Abstract

propriedades anticancerígenas e mecanismos de mimulone (MML),

C

-geranylflavonoid isolado do

Paulownia tomentosa

frutas, foram primeiramente elucidados neste estudo. MML impediu a proliferação das células de uma maneira dose e dependente do tempo e a apoptose desencadeada através da via extrínseca em células de adenocarcinoma do pulmão humano A549. Além disso, as células tratadas com MML exibida características autofágicos, tais como a formação de vacúolos autofágicos, uma característica morfológica principal de autofagia, e a acumulação da proteína de uma cadeia leve de 3 (LC3) pontos lacrimais associada a microtúbulos, uma outra máquina típica de autofagia, como determinado por imunocoloração conjugado com FITC e monodansylcadaverine coloração (MDC), respectivamente. Os níveis de LC3-I e II-LC3, marcadores específicos de autofagia, expressão também foram aumentadas por tratamento MML. inibição da autofagia por 3 metiladenina (3-MA), inibidor de autofagia farmacológica e shRNA knockdown de beclin-1 reduziu a morte celular por apoptose induzida por MML. fluxo autofágica não foi significativamente afetada pelo tratamento MML e inibidor lisossômico, cloroquina (CQ) suprimiu a autofagia induzida MML e apoptose. autofagia induzida MML foi promovido pela diminuição dos níveis de p53 e p-mTOR e aumento de p-AMPK. Além disso, a inibição da transactivação de p53 por pifithrin-α (TFP-α) e knockdown da indução de p53 aumentada de autofagia e morte celular por apoptose finalmente promovido. No geral, os resultados demonstram que a autofagia contribui para a citotoxicidade de MML nas células cancerosas que albergam p53 de tipo selvagem. Este estudo sugere fortemente que MML é um candidato potencial para um agente anticancerígeno segmentação tanto autofagia e morte celular por apoptose no cancro do pulmão humano. Por outro lado, o co-tratamento de triglicéridos de MML e de inibidor de p53 seria mais eficaz na terapia do cancro do pulmão humano

citação:. Um grupo H-K, Kim K-S, Lee J-W, Parque M-H, Lua H-I, Parque S-J, et ai. (2014) Mimulone Induzida Autophagy através AMPK Mediada por p53 /mTOR Aumenta Caspase-Mediated apoptose celular Morte em células A549 do cancro do pulmão humano. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10.1371 /journal.pone.0114607

editor: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2014; Aceito: 10 de novembro de 2014; Publicação: 09 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 An et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Dong-A University Research Fund. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancro

pulmão é o tumor maligno mais comum que representa uma das principais causas de morte associadas ao cancro global e carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC) capta quase 85% de todos os cancros do pulmão [1], [ ,,,0],2]. Apesar dos avanços consideráveis ​​na terapia do câncer de pulmão, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia, o prognóstico para pacientes com câncer de pulmão ainda é pobre, com menos de 15% da taxa de sobrevida em 5 anos global [1]. Especialmente, quimioterapia utilizando compostos de platina ou combinações à base de platina é a terapia do cancro do pulmão mais frequentemente utilizado e é considerado o tratamento óptimo em pacientes com NSCLC em estágio avançado [2], [3]. No entanto, a eficácia da quimioterapia em pacientes com cancro do pulmão avançado é extremamente limitada, devido à resistência à droga e os efeitos secundários tóxicos de fármacos [2], [3]. Assim, é crucial desenvolver agentes quimioterápicos menos tóxicos e mais eficazes para o tratamento de pacientes com câncer avançado de pulmão.

