Abstract

endotelial (E-) e plaquetas (P-) selectina adesão mediada das células tumorais ao endotélio vascular é um passo crucial da formação de metástases hematogênica. Estudos recentes têm demonstrado que a deficiência de selectina reduz significativamente a formação de metástases

in vivo

. Nós selecionou um E- e P-

S

electin específica

D

NA

A

ptamer (SDA), através de SELEX (

S

ystematic

e

volution de

L

igands por

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enriquecimento exponen-) com um

K

d valor de cerca de 100 nm e a capacidade de inibir a interação entre selectina e os seus ligandos. Empregando câncer humano colorectal (HT29) e leucemia (EOL-1) linhas celulares pudemos demonstrar um efeito anti-adesivo para SDA

in vitro

. Sob condições fisiológicas de tensão de cisalhamento em um ensaio de adesão de fluxo laminar, a SDA inibiu a adesão de células tumorais a dinâmica imobilizada E- ou P-selectina. A estabilidade de SDA para mais do que duas horas permitiu a sua aplicação em ensaios de adesão célula-célula em meio de cultura celular. Quando a adesão de células HT29 para TNFa estimulada por E-selectina apresentam células endoteliais microvasculares de pulmão humano foi analisada, a inibição por meio de SDA pode ser demonstrada como se bem. Em conclusão, a SDA é um potencial novo agente terapêutico que antagoniza a adesão mediada por selectina durante a formação de metástases em tumores humanos

Citation:. Faryammanesh R, Lange T, Magbanua E, Haas S, Meyer C, Wicklein D, et ai. (2014) SDA, um DNA Aptamer Inibidor E- e P-selectina Mediated Adesão de Câncer e células de leucemia, o Primeiro e Passo Pivotal em transendotelial Migração durante formação de metástases. PLoS ONE 9 (4): e93173. doi: 10.1371 /journal.pone.0093173

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de janeiro de 2014; Aceito: 03 de março de 2014; Publicação: 03 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Faryammanesh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Forschungs- und Wissenschaftsstiftung Hamburgo, no Forschungsverbund “superfície celular segmentação”. Grant do Fazit-Stiftung para R. F. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: O aptâmero tem patente pendente;. nomear “DNA-Aptamere, morrem E- und P-Selektine spezifisch binden”, número 2013112212485800DE. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Apesar de todos os avanços da medicina molecular, o tratamento de doença metastática ainda é um problema não resolvido , assim, a mortalidade de cancro continua a ser elevado. Em 2013, cerca de 1,6 milhões incidência de câncer e 580.000 mortes por câncer foram registrados somente nos Estados Unidos [1]. Esta alta taxa de mortalidade é principalmente devido ao fato de que metástase de câncer não podem ser tratados com intenção curativa. Assim, mais de 90% das vítimas de cancro morrem devido a disseminação metastática de células malignas [2]. Assim, o avanço na terapia do cancro depende essencialmente da manipulação terapêutica do processo metastático.

Durante células tumorais formação de metástases haematogeneous têm que aderir e transmigrar o endotélio no sítio alvo da futura metástase. Ao fazê-lo, eles imitam o comportamento de leucócitos normais, visto que utilizam a via do migratória mediada por selectina de leucócitos na inflamação [3], [4]. As selectinas dependente de cálcio são compostos de um domínio de lectina, que é responsável pela ligação ao ligando, um domínio tipo factor de crescimento epidérmico e um número flexível de unidades de repetição de consenso [5], [6]. As células cancerígenas aderem no endotélio através da interacção com endotelial (E-) e selectinas plaquetas (P-) [3], [4] seguintes transmigração para o tecido subjacente e subsequente proliferação (Figura 1). Em um modelo de xenoenxerto do adenocarcinoma pancreático humano, na ausência de E- e P-selectinas levou a uma redução de 85% da carcinomatose peritoneal [7]. Observou-se uma redução semelhante de metastase num modelo de xenoenxerto eosinofílica e mielóide crónica [8] e um modelo de carcinoma colo-rectal, na ausência de ambas as selectinas [4]. Assim, o bloqueio do mecanismo de adesão mediada por selectina em hemática, bem como nas metástases intraperitoneal é de significado clínico e pode ser uma abordagem terapêutica potencial contra eventos fisiopatológicos (Figura 1). Até agora, os anticorpos monoclonais, antagonistas glicomimético [9], e diferentes aptâmeros modificadas [10] – [12] foram testados como inibidores da selectina em ensaios pré-clínicos

