Abstract

Fundo

carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) é o sétimo tipo de câncer mais comum no mundo inteiro. Infelizmente, a sobrevida dos pacientes com SCCHN não melhorou nos últimos 40 anos, e são necessárias, assim, novos alvos para a terapia. Recentemente, as elevações nos níveis séricos de interleucina 6 (IL-6) e expressão de torção em amostras de tumores foram encontrados para ser associado com resultados clínicos pobres em vários tipos de cancro, incluindo SCCHN. Apesar de torção tem sido proposta como o principal regulador da transição epitelial-mesenquimal e metástases em cancros, os mecanismos pelos quais os níveis de torção são regulados pós-tradução não são completamente compreendidos. a progressão do tumor é caracterizado por o envolvimento de citoquinas e factores de crescimento e indução de torção tem sido relacionado com um certo número destas vias de sinalização, incluindo a IL-6. Uma vez que muitos dos efeitos da IL-6 são mediados através da activação de cascatas de fosforilação de proteínas, o que implica que a expressão torção deve estar sob um controlo apertado em nível de pós-tradução, a fim de responder de forma oportuna a estímulos externos.

Metodologia /principais conclusões

Nossos dados mostram que a expressão de IL-6 aumenta torção através de um mecanismo independente de transcrição em muitas linhas celulares SCCHN. Outras investigações revelaram que a IL-6 estabiliza torção em linhas celulares de SCCHN através de caseína quinase 2 fosforilação (CK2) de resíduos de torção S18 e S20, e que esta fosforilação inibe a degradação de torção. fosforilação torção não só aumenta a sua estabilidade, mas também aumenta a motilidade celular. Assim, a modulação pós-tradução de torção contribui para suas propriedades promotoras de tumores.

Conclusões /Significado

O nosso estudo mostra a expressão torção pode ser regulada a nível de pós-translacional através da fosforilação pela CK2, que aumenta a estabilidade da torção em resposta à estimulação de IL-6. Nossas descobertas não só fornecer novas perspectivas mecanicistas na regulação pós-translacional de torção mas também sugerem que CK2 pode ser um alvo terapêutico viável em SCCHN

Citation:. Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Estabiliza twist and Melhora Tumor motilidade celular em células de cabeça e pescoço por meio da ativação de caseína quinase 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10.1371 /journal.pone.0019412

editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 22 Dezembro, 2010; Aceito: 31 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo SPORE Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, em Câncer de Cabeça e Pescoço CA097007 P50 outorga, os Institutos Nacionais de Saúde Cancer Center CA016672 concessão de apoio, e do Panteão e da Broudy “Comprometa-se com a cura” fundações. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN) é o sétimo tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1]. Apesar da melhoria das técnicas de terapia cirúrgica e de radiação, a taxa de sobrevida em 5 anos não melhorou significativamente ao longo das últimas décadas e continua a ser a 50-55%. Embora as metástases recorrência e da linfa pescoço nó local são responsáveis ​​pela maioria das mortes por esta doença, apenas 10-20% dos pacientes beneficiar da integração da terapia quimioterápico sistêmico, com marginalmente melhor sobrevida e efeitos tóxicos consideráveis ​​[2], [3]. Por isso, são necessários novos alvos para a terapia

Recentemente, foi encontrado sobre-expressão de torção em espécimes clínicos de tumor a ser correlacionada com a metástase e um mau prognóstico em pacientes com SCCHN, bem como outros tipos de cancro [4] – [7]. . Torção é um factor de transcrição-hélice-volta-hélice altamente conservada que desempenha um papel importante para facilitar a movimentação das células no desenvolvimento de embriões. Em células cancerosas, torção é considerado como um oncogene, tal como a sua expressão elevada promove a progressão da doença e a metástase através da indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT) [8].