Nos últimos anos, os produtos naturais derivados de plantas têm recebido grande atenção como principais fontes de novas drogas para a redução por quimioterapia associados efeitos secundários e que exercem os seus efeitos anti-cancerígenos, desencadeando a apoptose e autofagia [4] – [7]. Estudos recentes têm demonstrado que vários produtos naturais derivados de plantas, incluindo plumbagina [8], glossogin [9], curcumina [10], Celastrol [11], isolinderalactone [12], glicirrizina [13], polydatin [14], 6- shogaol [15], ácido glicirretínico [16] e embelin [17], induzir a apoptose através da via intrínseca e /ou extrínseco, a activação da via do p38 /JNK em células de cancro do pulmão humano. Além disso, 6-shogaol causou a morte das células através da indução autofagia pela inibição da Akt /mTOR em células humanas NSCLC A549 [18] e o paclitaxel e feroniellin Um exercida seus efeitos citotóxicos induzindo tanto autofagia e apoptose em células A549 do cancro do pulmão humano [19], [20].

Paulownia tomentosa

Steud. (Scrophulariaceae) é árvore de folha caduca distribuídos por toda a China, Coréia e Japão [21] e extratos de

P

.

tomentosa

têm sido utilizados para aliviar a bronquite, ataques de asma e catarro na medicina tradicional chinesa [22]. Estudos anteriores demonstraram que

C

flavonóides -geranylated, os principais componentes bioativos do

P. tomentosa

, têm efeitos neuroprotectores, actividades anti-radicalar e anti-bacterianos [23] – [26]. Além disso,

C

-geranylated flavanonas de

Paulownia tomentosa

frutos exibiram atividade citotóxica forte em várias linhas de células de cancro humano [27], [28]. Também tem sido relatado recentemente que geranylated flavanona tomentodiplacone B inibe directamente a proliferação das células por sub-regulação da actividade de cinase 2 dependente de ciclina, que conduz à acumulação de fase G1 em células THP-1 de leucemia monocítica humana [29]. No entanto, o mecanismo subjacente responsável pela actividade anti-tumoral de flavonóides geranylated não está bem elucidado.

Nós isolamos recentemente um composto pertencente a

C

-geranylated flavonóides, mimulone (MML), a partir do

Paulownia tomentosa

frutos. No presente estudo, em primeiro lugar, examinou os efeitos anticancerígenos de MML em células de câncer de pulmão humano e também esclareceu seu mecanismo de ação. Nós demonstramos aqui que MML desencadeia a apoptose autofagia anterior em células A549 NSCLC humanas e inibição da autofagia diminui a apoptose em células tratadas com MML.

Materiais e Métodos

Materiais

Monodansylcadaverine ( MDC), 4 ‘, 3-metiladenina (3-MA), cloroquina (CQ), o composto C (amostra C) e 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , EUA). Z-VAD-FMK (inibidor da pan-caspase), Z-DEVD-FMK (caspase-3 inibidor), Z-IETD-FMK (caspase-8 inibidor) e Z-LEHD-FMK (caspase-9 inibidor) foram obtidos a partir de Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, EUA). 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), DAPI, puromicina-di-hidrocloreto e cloroquina (CQ) foram dissolvidos em dH

2O. 3-MA (100 mM), poli-L-lisina (0,1%) e de polibreno (20 mg /ml) dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Pifithrin-α (TFP-α), o composto C (amostra C) e MDC foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Anticorpos para ATG7, beclin-1, LC3, caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bid, p-p38, p38, p-AMPK-α, AMPK-α, p-ACC, ACC, p-mTOR, mTOR foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (dançarinos, Mass, EUA); anticorpos para p53 de PARP-1/2, (DO-1), p-ERK e ERK foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA); anticorpo para p62 /SQSTM1 foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA); anticorpo para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi obtido a partir da Millipore (Milford, MA, EUA); Peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários foram adquiridos da Cell Signaling Technology (dançarinos, Massachusetts, EUA) e Enzo Vida Ciência (Farmingdale, NY, EUA), respectivamente; isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário foi obtido a partir de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EUA). kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC e BCA kit de ensaio de proteínas foram adquiridos a BD Biosciences (San José, CA, EUA) e Thermo (Rockford, IL, EUA), respectivamente. MML (Fig. 1A) isolado a partir de

P. tomentosa

frutas foi preparado tal como descrito no relatório anterior [25], dissolvido em DMSO a 40 mM para a concentração de estoque, e armazenadas a -20 ° C.