disseminação metastática de cancros ocorre através de um processo sequencial. que começa com a invasão de células de tumor primário. Depois de atravessar a membrana basal e a migrar através do tecido conjuntivo adjacente, certas células tumorais intravasate em microvasos de tumor e circular com o fluxo de sangue para órgãos distantes. No futuro local metastático, estas células tumorais circulantes (CTC) são retardadas da corrente sanguínea e aderir ao endotélio vascular. Este passo é crucialmente iniciada por interacções entre selectinas endoteliais e certos ligandos de hidratos de carbono, tais como estruturas de Lewis sialiladas apresentados na superfície da célula tumoral. A adesão é um pré-requisito para o extravasamento e subsequente colonização do tecido metastático. aptâmeros que prejudicam a interação entre ligantes selectina e selectinas endoteliais selectina de ligação seria, portanto, um promissor novo anti-metastático terapêutico.

Os aptâmeros são de DNA ou RNA oligonucle�idos com estruturas tridimensionais definidas exibindo elevada afinidade e especificidade para moléculas alvo. No que diz respeito às suas características de ligação, que são comparáveis ​​aos anticorpos. As vantagens de aptâmeros mais anticorpos são (i) a sua síntese simples e acessíveis, (ii) a possibilidade para a sua armazenagem de longo prazo à temperatura ambiente e, assim, (iii) a sua estabilidade durante o transporte, (iv) as diversas possibilidades de conjugar a outra reagentes e (v) a falta de imunogeni cidade [12]. Aptâmeros são selecionados em um

in vitro

processo chamado

S

ystematic

E

volution de

L

igands por

EX

Enriquecimento exponen- (

SELEX

) por amplificação de ADN ou ARN oligonucleótidos com base na sua afinidade para uma molécula alvo [13] – [15]. A diversidade de oligonucleótidos permite a selecção de aptâmeros para praticamente qualquer molécula alvo. Assim, os aptâmeros são um instrumento adequado para uso médico no diagnóstico e terapêutica.

Começamos a selecionar aptâmeros de DNA visando a sua aplicação médica em inibir a metástase do tumor. Tivemos sucesso na selecção de um aptâmero com elevada afinidade para a E- e P-selectina e testada a ligação às suas moléculas alvo através de ensaios de retenção de filtro (FRA). Para avaliar a capacidade do aptâmero para bloquear a interacção de células de cancro e leucemia com selectinas, foram utilizados ensaios de fluxo laminar, em condições de tensão de cisalhamento fisiológicas, utilizando linha celulares de cancro colorrectal humano HT29, linha celular de leucemia eosinofílica crónica humana eol-1, e pulmonar humano primário células endoteliais microvasculares (HPMECs). Os aptâmeros de ADN seleccionadas inibiram a interacção das células cancerígenas com o endotélio, bloqueando a adesão mediada por selectina. Assim, os aptâmeros selecionados fornecem uma alternativa atraente para os reagentes comparáveis ​​existentes.

Materiais e Métodos

Oligonucleótidos

A biblioteca de DNA inicial usado para SELEX foi comprado de Metabion. Ela consistia de uma região aleatória de 50 nucleótidos flanqueadas por regiões constantes no 5′, bem como extremidade 3 ‘(21 ou 20 nucleótidos, respectivamente) para permitir a amplificação por PCR. Mais oligonucleotídeos foram adquiridos da Invitrogen.

Biotinila�o de E-selectina e imobilização em Dynabeads revestidas de estreptavidina (Beads alvo)

Para a reacção de biotinilação, 50 pg humano recombinante E-selectina /IgG-Fc -chimeras (RH e-selectina; R D Systems) foram incubados com excesso molar de três vezes de sulfo-NHS-LC-biotina (Thermo Scientific) como descrito em detalhe no manual do fabricante. Finalmente, a biotinilado RH E-selectina foi imobilizado em 5 mg de esferas revestidas com estreptavidina magnéticas (Dynabeads; Life Technologies) e suspendeu-se em tampão de selecção (MgCl 3 mM de

2 em tampão fosfato salino (PBS), pH 7,5) incluindo um mg de albumina de soro bovino (BSA) /mL, como anteriormente descrito [16].

Biotina Imobilização em Dynabeads revestidas de estreptavidina (esferas de pré-selecção)

revestidas com estreptavidina esferas magnéticas (5 mg) foram lavados cinco vezes com tampão de lavagem de 500 mL (1 mg de BSA /ml de PBS), ressuspensas em 500 ul de PBS contendo 0,9 mM de biotina, e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. As pérolas magnéticas revestidas de biotina-estreptavidina-lavaram-se cinco vezes com tampão de lavagem de 500 mL, ressuspensas em 1,5 mL de PBS, incluindo 1,25 mg de BSA /ml e foram subsequentemente utilizados para a pré-selecção.