Apesar da sua importância na progressão tumoral, pós-transcricional regulação da torção não é bem compreendida

Uma análise comparativa de mRNA twist and expressão da proteína twist in embriões de camundongos mostraram expressão RNA torção abundante na mesoderme presomitic, somites epiteliais e mesoderme anterior, mas nenhuma proteína torção pode ser encontrada em nesses tecidos [9]. A discrepância também foi notada durante o desenvolvimento do embrião de rato, como RNA torção atinge seu nível mais alto em 7,0 dias post coitum enquanto nenhuma proteína torção poderia ser encontrado antes de 8,25 dias post coitum. A falta de concordância entre a expressão do mRNA Twist and expressão da proteína torção indica que a expressão torção é controlado no nível pós-transcricional [9]. modificação pós-transcrição de factores de transcrição, incluindo a fosforilação e ubiquitinação, tem sido demonstrado ser importante para a sua função, tal como esta proporciona um mecanismo através do qual a célula pode rapidamente iniciar programas de transcrição em resposta a estímulos externos. Por exemplo, tem sido relatado que a torção pode ser degradada através da via de degradação da ubiquitina /proteassoma, tal como o tratamento com um inibidor de proteassoma inibe a degradação de torção [10]. Existe também evidência de que a função de torção pode ser modulada pela fosforilação [11], [12]. Porque fosforilação é muitas vezes envolvido na regulação da degradação ubiquitina /dependente de proteassoma de uma proteína [13], a hipótese de que a fosforilação de torção aumenta a sua estabilidade, aumentando o seu nível de expressão relativa.

tumorigênese SCCHN e progressão são conhecidos por ser influenciado por vários factores de crescimento e factores de citocina, incluindo a interleucina 6 (IL-6) [14] – [17]. Em pacientes SCCHN, elevação dos níveis séricos de IL-6 nível se correlaciona com pior sobrevida e evolução clínica desfavorável [14], [15], [18]. IL-6, produzida quer por infiltração de células imunitárias ou células de tumor, não só fornece sinais de sobrevivência às células cancerosas, mas também facilita a motilidade das células cancerosas através da EMT [19], [20]. A via de sinalização tradicional IL-6 é através da ligação com o sIL-6 receptor (gp80), que induz a dimerização de gp130 e a activação subsequente de qualquer das Janus quinases (JAK) /STAT3 em uma maneira dependente da transcrição, ou de Ras-MAPK e PI3K /Akt [21]. Além vias canónicos, caseína-quinase 2 (CK2) também foi recentemente relatada a jusante de sinalização de IL-6 no cancro [22].

CK2 é uma serina /treonina-quinase altamente conservado e ubiquamente expresso, que consiste de dois catalítica duas subunidades reguladoras beta (α ou α ‘) e [23]. A importância de subunidades CK2 pode ser demonstrada por estudos genéticos mostram que os ratos que faltam CK2α ou CK2β são embrionário letal enquanto que os ratinhos knockout “CK2 alfa tinham defeitos apenas na espermatogénese [24] – [26]. CK2 passou recentemente a ser considerado como um “mestre quinase”, uma vez que controla a actividade de muitas outras quinases e está envolvida em muitos processos celulares importantes [27]. Por exemplo, CK2 controla a estabilidade de IκBα e PML supressor de tumor através de fosforilação e a modificação da sua degradação ubiquitina /proteassoma [28], [29]. CK2 tem sido relatada a ser sobre-expressa e para correlacionar com a sobrevivência pobre em muitos tipos de tumor, incluindo SCCHN [30] – [32]. Tradicionalmente, CK2 é considerada como uma proteína cinase constitutivamente activa, mas vários estudos têm mostrado que CK2 pode responder a muitos estímulos de factores de crescimento, incluindo IL-6 [22], [33], embora os mecanismos da sua activação permanecem em grande parte claro [34 ].

tem sido relatado que a STAT3, o principal sinal a jusante da via de IL-6, pode activar transcricionalmente a expressão de torção [35], [36]. Os nossos dados preliminares mostraram, no entanto, que a expressão da proteína da torção foi aumentada por IL-6 antes do sobre-regulação de ARNm de torção em múltiplas linhas celulares de SCCHN agressivos, sugerindo uma regulação independente de transcrição de torção pela IL-6. Uma vez que muitos dos efeitos da IL-6 são mediados através da activação de cascatas de fosforilação de proteína [21], e a fosforilação do substrato é frequentemente envolvido na regulação da degradação da ubiquitina /dependente de proteassoma de uma proteína [37], que postularam que a expressão da torção é regulada pela fosforilação de IL-6-activado.

neste estudo, foi demonstrado que o tratamento de linhas celulares de SCCHN com IL-6 conduz a estabilização da proteína torção. Outras investigações mostraram que a IL-6 estimula a fosforilação da torção através da activação da proteína cinase CK2 serina /treonina. Nossas descobertas não só proporcionar uma nova visão mecanicista que a torção é ativada através da fosforilação pela CK2 quinase, mas também têm implicações significativas para o prognóstico e tratamento do câncer de cabeça e pescoço.