(A) Estrutura molecular do mimulone. Várias células humanas cancerosas, não-pequenas A549 câncer de pulmão de células (B), o câncer de mama MCF7 (C), HCT116 cancro do cólon (D) e U2OS osteossarcoma células (E) foram tratados com o MML como concentrações indicadas (0-80 uM) durante 12 h ou 24 h e em seguida a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os gráficos de barras indicam a percentagem de viabilidade. As células A549 (F) foram tratados com o MML a várias concentrações (0-80 uM), durante 24 horas e as células viáveis ​​foram contadas por coloração com azul de tripano. As células vivas (células não manchado) foram calculadas usando um hemocitómetro e gráfico de barras que indica a percentagem de células viáveis. Todos os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05 e ** p . 0,01 comparado com o controle

As culturas de células

não-pequenas células do pulmão humano carcinoma A549, adenocarcinoma de mama humano MCF-7, carcinoma colorectal humano HCT116 e linhas de células de osteossarcoma humanas U2OS foram adquiridos da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células foram mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM; WelGENE Co., Daegu, Coreia) contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS) e 1% de PSA (WelGENE Co., Daegu, Coreia) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar.

a viabilidade celular

para a análise de viabilidade de células, um ensaio MTT foi levado a cabo por um procedimento semelhante ao descrito anteriormente [30]. Resumidamente, as células foram semeadas em placa de 24 poços (5 x 10

4 células /poço) e cultivadas durante 24 h. As células foram então tratadas com MML em diferentes concentrações (0-80 uM) durante 24 h ou tratadas com 60? M de triglicéridos de MML para diferentes intervalos de tempo (0-24 h). Após o tratamento de MML, as células foram incubadas com a mistura durante 3 h médio /MTT (0,5 mg /ml). DMSO foi adicionado para dissolver o cristal formazano reduzido a partir de MTT e a absorvância foi lida a 540 nm usando o leitor de placas ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para confirmar o efeito de triglicéridos de MML na proliferação de células, as células vivas foram contadas por coloração com azul de tripano de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células A549 foram plaqueadas em placas de 12 poços e tratadas com MML como concentrações indicadas durante 24 h. Após o tratamento, as células foram recolhidas utilizando tripsina-EDTA (WelGENE Co., Daegu, Coreia do Sul) e coradas com 0,4% de solução de azul de tripano (Gibco, Carlsbad, CA). As células vivas foram contadas em hemocitômetro. A viabilidade celular foi mostrado em relação ao controlo.

extracção de proteína e análise por Western blot

extractos proteicos de células inteiras a partir de células A549 foram preparados com um tampão RIPA (Pierce, Rockford, IL, EUA) contendo mistura de inibidor de protease (GE Healthcare, Piscataway, EUA) e cocktail de inibidores de fosfatase (Thermo, Rockford, IL, EUA). Proteínas a partir de lisados ​​de células inteiras foram quantificadas utilizando o kit de ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. A análise por Western blot foi realizada tal como descrito previamente [30]. quimioluminescência aumentada (ECL) sistema de detecção (Amersham Bioscience, NJ, EUA) foi utilizado para detectar o sinal e a intensidade de sinal de bandas de proteína detectadas foram medidos utilizando Scion imagem Instrumento (Scion Co., Frederick, MD, EUA). O carregamento igual foi avaliada por GAPDH como controlo interno para a transferência de Western.