In vitro

seleção de selectina Encadernação aptâmeros de DNA

para

in vitro

seleção de E-selectina DNA específica aptâmeros, foi utilizado o procedimento SELEX (Figura 2), incluindo uma etapa de pré-seleção para remover estreptavidina DNA liga�o ao. Para pré-selecção, 250 pmol de biblioteca de ADNcs (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC- (N)

50-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 ‘) foram incubadas com 30 nmol de grânulos pré-selecção durante 30 minutos à temperatura ambiente. Estreptavidina-ligação de ADN foi removido através de separação magnética. A primeira ronda de selecção foi iniciada por incubação da biblioteca de ADN pré-seleccionado com os grânulos alvo 50 pmol durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do ADN não ligado por lavagem com 200 uL de tampão de selecção, o DNA ligado foi eluído em 55 ul de água por aquecimento da mistura a 80 ° C durante 3 minutos. ADN eluído foi amplificado através de PCR usando 1 uM 5′-biotinilado iniciador reverso (5’-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3 ‘), 1 uM iniciador directo (5′-GCCTGTTGTGfAGCCTCCTAAC-3’), 1,5 mM MgCl

2, 200 ^ M de dNTPs em 1 × tampão de PCR B e 0,05 U de DNA polimerase por FIREPol uL (os dois últimos comprado de Solis Biodyne). Separação dos aptâmeros de ADN de cadeia simples a partir de produtos de PCR de cadeia dupla foi feito por esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Assim, os produtos da PCR foram diluídos 1:02 em 2 × B W tampão (EDTA 1 mM, NaCl 2 M em Tris-HCl a 10, pH 7,5), adicionado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e subsequentemente lavadas duas vezes com 1 × B W tampão. Após incubação durante 15 min à temperatura ambiente os sobrenadantes foram retirados e os grânulos foram novamente suspensos em 150 mM de NaOH a seguir à incubação durante mais 10 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes combinados, contendo o ADN de cadeia simples, foram neutralizados utilizando HCl a 100 mM e utilizada como piscina de início para uma ronda de selecção seguinte. Após a incubação de ADN cadeias simples com destino grânulos as quantidades de etapas de lavagem foram levantadas a partir rodada a rodada crescente severidade.

DNA foi incubado com imobilizada E-selectina rh em esferas magnéticas (esferas de destino). Após lavagem e remoção do DNA não ligado, o DNA ligado foi eluído alvo e amplificado através de PCR. O produto de cadeia dupla PCR foi separado em DNA de cadeia simples eo próximo passo SELEX iniciado após esta regeneração. A identificação de aptâmeros via clonagem e sequenciamento da piscina ssDNA enriquecido foi realizada após várias rodadas de SELEX (10-20 voltas).

Clonagem

Isolamento de aptâmeros selecionados foi realizada por molecular TA-clonagem. Portanto, o vector pUC19-T (pCR2.1-TOPO, Invitrogen) foi restringido com XcmI (Thermo Scientific) para gerar saliências 3 ‘da timidina [17], [18]. Os aptâmeros foram amplificados através de PCR utilizando ADN polimerase FIREPol produzir saliências 5 ‘de adenosina e ligado com o vector utilizando ADN-ligase de T4 (Thermo Scientific). DNA de 50 clones resultantes foi isolado e sequenciado (GATC-Biotech).

Filtro de retenção Ensaio

Filtro de ensaios de retenção (FRA) foram utilizados para determinar constantes de dissociação das interações aptâmero selectina. Portanto, o ADN foi marcado radioactivamente com [ $ \\ quadriculação = “RG1” $ –

32P] adenosina-5′-triphosphte (Hartmann Analytic) utilizando T4 polinucleótido cinase (Thermo Scientific) e purificada através de gel de extracção seguida por precipitação com isopropanol. Para ensaios de ligação, para quantidades constantes de DNA radioactivo ( 1 nM) foi incubada com quantidades crescentes de proteínas correspondentes (0-1 jiM) durante 30 minutos à temperatura ambiente em tampão de selecção. Posteriormente os complexos proteína-aptâmeros foram filtrados (Manifold I Dot-BlotSystem, Whatman) através de um pré-equilibrada (15 minutos em 0,4 M KOH) membrana de nitrocelulose (Whatman) durante 5 minutos em água desmineralizada a temperatura ambiente e, em seguida, lavado em tampão de selecção. Após filtração, a membrana de nitrocelulose foi seco e exposto durante 3 horas, a um ecrã de imagem de fósforo (Bio-Rad). Para a quantificação foi utilizado o modelo de ligação Um site-specific (Quantidade Um software)

Nuclease-resistência para a estabilidade

aptâmero DNA foi marcada radioactivamente com. [-?