Resultados

expressão Torção é regulada positivamente logo após a IL-6 tratamento

A maioria SCCHN e linhas celulares de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) segregam IL-6 e expressam receptores para a IL-6 (Tabela S1 e S1 Figura) [38]. Para estudar o impacto de IL-6 a estas linhas celulares, expressão de torção foi examinada ao longo do curso de tempo de tratamento. As transferências de Western de linhas de células representativas estão representadas na Figura 1A. torção expressão foi induzida nessas células dentro de 15 min após o tratamento com IL-6. Em contraste, os níveis de ARNm de torção permaneceu inalterada ao longo de um período de tratamento semelhante (Figura 1B). Estes dados indicam que a expressão da torção é regulada pela IL-6 ao nível pós-transcricional.

expressão (A) da proteína foi induzida torção logo após tratamento com IL-6 em células de SCCHN (OSC-19, HN31) e células de câncer de pulmão (A549). Após privação de soro durante a noite, as células foram submetidas a tratamento de IL-6 (20 ng /ml durante 0-4 h), e expressão de torção nos lisados ​​celulares foi analisada por Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. a expressão de ARNm (B) da torção como quantificado pelo tempo real de RT-PCR permaneceu praticamente inalterada durante todo o tratamento de IL-6 (0-6 horas). Os valores foram normalizados para os níveis de expressão do gene de manutenção

GAPDH

, e são expressos como a média dobrar mudança de nível basal ± S.E.M. Para cada ponto de tempo, foram realizadas duas ou quatro repetições. Todas as experiências foram feitas em duplicado para cada linha celular. Os dados de uma experiência representativa com OSC-19 SCCHN células são mostrados. (C) a degradação da torção foi inibida por qualquer MG132 ou IL-6. Depois de células OSC-19 SCCHN foram tratados com CHX (100 uM), CHX mais o inibidor de proteassoma MG132 (10 uM), ou CHX mais IL-6 (20 ng /ml) durante 0-4 h, a expressão da torção foi determinada por Western borrão. (D) Os pixels de cada banda em (C) foram medidos por Image J e normalizado de modo que o número de pixels no momento 0 era de 100%. Os dados estão representados graficamente como o logaritmo

10 da densidade de pixel relativa (eixo y) versus o tempo (min). A meia-vida foi determinada a partir do registo de 50% em relação densidade de pixels. A meia-vida de torção foi de 1,2 horas na presença de CHX sozinho e . 4 h na presença de CHX + IL-6

Esta observação de que a IL-6, regula positivamente a expressão da torção pós- transcricionalmente levou-nos a investigar se a degradação da torção por sua vez foi modulada por tratamento IL-6. As taxas de degradação de torção em células SCCHN foram examinados por tratamento com ciclo-heximida inibidor de síntese de proteínas (CHX) sozinho, CHX mais o inibidor de proteassoma MG132, ou CHX mais IL-6. A quantidade de proteína em cada ponto de tempo foi determinada por Western blot e quantificadas por densitometria. Como mostrado nas Figuras 1C e 1D, torção endógena tinha uma meia-vida de 1,2 horas, mas quando um ou outro foi adicionado IL-6 ou MG132, menos torção foi degradado e ele não atingiu a sua semi-vida durante o período de tratamento de 4 h . Os dados são consistentes com um estudo anterior que mostra que a proteína é degradada torção através do sistema de degradação de proteassoma [10] e indicam que a proteína é estabilizada torção pós-tradução através da inibição da sua degradação pela IL-6.

