Abstract

Identificação de marcadores tumorais potenciais vai ajudar a estratificar e identificar potencial maligno de um tumor e sua resposta às terapias específicas. A IL-6 tem sido relatada como sendo um preditor em vários cancros. Portanto, o presente estudo foi realizado para destacar o papel da IL-6 em melhorar o tratamento e determinar o prognóstico de câncer de bexiga. Foram selecionadas as linhas celulares de cancro da bexiga humanos HT1376 e HT1197 para experimentos com células e animais, em que mudanças biológicas após a manipulação experimental de IL-6 foram exploradas, incluindo o comportamento do tumor e sinalização relacionada no cancro da bexiga. Além disso, foram selecionados espécimes clínicos de 85 pacientes com músculo-invasivo, e 50 com não-musculares cancros da bexiga invasivo para coloração imuno-histoquímica para avaliar a capacidade preditiva de IL-6 em relação ao resultado clínico. Os dados revelaram que a IL-6 foi sobre-expresso nos espécimes de cancro da bexiga em comparação com tecidos não-malignas em ambos os níveis de proteína e ARNm. A coloração positiva de IL-6 foi significativamente correlacionada com maior estádio clínico, maior taxa de recorrência após o tratamento curativo, e taxa de sobrevivência reduzida. O crescimento do tumor e capacidade invasiva foram atenuados quando a IL-6 foi bloqueada. As mudanças subjacentes incluídos diminuição da proliferação celular, menos epitelial-mesenquimal de transição (EMT), diminuição da DNA metiltransferase 1 expressão e atenuado angiogênese. Em conclusão, os nossos resultados mostraram que a IL-6 pode ser um preditor significativo para o estágio clínico e prognóstico de câncer de bexiga. Além disso, a segmentação IL-6 pode ser uma estratégia promissora para o tratamento de cancro da bexiga

Citation:. Chen MF, Lin PY, Wu CF, Chen WC, Wu CT (2013) IL-6 Expressão Regula tumorigenicidade e correlaciona-se com prognóstico no câncer de bexiga. PLoS ONE 8 (4): e61901. doi: 10.1371 /journal.pone.0061901

editor: Peter Canoll, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2012; Aceito: 14 de março de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, conceder CMRPG690332-3. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da bexiga urinária representa um espectro de neoplasias, incluindo não-músculo invasivo (NMIBC), músculo invasivo e lesões metastáticas. carcinoma de células transicionais (TCC) da bexiga é a forma mais comum de câncer de bexiga e se manifesta de duas formas distintas com diferentes comportamentos clínicos e biológicos. Aproximadamente 70% dos pacientes apresentam tumores invasivos não-musculares, enquanto os restantes 30% apresentam tumores músculo-invasivo. Apesar do bom prognóstico para pacientes com doença superficial, a recorrência é comum e está associado com o desenvolvimento de doença músculo-invasiva [1]. Quase metade de todos os pacientes com doença muscular invasiva ou aqueles que já têm progredido a este porto estado oculta metástases à distância e têm taxa de sobrevida em 5 anos pobres [2]. Ao contrário de outros tipos de câncer urológico, cancro da bexiga carece de biomarcadores úteis clínicos para predizer o estágio da doença e evolução clínica. Portanto, os marcadores moleculares que podem ser utilizadas para estratificar e identificar o verdadeiro potencial maligno de um tumor e a sua resposta a terapias específicas são necessárias

