessária para a ativação PDGF-BB de Mcl-1 promotor

HIF-1α se liga ao HRE

cis

-elements dentro dos promotores de genes de hipoxia-responsive e regula a sua expressão [31]. Foi examinado se a acumulação nuclear induzida por PDGF-BB do HIF-1α foi associada com a activação da transcrição de HRE-dependente. Em Arcap

células M, o tratamento de PDGF-BB aumentou significativamente a expressão de luciferase dirigido por um promotor artificial HRE (pHIF-luc) (Figura 6A). Curiosamente, um motivo putativo HRE foi identificado dentro da região do promotor de Mcl-1 humana, que está localizado entre -900 e -884 nucleótidos na extremidade 5 ‘a montante do local de início da transcrição [24]. Para investigar o papel potencial deste

cis

-element na regulação PDGF de Mcl-1 de transcrição, caracterizamos um mutante de deleção do motivo HRE putativo usando região promotora Mcl-1 humana como o modelo (Figura 6B). A construção resultante repórter (p-Mcl-1-Luc: ΔHRE), ou o repórter de luciferase dirigido por todo o comprimento de Mcl-1 de promotor (P-Mcl-1-Luc), foi expresso transitoriamente em

células Arcap M respectivamente, e tratadas com PDGF-BB ou PBS. IL-6, o que foi mostrado para activar a transcrição de Mcl-1 em células APC e colangiocarcinoma através de um transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (Stat3) mecanismo dependente de [32], [33], foi incluído como controlo positivo. Ensaio de actividade de luciferase mostrou que o PDGF-BB induziu a activação do promotor de p-Mcl-1-Luc para um grau maior do que a IL-6 em Arcap

células M. Significativamente, a eliminação do motivo HRE não só reduziu a actividade basal de Mcl-1 de promotor, mas também anulou os efeitos indutivos de PDGF-BB na actividade repórter. Em contrário, P-Mcl-1-Luc: ΔHRE, contendo uma sequência de ligação a Stat3 na posição entre -92 e -83 [32], manteve-se activada por IL-6 de tratamento (Figura 6C). Um efeito semelhante de HRE supressão da resposta diferencial de Mcl-1 para o promotor PDGF-BB e IL-6 foi também observada em células (C4-2 Suplementar Figura S2). Estes dados indicam que o putativo HRE

cis

-element é necessária para a ativação PDGF-BB de Mcl-1 em células APC.

(A) Os efeitos de PDGF-BB no HIF -1 atividade repórter em

células Arcap M. As células foram transfectadas transientemente com o HIF-1 ou repórter pGL3 durante 24 h, e incubadas na presença ou ausência de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h privadas de soro. (B) Esquema de Mcl-1 promotor humano e a sua mutação de deleção no local putativo HRE. (C) Os efeitos da exclusão do site HRE putativo sobre a regulação PDGF da atividade do promotor Mcl-1 em Arcap

células M. IL-6 (200 ng /ml) foi incluída como controlo positivo. (D) Ensaio ChIP-Re-chip dos efeitos do tratamento de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre a ligação de β-catenina e HIF-1α a região promotora de Mcl-1 humano em

células Arcap m.

PDGF-BB promove a ligação de ambos β-catenina e HIF-1α a região promotora de Mcl-1