torção é fosforilada em resposta a tratamento com IL-6, e CK2 é encontrada na via entre a IL-6 e Torça

Como a IL-6 tem sido mostrado para activar células múltiplas vias de sinalização através da activação de cascatas de cinase de proteína, nós próxima examinou se twist é fosforilada em resposta ao tratamento IL-6. As células transfectadas com um plasmídeo que codifica uma hemaglutinina (HA), protea de fus Twist foram tratados com IL-6; imunoprecipitação subsequente com um anticorpo HA e Western blotting utilizando um anticorpo fosfo-serina inespecífica revelou aumento da fosforilação dos resíduos de serina /treonina de torção (Figura 2A), confirmando que a torção é fosforilada em resposta à estimulação de IL-6.

(A ) torção foi fosforilada em resposta a tratamento com IL-6. células OSC-19 SCCHN foram transfectadas com o plasmídeo de HA-torção ou vector de controlo, durante 48 h, em seguida, tratados com IL-6 (20 ng /ml) durante 30 min; tratados e não tratados lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com o anticorpo HA e analisados ​​por transferência de Western utilizando um anticorpo fosfo-serina inespecífica. (B) inibidores para vias a jusante conhecidas de IL-6 não foram capazes de inibir a regulação positiva da torção por IL-6. OSC-19 SCCHN células foram pré-tratadas com os inibidores de quinase indicados ou dimetil-sulfóxido (DMSO; controlo) durante 1 h, em seguida, foram tratados com IL-6 (20 ng /ml) durante 30 min. torção expressão foi determinado por western blot. (C) O local de fosforilação CK2 (SNSE) em torção, previsto pela utilização de https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, é conservada entre as espécies. actividade CK2 (D) foi aumentado por IL-6 e inibida pelo inibidor DMAT CK2 em células SCCHN. Após privação de soro durante a noite, os lisados ​​de células HN31 tratados com PBS (controlo), IL-6 (20 ng /ml, 30 min), ou IL-6 mais DMAT (10 uM) foram recolhidas. CK2 actividade endógena em lisados ​​de células (5 g) foi medida usando um substrato sintético péptido CK2 (RRRADDSDDDDD; 0,1 mM) e γ-

32P-ATP como um doador de fosfato, como anteriormente descrito [49]. O eixo y representa a contagem por minuto (CPM) de radioactividade após a normalização para o controlo não-substrato. *

P Art 0,05 pelo Estudante

t

-teste. torção expressão induzida pela IL-6 (E) foi inibida por inibidores da CK2. expressão torção foi medida após tratamento com IL-6 (30 min) em lisados ​​de OSC-19 SCCHN ou células cancerígenas do pulmão A549 previamente incubadas na CK2 inibidores DMAT ou TBB (1 h). expressão torção foi inibida a doses tão baixas quanto 0,8 um e não se restringe a uma linha celular específica. (F) Queda da subunidade catalítica de CK2 (CK2α) através de expressão de proteínas inibida torção shRNA. Knockdown de CK2α no OSC-19 células SCCHN por 24 h reduziu significativamente a expressão torção e bloqueou sua indução por IL-6 tratamento (20 ng /ml, 30 min).

Para identificar a quinase responsável pela a fosforilação induzida por IL-6 de torção, utilizou-se uma estratégia de rastreio inibidor químico para determinar se a supra-regulação da torção IL-6 mediado pode ser bloqueado por inibidores de quinase conhecidos estar a jusante da via de sinalização. Torção foi regulada positivamente pela IL-6, apesar de a aplicação de inibidores de JAK de bloqueio (AG490), PI-3K (wortmanina), Erk (U0126), p38 MAPK (SB202130), ou junho

N-terminal quinase

(SP600125) , indicando que a regulação positiva da torção é independente destas vias (Figura 2B). Uma vez que nenhuma das vias conhecidas que testadas pareciam estar envolvidos na mediação da torção expressão induzida pela IL-6, o próximo digitalizada a sequência de aminoácidos na proteína computacional servidor predição família https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml e identificado um motivo de consenso substrato CK2 (SNSE) dentro de torção nos resíduos 18 a 21 que é conservada entre espécies (Figura 2C)