A inflamação crónica, muitas vezes precede ou acompanha um grande número de cancros [3] – [5]. . Um aumento em mediadores inflamatórios tem sido mostrado para levar a promoção do tumor, invasão, angiogénese e [6] – [7]. Embora o papel da inflamação crónica na etiologia da CTP da bexiga não foi bem estabelecido, há evidências crescentes de que citocinas pró-inflamatórias desempenham papéis críticos na patogénese de cancro da bexiga, tais como a IL-6, IL-8 e TNF-α [8]. Além disso, foi mostrada a activação da STAT3 para manter persistentemente constitutivo a actividade de NF-kB, proporcionando assim evidência para a relação entre as vias de sinalização da oncologia, no microambiente inflamatório [9]. IL-6 é um importante activador de vias de sinalização de STAT3, e a citoquina principal que influencia a resposta inflamatória nos seres humanos [10], [11]. IL-6 de sinalização tem sido implicada na regulação do crescimento tumoral e metástase, e o seu nível pode ser correlacionada com um mau prognóstico em diferentes tipos de cancro [11], [12]. Além disso, o aumento da IL-6 os níveis séricos foram relatados para ser associado com a metástase e mau prognóstico do cancro da próstata, do ovário, e cancros da bexiga [13] – [15]. Embora não haja evidências que sugerem que a IL-6 pode ser um fator crítico em várias malignidades, o seu papel no cancro da bexiga permanece obscuro. Portanto, no presente estudo, que incidiu sobre os mecanismos subjacentes da IL-6 e sua possível utilidade para abordar a necessidade de tratamento agressivo de cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

As características dos pacientes

o Conselho de revisão Institucional de Chang Gung Memorial Hospital aprovou o estudo (número de autorização: 99-0207B). A autorização por escrito assinada pelos pacientes para a sua amostra e informações a serem armazenados no hospital e utilizadas para a investigação. Um total de 85 pacientes com TCC da bexiga músculo-invasivo (39 com estágio T2 e 46 com estágios T3 -T4) que completaram um curso de tratamento chemoradiotherapy definido (CCRT) foram incluídos no estudo. Após a conclusão do CCRT, os pacientes foram submetidos a uma repetição tomografia computadorizada (TC) e exame de cistoscopia para determinar a resposta ao tratamento. Os pacientes foram observados em intervalos de 3 meses para os primeiros 2 anos e cada 6 meses depois. O acompanhamento dos pacientes foi mantido até a sua morte, e os pontos finais foram sobrevida global (OS), sobrevida livre de progressão, padrão de falha ea resposta ao CCRT definitiva. A progressão da doença foi definida como recidiva local documentada ou metástases à distância. As análises foram realizadas com o programa SPSS versão 17.0.

imuno-histoquímica (IHQ) coloração

Além de amostras de tecido recolhidas a partir dos 85 pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo, amostras de tecido da bexiga foram coletadas para imuno-histoquímica ( IHC) coloração de 17 pacientes que sofrem de carcinoma da bexiga com metástases à distância, 50 NMIBC pacientes e 40 pacientes não-malignidade. , tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina obtidas por ressecção transuretral no diagnóstico foram cortadas com 5 mm de, e montados em lâminas para coloração IHC. Para a avaliação histológica de IL-6 a coloração, a coloração foi marcado de forma independente por dois observadores que estavam cegos para o desfecho clínico dos pacientes; pontuações discordantes foram revistos e foi alcançado um consenso. No presente estudo, um critério de coloração positiva mais do que 10% de células tumorais foi considerada positiva em IHC de pontuação, que foi definido por receiver operating characteristic (ROC) análise da curva.

cultura celular e reagentes

e HT137 HT1197, linhas celulares de cancro da bexiga humano, foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). A IL-6-anticorpo neutralizante foi obtido a partir de R D Systems (Minneapolis, MN) e a IL-6-GFP vector de silenciamento (humano IL6 shRNA construções de vector retroviral GFP) e o vector de controlo de GFP (não-eficaz de shRNA cassete mexidos em retroviral vector GFP) foram obtidos a partir OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD).

modelo de tumor xenoenxerto (ectópica e ortotópico)

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, promulgada pelos Institutos of Laboratory animal Resources, National Research Council, EUA o protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação animal de Chang Gung Memorial Hospital (número de autorização: 2010070201) . ratinhos nus atimicos fêmeas com oito semanas de idade foram utilizados como o modelo de xenoenxerto de implantação do tumor. No modelo de implantação do tumor ectópica, as células (5 x 10 células

6 tumorais foram injectadas por via subcutânea, por implante, cinco animais por grupo) foram implantados na região dorsal bilateral glútea. O tamanho do tumor foi medido a cada três dias após a implantação (dia 0). O volume do tumor foi calculado assumindo uma forma elipsóide. No modelo ortotópico implantação do tumor, foi realizada a instilação intravesicular de células canccer como descrito anteriormente (cinco animais por grupo). A extensão de invasão tumoral ortotópico foi medida após a implantação nos tempos indicados. O efeito da estimulação de IL-6 foi também investigada

In vivo

. Para o grupo tratado, uma injecção intraperitoneal de IL-6 (60 ou 100 ng por rato, 3 vezes por semana) foi iniciado um dia antes da implantação do tumor.