A imunocitoquímica

imunofluorescência foi realizada por um procedimento similar como descrito anteriormente [30]. Em resumo, as células A549 foram cultivadas em lamelas estéreis e tratou-se com MML durante 24 h, e, em seguida, fixadas com paraformaldeído a 3% (PFA) durante 15 min a 37 ° C. A seguir, passo a permeabilização foi realizada com metanol gelado (100%) durante 10 min a -20 ° C e, em seguida, as células foram subsequentemente incubadas numa solução de bloqueio contendo 5% de albumina de soro bovino (BSA) e 1% de Triton X-100 para uma h a 37 ° C. As células foram então incubadas com o anticorpo LC3 durante 12 h a 4 ° C seguido por anticorpo secundário conjugado com FITC durante 1 h a 37 ° C. Os núcleos foram coradas com DAPI (1 ug /ml) durante 10 min a 37 ° C. As imagens de fluorescência foram capturados por LSM 700 microscópio confocal de varrimento a laser (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

MDC coloração

MDC coloração também foi realizada por um procedimento similar ao descrito anteriormente [30 ]. As células foram fixadas com PFA a 3% durante 10 min a 37 ° C, e, em seguida, incubadas com 50 uM monodansylcadaverine (MDC), um composto em que os rótulos autofluorescente vacúolos autofágicos a 37 ° C durante 10 min. imagens fluorescentes foram capturados pela Olympus BX51 microscópio de fluorescência (Center Valley, PA, EUA).

Células

anexina V e PI coloração

foram tratados com concentrações indicadas de MML e /ou inibidores (caspase inibidores, 3-MA, TFP-α) durante 24 horas, e colhidas utilizando tripsina-EDTA. Após a coloração com conjugado com FITC anexina V e iodeto de propídio (PI), as células apoptóticas foram medidos utilizando fluxo Beckman-Coulter Cytomics FC500 citómetro (Beckman-Coulter, Miami, FL, EUA).

interferência de ARN

pLKO.1 lentiviral plasmídeo de expressão contendo shRNA contra beclin-1 (TRCN0000033552) e p53 (TRCN0000003753), (beclin-1; 5′-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 ‘, p53; 5′-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3’) foram adquiridas a partir de Sigma-Aldrich (Missão shRNA). As partículas virais foram gerados em 294T de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram transfectadas com pLKO.1 shBeclin-1, VSVG e vectores de Gag. sopa virai foi então injectado para células A549 e incubou-se durante 12 h. As células A549 infectadas com vírus foram seleccionados por tratamento Puromicina-di-hidrocloreto e as células seleccionadas foram utilizadas para as experiências. pLKO.1 shRNA vector de controlo (Missão shRNA, SHC002) é usado como controle.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± SEM de três experiências independentes em cada grupo. As diferenças entre cada grupo foram avaliados com Student

t

-teste e * p 0,05 foi considerado para significância estatística

Resultados

Efeito da MML na viabilidade celular de. várias linhas de células de cancro humano

Para avaliar os efeitos de MML no crescimento celular de várias linhas celulares de cancro humano, humano A549 do cancro do pulmão (Fig. 1B), do cancro da mama humano MCF-7 (fig. 1C), humanos HCT116 do cancro do cólon (Fig. 1D) e U2OS do osteossarcoma humano (Fig. 1E), as células foram tratadas com diferentes concentrações de MML em 12 h ou de 24 h e, em seguida, seguidos por ensaios MTT. MTT resultados do ensaio mostraram que o tratamento de MML proliferação celular significativamente inibida numa dose e forma dependente do tempo nestas linhas celulares de cancro. Para verificar ainda mais o efeito de triglicéridos de MML sobre a proliferação celular de células A549, as células foram tratadas com diferentes concentrações de MML a durante 24 h e, em seguida, submetidos a coloração com azul de tripano. O resultado revelou uma inibição significativa da proliferação celular por meio do tratamento de MML de uma forma dependente da dose (Fig. 1F).