CK2 é uma cinase de serina /treonina.; crescentes estudos recentes indicam que pode desempenhar um papel importante na progressão de SCCHN, [39] [32]. Foi previamente considerado como uma quinase intracelular constitutivamente activa, mas vários estudos recentes têm demonstrado que CK2 pode ser activada em resposta a estímulos externos, tais como IL-6, embora os mecanismos subjacentes a esta activação permanecem incertos [22], [34]. Consistente com os estudos anteriores, a actividade CK2 em lisados ​​celulares de SCCHN foi regulada positivamente pela IL-6 e inibida por CK2-específico inibidor da 2-dimetilamino-4, 5, 6, 7-tetrabromo-1H-benzimidazole (DMAT), como determinado por um CK2 ensaio de actividade de quinase que é utilizado um péptido e substrato sintético CK2 γ-

32P-ATP como um doador de fosfato (Figura 2D).

Para demonstrar adicionalmente que é CK2 na via entre a IL-6 e twist, a seguir, examinou expressão torção na presença de IL-6 e CK2 inibidores DMAT ou 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB). Tal como mostrado na Figura 2E, a expressão da torção induzida por IL-6 foi inibida por qualquer inibidor de CK2 e esta inibição foi observada em diferentes linhas celulares. Os efeitos da CK2 sobre a expressão da torção induzida por IL-6 foram também confirmadas por knockdown da CK2α catalítica subunidade em linhas celulares de SCCHN, em que tanto os níveis basais de expressão de torção e aqueles que depois de tratamento com IL-6 foram reduzidos (Figura 2F). Tomados em conjunto, estes dados confirmam ainda mais a importância da CK2 para a estabilização induzida por IL-6 de Twist.

CK2 associados com, fosforila, e estabiliza a torção

A seguir, analisou se CK2 e torção são associado com um outro, utilizando experiências de co-imunoprecipitação. Primeiro usamos lisados ​​preparados a partir de células HEK 293T transfectadas com tanto do tipo selvagem Myc-Twist and CK2α. Como mostrado na Figura 3A, CK2α foi detectada em transferências de Western de imunoprecipitados realizados com anticorpo foi detectada Myc e Myc-torção nos Western blots de imunoprecipitados realizados com anticorpos CK2α. Controle imunoprecipita usando IgG inespecífica não precipitou qualquer proteína. Os dados sugerem que as proteínas podem interagir uns com os outros. Para examinar mais a interacção entre CK2α endógena e proteína em células de torção SCCHN, a linha celular FaDu foi escolhido porque expressa um elevado nível basal de proteína CK2; células HN31 SCCHN que expressam de forma estável torção marcada com myc (células HN31 Myc-Torção SCCHN) foram estabelecidos para fins de imunoprecipitação por causa do mau desempenho dos anticorpos torção disponíveis comercialmente. Tal como mostrado na Figura 3B, torção endógeno em células FaDu SCCHN foi co-imunoprecipitada com um anticorpo anti-CK2α. Em células HN31 SCCHN Myc-torção, que expressam de forma estável torção marcada com myc, CK2α endógena foi também co-precipitado com os imunoprecipitados anti-Myc. Estes dados suportam a hipótese de que CK2 pode regular a torção, mostrando que estas duas proteínas fisicamente associar um com o outro

(A) . (B) co-imunoprecipitação bidireccional mostrou que CK2α está associada com torção. (A) Co-imunoprecipitação foi feito em lisados ​​de células HEK 293T transfectadas com ambos WT-Myc torção e CK2α. CK2α foi co-imunoprecipitada com Myc-torção e vice-versa. (B) Os lisados ​​celulares de FaDu (esquerda) ou células HN31, que expressam de forma estável WT Myc-Torção (à direita), foram imunoprecipitadas com CK2α (em células FADU) ou anticorpo Myc (em células HN31 WT Myc-Torção) e submetida a Western análise de mancha. Torção endógena foi co-imunoprecipitada com CK2α em lisados ​​celulares FADU, e CK2α endógena foi encontrado nas MYC-imunoprecipitados de lisados ​​de células HN31 torção Myc-WT. (C) CK2α imunoprecipitada-CO nos imunoprecipitados HN31 Myc-Torção foi aumentada por IL-6 (20 ng /ml, 20 min) e inibida pelo pré-tratamento com um anticorpo contra o receptor da IL-6, Tocilizumab (50 ng /ml, 45 min). Torção fosforilada (D) CK2. Um ensaio de quinase de imunocomplexo foi realizada em myc-imunoprecipitados de lisados ​​de células HEK 293T transitoriamente que sobre-expressam WT-Myc torção ou Myc -S18,20A torção. CK2 quinase recombinante e γ-