Ensaio

migração celular e invasão da célula.

a capacidade de invasão celular foi determinada por Ensaio de invasão celular (Trevigen, Gaithersburg, MD). As câmaras superiores foram pré-revestidas com extracto de membrana basal (derivado de tumor EHS e fornecido no kit). Após incubação durante 24 h, o número de células na câmara inferior foi determinada através da medição da calceína fluorescente anião libertado do acetoxymethylester calceína intracelular. Para validar experiências sobre migração celular, ensaios de raspar também foram feitas. Uma grande scratch 2 mm foi elaborado através de cada camada de células utilizando uma ponta de pipeta. As placas foram fotografados nos horários indicados.

imunofluorescência (IF) coloração

As células foram semeadas em lamelas de vidro em 5 × 10

4 células /ml em 6- placas de poços para imunofluorescência (SE) coloração com ou sem tratamento. Aos tempos indicados após o tratamento, as células foram fixadas com 2% de paraformaldeído por 5 minutos, e lavadas em PBS com Tween-20 (PBST). As lâminas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com os anticorpos contra a E-caderina e IL-6, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado com Vermelho do Texas e contracoloração com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).

reversa em tempo real de reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR)

em tempo real de RT-PCR foi realizada em RNA extraído de células e as amostras de tecido (as amostras de tecido do cancro de seis e seis tecidos não malignos ; duas amostras de cada pista). As sequências de iniciador foram como se segue: (directo e inverso, respectivamente) 5′-GTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3 ‘e 5′-GGGCCACGCCGTACTG-3′ para DNMT-1; 5’-TACATCCTCGACGGCATCTC-3 ‘e 5′-GCTACATTTGCCGAAGA- -GCC-3’ para IL-6. Um conjunto de iniciadores β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A PCR optimizadas foi realizada num sistema de detecção de PCR iCycler iQ multicolor em tempo real. PCR sinais fluorescentes significativas de tecido de carcinoma foram normalizados em relação ao valor médio dos sinais obtidos a partir de tecidos não malignos.

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para IL-6 níveis de

in vitro

e

in vivo

as amostras de urina foram obtidas de 60 pacientes com cancros da bexiga (25 de pacientes com NMIBC, 35 daqueles com doença muscular invasiva), e 20 amostras de pacientes sem evidência de malignidade. Amostra de 10 ml de urina fresca foi recolhido a partir de cada sujeito, e, subsequentemente, centrifugadas a 3000 rpm durante 5 minutos. No momento da análise de alíquotas de urina foram descongelados e urinária de IL-6 foram medidos nos sobrenadantes. Comercialmente disponível ensaio ELISA (kit de IL-6 humano SH imunoensaio; R D Systems) foi utilizada para medir os níveis de IL-6 urinária. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As curvas de calibração foram preparadas usando os padrões purificadas para cada proteína avaliada. Para testar o nível de IL-6 no sobrenadante celular, as células foram cultivadas com meio isento de soro de 1 ml durante 24 h em placas de 6 poços. O meio foi recolhido e clarificado por centrifugação a 3000 g. IL-6 nível no sobrenadante foi detectada pelo ensaio ELISA.