32P] adenosine- 5′-triphosphte como descrito acima e incubadas com 100 uL meio completo a 37 ° C. Depois de pontos de tempo definido (0-720 min), 10 uL de cada amostra foram congeladas em azoto líquido e subsequentemente analisadas através de electroforese em gel desnaturante de 10%.

Linhas celulares e condições de cultura

O humana a linha colorrectal célula cancerosa HT29 (adquirido a partir da Colecção Europeia de Cultura celular) e a linha crónica humana de células de leucemia eosinofílica eol-1 (a partir de DSMZ) foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal de vitelo (FCS ), 100 ug de penicilina /ml e estreptomicina 100 ug /ml (últimos reagentes foram adquiridos a partir de PAA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Para todos os ensaios, as células HT29 foram cultivadas até 80% de confluência; células eol-1 foram crescidas em suspensão. células pulmonares humanas primárias microvasculares endoteliais (HPMECs) foram obtidos a partir Promocell, cultivadas em endotelial meio MV crescimento de células suplementado com a combinação suplemento correspondente, tal como previsto pelo fornecedor, e 100 mg de penicilina /ml e 100 g de estreptomicina /mL. HPMECs foram sub-cultivadas utilizando um kit desanexar específica (PromoCell) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos com células primárias foram realizadas durante os primeiros seis passagens.

A inibição da dinâmica Tumor celular Adesão ao Imobilizado E- Humana e P-selectina

Foi analisada a inibição mediada pelo aptâmero de ligando de selectina interação em condições de fluxo laminar representando a tensão de cisalhamento endotelial encontrada em vénulas pós-capilares de órgãos metastáticos, como pulmões [19]. Para este efeito, rh rh E- e P-selectina foram imobilizadas em Ibidi microslides tratar VI (Ibidi) a uma concentração final de 0,02 mg /mL, diluídas em DPBS incluindo Ca

2+ e Mg

2+ ( DPBS

+; PAA) durante 30 min a 37 ° C. Em paralelo como um controlo, as câmaras foram revestidos do mesmo modo com 0,02 mg /ml de IgG-Fc (R D Systems). As lâminas foram lavadas com 50 mL de DPBS e incubados com ou sem aptâmero (0,15 mg aptâmero /mL de DPBS

+) durante 30 minutos à temperatura ambiente. capilares Ibidi lâminas foram lavadas novamente com 50 mL de DPBS

+ e, em seguida perfundidos com 1 × 10

5 células tumorais HT29 por ml a uma taxa de fluxo laminar de 8,5 mL /h [19]. eventos de adesão foram registados e subsequentemente analisados ​​como descrito anteriormente [4], [20], [21].

Inibição de Tumor dinâmica de adesão celular ao endotélio pulmonar humana

Para determinar o potencial inibitório de nossa aptâmero na adesão de células de tumor de cisalhamento resistente à direcção endotélio pulmonar humano, Ibidi microslides tratar VI foram revestidas com monocamadas confluentes HPMEC, que permaneceram sem tratamento ou foram estimuladas com a humano recombinante (rh) TNFa (PeproTech) durante 4 h antes do ensaio de ades fluxo (10 ng /mL). Os HPMECs estimuladas foram incubadas com meio de aptâmero de 0,15 mg /mL durante 30 minutos a 37 ° C e, em seguida perfundidos com 1 × 10

5 células tumorais HT29 por mL, tal como descrito acima (controlo sem aptâmero).

estatísticas

Para todos análises estatísticas Graphpad Prism 6 (La Jolla Califórnia, EUA) foi utilizado. Os valores são dados como média ± desvio padrão. O modelo de ligação Um site-specific (Graphpad Prism 6) foi utilizado para o cálculo das constantes de dissociação. O teste t não pareado bicaudal foi utilizado para comparações entre dois grupos. diferenças significativas entre os dois meios com p 0,05 estão marcados com *, diferenças muito significativas (p 0,01) com ** e diferenças extremamente significativas (p 0,001), com ***