32P-ATP foram adicionados para os imunoprecipitados a 30 ° C durante 15 min, e a reacção foi parada por adição de tampão de amostra de SDS e aquecimento a 95 ° C durante 5-10 min. As amostras foram então sujeitas a electroforese e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno para autorradiografia ou análise de Western blot. (E) A estabilidade de torção foi afectada pelo local de fosforilação CK2. [Células HN31 SCCHN expressando estavelmente WT-Myc torção, o mutante CK2 hypophosphomimetic Myc-S18,20A torção, ou o mutante de torção Myc-S18,20D fosforilação-mimético eram tratados com CHX (100 uM) durante os tempos indicados. expressão de myc-torção nos lisados ​​celulares foi determinada por Western blot. Os dados representam uma das três experiências independentes. As semi-vida calculados (t1 /2) a partir dos ensaios em triplicado são expressos como média ± S.E.M. *

P

. 0,05 pelo Estudante

t

-test

Para examinar se a interação entre Twist and CK2α é IL-6 dependente, co- imunoprecipitação foi repetido em Myc-torção estável linha de células HN31 após breve tratamento com IL-6 (20 min). Porque HN31 expressa níveis elevados de produção de IL-6 (Tabela S1), um anticorpo monoclonal contra o receptor da IL-6, Tocilizumab, foi utilizado para examinar a sua interacção sob bloqueio da sinalização de IL-6. Como mostrado na Figura 3C, o aumento da CK2α foi co-imunoprecipitada com Myc-torção após tratamento com IL-6, mas não foi encontrado nos imunoprecipitados a partir de células pré-tratadas com Tocilizumab durante 45 min.

Para determinar se CK2 fosforila a torção resíduos S18 /S20, o local de fosforilação putativo da nossa previsão computacional, foi realizado um ensaio de quinase de imunocomplexo em células 293T HEK que sobre-expressam quer de tipo selvagem (WT) Myc-torção ou mutante Myc-torção na qual E18 e E20 são substituídos com alanina ( S18,20A torção). Purificada CK2 quinase fosforilada WT torção, mas a fosforilação foi abolida na presença do inibidor de CK2 e DMAT fortemente reduzida em mutado S18,20A torção (Figura 3D).

Para testar se a estabilidade de torção é afectada pela local de fosforilação, as células HN31 estáveis ​​com superexpressão WT twist, S18,20A twist, ou fosforilação mímica em que S18 e S20 são mutado para ácido aspártico (S18,20D torção) foram estabelecidos. Depois de tratar as células com CHX, as meias-vidas calculados para S18,20D Twist, S18,20A Twist, e WT torção dos três experimentos foram 9,62 ± 0,99 h para S18,20D torção, 2,45 ± 0,59 h para S18,20A Torção e 4,69 ± 0,73 h para WT torção (Figura 3E). Todos os

valores P Compra de comparação de médias de quaisquer dois grupos com o estudante

t

-test foram inferiores a 0,05. Isso apóia a hipótese de que a fosforilação de torção por CK2 melhora a estabilidade Twist. Tomados em conjunto, estes dados indicam que CK2 associados com e fosforila Twist, e que a fosforilação em S18 e S20 estabiliza Twist.