A análise estatística

Sobrevivência probabilidades foram analisadas pelo método de Kaplan-Meier. A sobrevida foi calculado a partir da data de início do tratamento até à data da morte ou o mais recente follow-up. A significância das diferenças entre os grupos foi avaliada pelo teste de log-rank. Todos os testes estatísticos foram bilaterais, com

p Art 0,05 levado para indicar significância. Significância da diferença entre amostras foi determinada utilizando o teste t de Student. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Três repetições foram realizadas para avaliar cada experimento, e repetir todo o conjunto de experiências, pelo menos, duas vezes. Um nível de probabilidade de p 0,05 foi adotado em toda para determinar a significância estatística, salvo indicação contrária

Resultados

IL-6 expressões em pacientes com cancros da bexiga

O nível de IL. -6 em amostras de tecido (seis câncer emparelhado e amostras de tecido não-malignas adjacentes) foi examinada usando mRNA e análise de proteínas. Como mostrado na Figura 1A, os espécimes de cancro da bexiga expressou substancialmente mais elevado nível de IL-6 do que os tecidos não malignos. análise IHC para TCC bexiga (Fig. 1B e Tabela 1) indicou uma coloração positiva para a IL-6 em 51% de T2 -T4 tecidos de cancro da bexiga [28% (11/39) em T2 vs 70% (32/46) em T3 -T4;

P

= 0,0001]. Além disso, 65% (11/17) dos tumores mais avançados (os pacientes com metástases distantes) apresentou coloração positiva para a IL-6, mas apenas 17,5% (7/40) dos tecidos não malignos da bexiga e 26% (13 /50) de tumores em estágio inicial (CIS ou T1) expressa IL-6. Como mostrado na Figura 1C, uma coloração positiva para a IL-6 foi significativamente correlacionado com a fase clínica (T2 vs -T4 T1 e cis;

P

= 0,005). Além disso, os níveis urinários de IL-6 foram examinados por análise de ELISA. Os médios de IL-6 em amostras de urina de pacientes com NMIBC (81 ± 30,8 pg /mL) e músculo-invasiva do cancro da bexiga T2 (98 ± 24 pg /mL) eram ligeiramente mais elevados do que aqueles sem doença maligna (25,14 ± 9,71 pg /ml), mas as diferenças não foram estatisticamente significativas (Fig. 1D). IL-6 urinária níveis foram significativamente elevados em pacientes com T3 -T4 cancros da bexiga locais avançados (250 ± 27 pg /mL) em comparação com aqueles em pacientes com câncer de bexiga ≤T2 ou doença não-malignas (

P

= 0,01).

A. Os níveis de IL-6 foram examinados em seis amostras de cancro (emparelhado (C) e de tecido não maligno adjacente (N); duas amostras de uma pista) por RT-PCR e análise de transferência de Western. Para análise em tempo real de RT-PCR, o eixo y mostra a relação entre a IL-6 em tecido de cancro dividido pelo que na amostra não-malignas. Colunas, com média de três experiências separadas; Bares, desvio padrão (SD); *,

P

0,05. B. coloração imuno-histoquímica do cancro da bexiga humana espécimes com anticorpo anti-IL-6. diapositivos representativos são mostrados. dados C. O IHC mostraram que IL-6 foram significativamente correlacionados com o estágio clínico. D. urinária IL-6 níveis de pacientes foram examinados por análise de ELISA. Colunas, com média de três experiências separadas; Bares, SD; *,

P

0,05. (NT, pacientes com doenças não malignas).

O papel da IL-6 no crescimento do tumor e invasão

Para investigar se a IL-6 desempenha um papel na comportamento agressivo de células cancerosas da bexiga, HT1197 e HT1376 foram transf ectadas com o vector de silenciamento de IL-6-GFP. Como mostrado na Figura 2A, o vector de silenciamento de IL-6 diminuiu significativamente a expressão de IL-6 em ambas as linhas celulares. Tal como determinado por contagem de células viáveis ​​ao longo de seis dias (Fig.2B), o vector de silenciamento de IL-6 atenuou significativamente a taxa de proliferação de células HT1197 e HT1376. Além disso, utilizando o modelo de xenoenxerto de tumores, inibição da IL-6 resultou em crescimento tumoral mais lenta

In vivo

(Fig. 2C). Os dados demonstram que o vector de silenciamento de IL-6 inibiu significativamente o crescimento de células cancerosas da bexiga. Adicionalmente, a IL-6 vector de silenciamento atenuou significativamente a capacidade invasiva de células de cancro da bexiga tal como demonstrado utilizando ensaios de migração de raspar [16] e ensaio de invasão