Resultados

Seleção e Caracterização de um E- e P-selectina DNA específico Aptamer

com o objectivo de seleccionar os aptâmeros de DNA que inibem a interação entre os e-selectinas humanos e seus ligantes apresentados em células de câncer, foi realizada SELEX utilizando produzido de forma recombinante da proteína de fusão de E-selectina humana, como molécula alvo. Após 17 ciclos de selecção, o conjunto de ADN enriquecido mostrou aproximadamente 20% de ligação de RH a E-selectina em relação ao conjunto de ADN inicial (Figura 3A), que compreende uma constante de dissociação (

K

d) de 170 ± 65 nM. Análises de sequências de 50 oligonucleótidos derivados desta associação não revelaram similaridades de sequência entre estes oligonucleótidos. No entanto, a investigar várias destas moléculas por meio de ensaios de retenção de filtro, identificou-se a ADN específica aptâmero SDA RH E-selectina (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTGGCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3′) com um

K

valor d de 98 ± 16 nM (Figura 3B).

ADN foi marcado radioactivamente, incubadas com quantidades crescentes de proteínas e filtrou-se através de uma membrana de nitrocelulose. As fracções de ADNs ligados foram detectados através de autorradiografia e quantificadas. (A) E-selectina humana recombinante incubadas com piscina DNA após um (▴) e 17 rodadas (•) SELEX. (B) Aptamer SDA incubadas com rh E-selectina (•,

K

d ≈ 87 nM), rh P-selectina (▪,

K

d ≈ 84 nM), ou estreptavidina (▴) como um controlo. A DNA controle fez não se ligam a E- humana (▾), nem P-selectina (♦)

Devido às semelhanças de sequência entre E- e P-selectinas [6], [22] -. [ ,,,0],24], testou-se a afinidade de SDA para a e-selectina humana recombinante /IgG-Fc-quimeras (RH da selectina P; R D Systems). Assim SDA, originalmente selecionados para a E-selectina humana, também mostrou afinidade notável para P-selectina humana (

K

d = 95 ± 18 nM), mas não em tudo para estreptavidina. Finalmente, o ADN de controlo (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGAGGAGTGGGCTAAAGGTATGTTGTGGGTTTGGTTCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 ‘), o que difere dos SDA na região randomizado, fez nem se ligam a rh rh nem E- selectina P (Figura 3B).

Todas as tentativas para minimizar a 91 nucleótidos de comprimento aptâmero falhou apesar aplicando MFOLD [25], [26] previsões da estrutura secundária auxiliados para a previsão de sequências mais curtas. Foram monitoradas a estabilidade da SDA em meio completo. Mesmo que uma lenta degradação pôde ser observada, após 12 h, para mais do que 25% de aptâmero de comprimento total podia ainda ser detectado na ausência de selectinas (Figura 4).

radiomarcado SDA foi incubado com meio completo e analisadas através de poliacrilamida electroforese em gel. Após uma hora mais da metade da SDA ainda estava disponível (caixa pequena).

DNA Aptamers Inibição de Adesão Celular para Imobilizados recombinantes selectinas Humanos sob Physiological tensão de cisalhamento

Nós investigamos se a SDA foi capaz de interferir com a adesão de células tumorais apresentando ligando de selectina P para E- e-selectinas em condições de tensão de cisalhamento fisiológicas. Portanto, de rh-selectinas foram imobilizadas sobre um micro-câmara de fluxo laminar e os capilares foram perfundidos, quer com as células HT29 em caso de E-selectina humana ou com células eol-1 no caso de P-selectina humana. eventos de adesão foram registados. Na ausência de SDA, as células HT29 aderidas em câmaras de E-selectina-revestido com 11,89 ± 4,9 eventos por minuto (Figura 5A). Para examinar o efeito inibidor de SDA, as câmaras de E-selectina-revestidas foram pré-incubadas com SDA. Em seguida, este foi submetido a perfusão capilar com as células HT29 e o número de células aderentes HT29 diminuiu significativamente para 7,67 ± 3,9 eventos por hora correspondente a uma redução de 35%. Quando se utilizou DNA controle, adesão celular HT29 não foi prejudicada (11,22 ± 5,3 eventos /min). Como um controlo negativo apropriado de IgG-Fc sem qualquer parceiro de fusão foi imobilizada sobre uma micro-câmara de excluir a ligação inespecífica. Isto resultou em eventos raramente ligação (0,78 ± 0,8 eventos /min,

P Art 0,001

vs

E-selectina.)

Imobilizados rh E- (A. ) ou RH P- (B) selectina (0,2