CK2 e torção estão envolvidos em IL-6-promovido motilidade celular

próxima examinados os efeitos da IL-6, a inibição CK2, e knockdown torção sobre a motilidade celular SCCHN, tal como medido pela cicatrização de feridas e ensaios de migração de Boyden-câmara. Como se mostra nas Figuras 4A e 4B, a migração de OSC-19 células SCCHN em um ensaio de cicatrização de feridas zero 12-H foi promovido pela IL-6 e suprimida pelo DMAT inibidor CK2, enquanto a taxa de proliferação em relação em cada grupo foram submetidos a nenhum alteração significativa (Figura 4C). Knockdown de torção em células OSC-19 profundamente suprimido motilidade celular, indicando o seu papel importante na migração das células (Figura 5A, painel superior). Após o tratamento com a IL-6 durante 24 h, a migração foi aumentada, mas este aumento foi revertida a torção em knockdown grupos (Figura 5A, painel do meio). migração de células IL-6 promoveu foi inibida pelo inibidor CK2, bem como knockdown de torção, o que sugere que ambos CK2 e torção estão implicados na migração induzida por sinal. A seguir, em comparação a motilidade de linhas de células que expressam de forma estável WT ou torção mutante

in vitro

. Apesar do fundo de elevada produção de IL-6 e secreção de existência de torção endógeno em células HN31 SCCHN, a sobreexpressão de WT, mas não S18,20A, torção promovido a migração celular em relação ao controlo a Figura 5B, painel superior (;

P

0,05). Além disso, a sobre-expressão de S18,20D Torção mais aumento da motilidade celular em relação à das células que expressam qualquer torção ou WT S18,20A, o que sugere que esta mutação conduz a motilidade celular aumentada.

Imagens de (A) para migração de células SCCHN por ensaio de cicatrização são mostrados. OSC-19 SCCHN células foram tratados com PBS (controlo), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 uM), ou ambas de IL-6 e DMAT em meio a 2%, tal como indicado. As monocamadas de células confluentes foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta de 200 mL. Fotos dos arranhões foram adquiridos a 0 e 12 h. (B) As medidas quantitativas da distância migrada em relação foram analisados ​​com imagem J. Os dados são expressos como média ± S.E.M. da distância migrada em relação. *

P Art 0,05 pelo Estudante

t

-teste. taxa de proliferação (C) celular em cada condição de (a) foi medida pelo ensaio de MTT durante 12 h. As diferenças entre grupos não têm significância estatística.

(A) Knockdown de torção inibiu a migração celular SCCHN no ensaio de migração câmara de Boyden. células OSC-19 SCCHN foram primeiro transfectadas com vector de controlo ou Torça shRNAs durante 24 h em meio com ou sem IL-6 (20 ng /ml). As células foram então sujeitas a tripsinização, contadas, e ensaiadas para a motilidade celular utilizando um ensaio de migração câmara Boyd após 20 h. Superior painéis de média: os dados são expressos como média ± S.E.M. das contagens de células provenientes de quatro diferentes pontos de vista inferior campo de energia microscópicas. *

P Art 0,05 pelo Estudante

t

-teste. Painel inferior: expressão da torção para as experiências correspondentes dos painéis superior e médio foi detectado por Western blot. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (B) A mutação de torção migração alterada das células SCCHN. A mobilidade das células HN31 SCCHN que expressam estavelmente WT-Myc torção ou indicado de proteína Myc-Torção mutante foi examinada no ensaio de câmara de Boyden migração após 20 h. Painel superior: os dados são expressos como média ± S.E.M. das contagens de células provenientes de quatro diferentes pontos de vista inferior campo de energia microscópicas. *

P Art 0,05 pelo Estudante

t

-teste. painel médio: imagens representativas das células migraram do membranas Transwell correspondentes a baixa ampliação campo de energia. painel inferior: Western blot para as experiências correspondentes no painel superior (B). p-actina foi utilizado como controlo de carga. proliferação (C) de células de cada condição de (B) tal como medido pelo ensaio MTT durante 20 h. As diferenças entre grupos não têm significância estatística.

Discussão

Este relatório demonstra uma phosphoregulation pós-translacional novela de torção pela IL-6 através da ativação de CK2 em células SCCHN. Esta modificação pós-tradução pode estabilizar Twist, que lhe permite regular a motilidade celular, fornecendo evidências de um novo mecanismo para a regulação da torção em células cancerosas.