In vitro

(Fig. 3A, a Fig. S1). Uma técnica de implantação do tumor ortotópico foi usado para examinar os efeitos do vector de silenciamento de IL-6 na capacidade invasiva

In vivo

(Fig. 3B). Dezesseis ratos receberam instilação intravesicular de cada linha de células de cancro da bexiga. Após 28 dias, 13 ratinhos (81%) instilados com as células HT1197, quatro (25%) instilados com células HT1197 além vector IL-6 silenciamento, 11 (69%) com as células HT1376, e duas (13%) e as células HT1376 mais IL-6 desenvolveram tumores vector de silenciamento intravesicular. Os dados indicaram que o silenciamento do vetor IL-6 diminuiu capacidade invasiva

in vivo

.

A. Efeitos de IL-6-GFP no vector de silenciamento do nível de IL-6 em células HT1197 e HT1376, como demonstrado por análise de imunofluorescência. micrografias representativas são mostrados, com as respectivas cores de imunofluorescência (DAPI, azul; GFP, verde; IL-6, vermelho). IL-6 foi significativamente diminuído pela IL-6-GFP vector de silenciamento em comparação com o vector de controlo-GFP. B. Efeitos do vector de silenciamento de IL-6 em diante, as taxas de proliferação de células cancerosas e HT1197 HT1376. O mesmo número de células (10

4) foi plaqueada em cada placa no dia 0 e deixou-se crescer nas respectivas culturas. Nós contado o número de células viáveis ​​após a incubação de 2, 4, e 6 dias. O eixo dos y representa o número de células viáveis. Point, média de três experiências separadas. Bares, SD. *,

P

0,05. C. Efeitos de IL-6 Inibição do crescimento do tumor em xenoenxerto. Cada ponto representa a média de três experiências separadas; bares, SD; *,

P

0,05. Expressão de IL-6 também foi avaliada por coloração imunoquímico de xenoenxertos. diapositivos representativos são mostrados no × 400 ampliação.

A. A capacidade invasiva de células de cancro da bexiga, com ou sem o vector de silenciamento de IL-6 foi avaliada por ensaios de migração zero. Os resultados representativos são mostrados lâminas. Coluna, com média de três experiências separadas. Bares, SD. *,

P

0,05. B. A capacidade invasiva de células de cancro da bexiga, com ou sem o vector de silenciamento de IL-6 foi avaliada por meio da implantação do tumor murino ortotópico. Os slides representativos e os dados quantitativos são mostrados. O eixo dos y representa a proporção de ratinhos que apresentam os tumores intravesicular, normalizada para que recebeu o implante do tumor ortotópico. O vector de silenciamento de IL-6 diminuiu a taxa de implantação do tumor na bexiga e foi associada com um menor tamanho do tumor. Coluna, com média de três experiências separadas. Bares, SD. *,

P

0,05. (CV, as células transfectadas com o vector de controlo de IL-6 SV, as células transfectadas com o vector de silenciamento de IL-6). C. Mudança no E-caderina nas células foi avaliada e as micrografias representativas são mostrados, com as respectivas cores de imunofluorescência (DAPI, azul; GFP, verde; E-caderina, vermelho). D. Mudar em EMT-associado proteínas em transfectantes foi avaliada por análise de transferência de Western (CV, as células transfectadas com o vector de controlo de IL-6 SV, as células transfectadas com o vector de silenciamento de IL-6). E. Mudança em proteínas EMT-associado em células tratadas com JAK inhibitor- AG490.

O papel da IL-6 em EMT muda

EMT é um evento chave na invasão [17] e examinamos se este é o mecanismo subjacente ao comportamento agressivo de câncer de bexiga IL-6-positivo. Como mostrado na Figura 3C-D, o vector de silenciamento de IL-6, o aumento da expressão de E-caderina associada a uma diminuição no factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metalopeptidase de matriz 9 (MMP-9) expressões em células tumorais [18]. Tem sido relatado que a IL-6 é um importante activador de sinalização STAT3, e a activação da sinalização de STAT3 desempenha um papel na indução de comportamento do tumor EMT e mudanças agressivas no cancro [19]. Quando bloqueado activação da STAT3 com inibidor de JAK-AG490, as proteínas relacionadas com o EMT diminuíram (Fig. 3E). Estas observações sugerem que o aumento de tumor EMT comportamento agressivo e alterações induzidas pela IL-6 pode ser mediada por activação da STAT3, uma parte, pelo menos.

Efeitos de IL-6 na angiogénese

dados

ELISA revelou que a IL-6 vector de silenciamento claramente atenuada secreção de IL-6 nos sobrenadantes de cultura de células e soro de ratos após 28 dias de implantação do tumor (Fig. 4A). interacções célula-célula endoteliais mediada por CD31 estão envolvidos na angiogénese [20]. A Figura 4B mostrou que a IL-6 vector de silenciamento atenuada angiogénese demonstrado pela coloração de CD31 e VEGF. Para procurou determinar se IL-6 circulantes facilitando a indução da angiogénese, uma injecção intraperitoneal de IL-6 (60 ou 100 ng por rato, 3 vezes por semana) foi iniciado um dia antes da implantação do tumor. Tal como mostrado na Figura 4C, a IL-6 desencadeada angiogénese e formação do tubo endotelial dentro do tumor pela coloração do VEGF, MMP-9 e CD31 em ratinhos portadores de tumores durante 2 semanas. Por conseguinte, a indução da angiogénese pode ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela promoção de tumores pela IL-6.

. O nível de IL-6 nos sobrenadantes de cultura de células e soro de murganhos portadores de tumores com ou sem o vector de silenciamento de IL-6 foi analisada por ELISA

In vitro

e

In vivo

. Coluna, com média de três experiências separadas. Bares, SD. *,

P

0,05. B. Mudança do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metalopeptidase de matriz 9 (MMP-9), e CD31 em xenoenxertos de tumor foi avaliada por coloração imuno-histoquímica. Os resultados representativos são mostrados lâminas. C. Efeito de IL-6 no crescimento do tumor de xenoenxerto e a indução de angiogénese foi avaliada em ratinhos portadores de tumores durante 2 semanas. As células tumorais foram injectadas subcutaneamente em ratinhos com ou sem IL-6 de injecção, tal como indicado em Materiais e Métodos, e o crescimento do tumor examinados 2 semanas mais tarde. A imuno-histoquímica usando MMP-9, CD31, e VEGF stained- lâminas representativas foram demonstrados.

Relação entre a expressão de IL-6 e DNMT1 no cancro da bexiga

Como já relatado anteriormente [21 ], os níveis mais elevados DNMT1 foram associados com um comportamento agressivo do tumor e EMT mudanças em cancros da bexiga. Descobrimos que havia uma correlação significativa entre coloração positiva para a IL-6 e DNMT1 em IHC coloração de espécimes de cancro da bexiga (Fig. 5A). Por mRNA e análise de proteínas, diminuição da IL-6 resultou em DNMT1 inibida associada com STAT3 atenuada e a activação de Akt (Fig. 5B-C). Nós ainda determinar se a inibição de IL-6 diminuição da expressão DNMT1 através da inibição de AKT utilizando um PI3K inibidor-LY294002 [22], ou regulação para baixo dos STAT3 com STAT3 curto interferindo RNA (siRNA). Tal como mostrado na Figura 5D, a inibição da fosforilação de Akt, mas não diminuiu p-STAT3, atenuou significativamente a expressão DNMT1. Portanto, sugere-se que a ativação de AKT pode ser responsável para o aumento da DNMT1 em cancros da bexiga IL-6-positivos.

A. IL-6 nível foi positivamente correlacionada com a expressão DNMT1 em amostras de câncer de bexiga humanos (

P

0,0001). lâminas representativas de um espécime de tumor seleccionadas positivamente a coloração tanto para IL-6 e DNMT1, e um outro tumor espécime negativos tanto para a IL-6 e são mostradas na DNMT1 × 400 de ampliação. B. Efeito de IL-6 sobre o nível de DNMT1, p-AKT, e p-STAT3 foi analisada por Western blotting (CV, as células transfectadas com o vector de controlo; IL-6 SV, as células transfectadas com o vector de silenciamento de IL-6 ). C. Efeito de IL-6 sobre o nível de DNMT1 e p-AKT foi avaliada por coloração imuno-histoquímica, e os resultados de lâminas representativas são mostrados. D. Efeito de IL-6 Inibição por anticorpos, inibição da P-Akt por inibidor de PI3K, e inibição de p-STAT3 IL-6 neutralizadores por STAT3 siARN no nível de DNMT1 foi analisada por Western blotting (W, do tipo selvagem, IL -6