Os relatórios publicados têm implicado tanto Twist and IL-6 no desenvolvimento /progressão de cancro, como as suas expressões são detectáveis ​​em muitos tumores epiteliais ou soro de pacientes e está associada com os resultados clínicos desfavoráveis ​​[4], [16], [18]. Embora tenha sido relatado que a IL-6 e o ​​seu mediador do sinal a jusante, STAT3, pode aumentar a expressão da torção através de transcrição em linhas celulares de cancro da mama [20], [35], [36], isto não exclui o mecanismo de pós-translacional modificação da expressão de torção. Tal como mostrado na Figura 2B, a expressão é induzida torção logo após tratamento com IL-6 apesar da inibição de fosfo-STAT3 por inibidor químico AG490 ou SB202130 em doses mais elevadas, o que indica que a sobre-regulação da torção é independente da STAT3. Tal como mostrado nas Figuras 1A e 1B, a expressão da proteína da torção marcadamente aumentada antes de alterações na expressão de ARNm de torção em linhas celulares de SCCHN. Estes achados não contradizem os de um estudo anterior por Lo

et al

[36], em que a proteína torção foi induzida em 1 h após a ativação da via-EGFR-fosfo STAT3, enquanto os níveis de mRNA torção aumentou somente após 2 h de tratamento. Embora não tenha sido discutido no trabalho anterior, a discrepância entre ARNm de torção e a expressão da proteína no nosso estudo indica a existência de um mecanismo de regulação pós-transcricional em diferentes linhas celulares.

Os nossos dados demonstram que a proteína de torção pode ser fosforilada e estabilizado pela IL-6 em linhas celulares de SCCHN, suportando o conceito de que phosphoregulation de factores de transcrição é frequentemente utilizada por várias vias de sinalização celular em resposta a estímulos externos oportuna [37]. Embora phosphoregulation torção foi descrito em estudos de mutações torção em pacientes com síndrome Saethre-Chotzen, uma doença autossômica dominante de craniossinostose [11], o papel da phosphoregulation de torção nas células cancerosas, ao nosso conhecimento, tem sido discutido em apenas alguns estudos [12], [40]. O site CK2 fosforilação (S18 e S20) identificados neste estudo está localizado dentro do motivo NSEEE, um dos cinco domínios evolutivamente conservada na sequência de torção de aminoácidos, cuja função é clara [41]. A nossa descoberta pode ajudar a melhorar a compreensão deste domínio, uma vez que CK2 está ligado a muitos factores de crescimento ou citoquinas vias, tais como IL-6 e factor de crescimento epidérmico (EGF), em que a torção é também envolvidos [20], [22], [ ,,,0],33], [36].

Curiosamente, estes factores são também bem conhecidos por influenciar a tumorigénese e progressão de SCCHN [16]. Analisou-se a regulação pós-transcricional da torção em resposta a outros factores de citoquinas /crescimento SCCHN relevantes e descobriram que a função de estabilizar a torção não se limitando a, IL-6. Outros fatores de crescimento importantes em SCCHN, tais como EGF e vascular factor de crescimento endotelial C, também estabilizar os níveis de torção [Figura S2]. Isto sugere que um mecanismo comum, podem participar na regulação da torção no SCCHN, e que pode ser interessante saber o papel de CK2 nessas vias de sinalização.

O mecanismo através do qual CK2 é activada permanece por esclarecer [34] . Embora tenha sido demonstrado que a activação é CK2 Erk-dependente em células de neuroblastoma [33], a inibição farmacológica de Erk com U0126 no nosso estudo não bloqueou o aumento de IL-6 mediado por expressão em torção (Figura 2B). Isto sugere que pode haver outros que Erk que pode activar CK2 mediadores celulares. Se isto é necessidades específicas do tipo de célula a ser investigada.

A metástase é a maior ameaça para a saúde ea sobrevivência de pacientes com câncer e sua gestão é um desafio para os profissionais de saúde. Desde torção é considerado o principal regulador de EMT e metástase de cancros [8], a regulação negativa de torção em células cancerosas tem sido proposto como uma abordagem terapêutica promissora, uma vez que não só sensibiliza células à quimioterapia e promove a apoptose celular, mas também inibe as células ‘habilidades migratórias e invasivos [33], [42].