-, as células tratadas com IL-6-neutralizando Ab; STAT3

-, as células tratadas com Stat3 siRNA;. PI3K-I, as células tratadas com o inibidor PI3K

IL 6 está relacionado à evolução clínica de bexiga TCC

O tempo de sobrevida livre de progressão mediana de 85 pacientes completaram o tratamento CCRT definitiva foi 36,97 meses. por análise univariada, coloração positiva para IL-6 foi significativamente relacionada com a maior clínica palco, maior taxa de falha da doença após o tratamento definido e tempo de sobrevida mais curta (Tabela 1 e Figura 6). os resultados sublinham fortemente a contribuição de IL-6 com o prognóstico no câncer de bexiga.

a diferença na sobrevida foi demonstrado em acordo com coloração positiva de IL-6. As curvas de sobrevida global de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com níveis mais altos de IL-6 expressão teve menor tempo de sobrevida.

Discussão

Nós demonstramos que a IL-6 foi expresso em níveis mais elevados em TCC da bexiga do que em tecidos não-malignas. Além disso, a coloração positiva para a IL-6 foi preferencialmente associada com bexiga invasivo do músculo-CTP em relação ao estágio da doença inferior Ta -T1. níveis urinários de IL-6 também foram significativamente elevados em pacientes com bexiga localmente avançado TCC em comparação com pacientes com NMIBC. Portanto, a expressão de IL-6 pode ser relacionado com um fenótipo mais maligna.

Para investigar se a IL-6 era responsável pelo comportamento agressivo da bexiga TCC, IL-6 foi suprimida em células cancerosas da bexiga, por transfecção estável com um vector de silenciamento. Os dados revelaram que a inibição de IL-6 resultou em diminuição do crescimento do tumor da bexiga

in vitro

e

in vivo

. Além disso, o vector de silenciamento de IL-6 atenuou significativamente a capacidade invasiva detectada em ensaios de invasão celular e modelos ortotópicos rato. IL-6 é um importante activador de JAK /STAT3 sinalização [10], [11], e a sinalização da STAT3 activado tem sido relatada para contribuir para a oncogénese, promovendo a proliferação e EMT [18], [23]. Além disso, a ativação STAT3 foi mostrado um papel na predisposição células basais uroteliais em direção à via de progressão SIA para o câncer de bexiga invasivo [24]. Os dados revelaram que a inibição de IL-6 a activação da STAT3 atenuada associada com o aumento da E-caderina e diminuiu o VEGF e MMP-9 expressões. expressões aumento de VEGF e MMP-9 são relatados para correlacionar com a mudança EMT e mau prognóstico de cancro da bexiga [25], [26]. Portanto, é provável que a activação da STAT3 desempenha um papel na transmissão de IL-6 para alvos a jusante que regulam EMT e invasividade.

mostrou que a IL-6 no soro e urina foram elevadas num subgrupo de pacientes com cancer músculo-invasivo da bexiga, consistente com outras pesquisas [13], [27]. A angiogénese é um dos mecanismos que promovem a progressão do tumor, e a expressão de factores angiogénicos é sugerido ter valor preditivo para a resposta ao tratamento e os resultados nos doentes com cancro [28]. Além disso, a IL-6 tem sido relatada a desempenhar funções múltiplas na angiogénese e modelação vascular [29], e aumentar a angiogénese através da transcrição de VEGF e MMP-9 em forma dependente da STAT3. activação da STAT3 foi demonstrada para modular a expressão de genes que medeiam a angiogénese;

e

.

g

., VEGF [30]. Assim, as ligações entre a IL-6, a angiogênese, e promoção de câncer de bexiga em ratos portadores de tumor foram investigados no presente estudo. Usando um modelo de tumor de xenoenxerto, os nossos dados demonstram que a IL-6 nível positivamente ligada à angiogénese e a activação da STAT3. Estes resultados sugerem que a indução da angiogénese mediada pela activação da STAT3 pode ser um dos mecanismos subjacentes à agressividade de IL-6 positivos do cancro da bexiga.

relatado anteriormente [21] que DNMT1 poderia ser um indicador clínico significativo de cancro da bexiga. Estudos identificaram que a expressão DNMT1 podem ser directamente alteradas por citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6, em alguns tipos de malignidades [5], [31], [32]. A correlação positiva entre amostras de IL-6-positivas e coloração nuclear para DNMT1 foi encontrado por análise IHC no presente estudo. A relação entre IL-6 /sinalização STAT3 e DNMT1 no cancro da bexiga foi ainda examinada para verificar se regulação da IL-6 /STAT3 sinalização resulta em mudanças de expressão DNMT1. A análise de ARNm e da proteína revelou que a IL-6 inibiu a sinalização suprimida expressão DNMT1 nuclear associada com a diminuição da p-AKT e p-STAT3. No entanto, inibindo diretamente STAT3 por STAT3 siRNA não teve efeito evidente na expressão DNMT1. A fosforilação da Akt quinase tem sido relatada como sendo o mecanismo responsável pela expressão aumentada de DNMT1 estimulada pela IL-6 [33], [34]. Quando bloqueado fosfoinositida 3-quinase /AKT de sinalização utilizando o inibidor de LY294002 específica, a atenuação de activação AKT estava associada com a diminuição da DNMT1. Sugerimos, portanto, que ativou IL-6 sinalização reforçada ativação de DNMT1 é mediada pela ativação de Akt em TCC da bexiga.

A identificação dos fatores potenciais tem implicações importantes para o desenvolvimento e seleção de alvos moleculares na terapia do cancro. Os nossos dados experimentais indicaram que o nível de IL-6 é importante para o comportamento do tumor agressivo visto no cancro da bexiga. Portanto, nós examinamos ainda mais o poder preditivo de IL-6 em relação à evolução clínica de bexiga TCC após CCRT definitiva. Os nossos dados mostraram que a expressão aumentada de IL-6 estava significativamente associado com uma menor taxa de resposta completa após o tratamento, uma taxa de insucesso superior a doença e um período de sobrevivência mais curto, demonstrando um papel de IL-6 na predição de prognóstico. Os dados obtidos a partir do presente estudo revelou que o aumento da produção de IL-6 é crítico na agressividade do tumor e o prognóstico do cancro da bexiga. São abordadas as principais vias de sinalização que são pensados ​​para ligar IL-6 para o cancro da bexiga (Fig. 7).

Além de IL-6, diversas citocinas foram relatados para ser importante em estudos de bexiga Câncer. TNF-α foi mostrada para estimular as células cancerosas da bexiga para a produção de MMP-9, o qual tem sido implicado em invaαsion tumoral e metástase [35]. Mian et. ai. relatado que a IL-8 bloqueio inibiu significativamente a expressão de MMP-2 e MMP-9, o que resulta na diminuição da invasão [36]. Além disso, o aumento da expressão de IL-8 correlaciona-se com mau prognóstico de cancro da bexiga [37]. A inflamação pode ser considerado como favorável para a sua contribuição para a aquisição de capacidades da indicação do núcleo. Os mecanismos biológicos que ligam a agressividade do tumor em IL-6, IL-8 e TNF-α não está claramente entendido. A questão precisa ser melhor investigada no futuro.

Nosso estudo tem algumas limitações. Primeiro, nós examinados retrospectivamente o valor preditivo de IL-6 em pacientes com câncer de bexiga apenas pela fração de coloração positiva. Além disso, é uma análise retrospectiva de uma população com diferentes estágios clínicos de uma única instituição. Portanto, são necessários novos estudos dos níveis de IL-6 em pacientes com diferentes estágios de um estudo prospectivo.

Em conjunto, nossos resultados sugerem que a IL-6 é crucial para o crescimento do tumor agressivo, eo desfecho clínico