MML desencadeia a apoptose dependente da caspase em células A549

Para determinar se MML- citotoxicidade induzida em células A549 foi devido a apoptose, após o tratamento de MML em diferentes concentrações durante 24 h ou 60 uM de tratamento de MML para diferentes períodos de tempo, a população apoptótica foi analisado por dupla coloração de anexina V /PI. células de anexina V /PI-positivas estavam acentuadamente aumentadas em uma dose e forma dependente do tempo (Fig. 2A-C), indicando o efeito apoptótico de triglicéridos de MML em células A549. A análise de citometria de fluxo revelou também que o tratamento de MML aumento da acumulação de células na fase sub-G1 apoptose de um modo dependente da dose. O número de células na fase G2 /M aumentou também de um modo dependente da dose (Figura S1). Para confirmar ainda mais o efeito de triglicéridos de MML na indução de apoptose em células A549, a activação de caspase-3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem foram investigados por imunotransferência com os seus anticorpos. A caspase-3, um verdugo chave da maquinaria apoptótica, cliva muitas proteínas indispensáveis ​​para a sobrevivência das células e é activada através da clivagem em dois fragmentos (17 kDa e 19 kDa) por caspase-8 e /ou caspase-9 durante a apoptose [31], [32]. Activado cliva caspase-3 subsequentemente proteínas celulares, incluindo a PARP, que leva a morte celular por apoptose. PARP desempenha um papel fundamental na manutenção da integridade genómica e é a principal proteína a ser proteólise pela caspase-3 durante a apoptose [32]. Como mostrado na Fig. 2D, caspase-3 e PARP clivagens foram nitidamente aumentado depois de 60 uM de MML tratamento durante 24 h, indicando que a apoptose induzida através de MML caspase-3 e PARP de clivagem de activação em células A549. A caspase-8 e caspase-9, desempenham um papel crucial na indução da apoptose por meio da morte mediada por receptor (extrínseca) e as vias mitocondriais (intrínsecos), respectivamente [31], [32]. A clivagem de Bid é necessário para a diafonia entre as vias extrínsecas e intrínsecas [31], [32]. Para desfazer a via pela qual MML induz a apoptose em células A549, os teores de proteínas de caspase-8 e caspase-9 foram analisados ​​por análise de imunotransferência. Como mostrado na Fig. 2D, o tratamento de MML aumentou as formas clivadas (18 kDa e 43 kDa) da caspase-8, mas não provocou a caspase-9 e Bid clivagens, indicando que o MML induzido a activação de caspase-8 em células A549. Para confirmar ainda mais se a apoptose induzida por MML era dependente da caspase, a percentagem de células apoptóticas foi verificada por dupla coloração Anexina V-PI depois de uma 24-h de tratamento com vários inibidores da caspase, tais como Z-VAD-FMK (inibidor da pan-caspase ), Z-DEVD-FMK (inibidor da caspase-3), Z-IETD-FMK (inibidor da caspase-8) e Z-LEHD-FMK (inibidor da caspase-9). Como mostrado na Fig. 2E, a análise por citometria de fluxo revelou que a apoptose induzida por MML foi resgatada por inibidor pan-caspase, caspase-3 e caspase-8 inibidores quando comparado com o tratamento de MML sozinho, mas não pelo inibidor de caspase-9. Um resultado semelhante também foi obtido a partir do ensaio de MTT (Fig. 2F). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a apoptose induzida por MML é motivado principalmente por via extrínseca em vez de via intrínseca.

células A549 (A) foram tratados com o MML como concentrações indicadas (0-60 uM), durante 24 h e, em seguida, coradas com FITC anexina V e pi conjugado. As células apoptóticas foram medidos por citometria de fluxo. (B) As células A549 foram tratadas com 60? M de triglicéridos de MML para uma forma dependente do tempo. As células apoptóticas foram depois coradas com anexina V e PI e detectado utilizando citometria de fluxo. gráfico (C) A barra indica a percentagem de células apoptóticas (modo dependente da dose; parte superior, forma dependente do tempo; parte inferior). população apoptótica foi avaliada por anexina V positiva, PI negativo (AV + /PI-, bar branco) e anexina V e PI double positivo (AV + /PI +, barra preta) células em apoptose. (D) As células foram tratadas com o MML como concentrações indicadas (0-60 uM), durante 24 h e a análise por Western blot foi realizada para verificar marcador de apoptose, caspase-3, -8, -9, Bid e PARP-1/2, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carga de análise de Western blot. (E) As células foram pré-tratadas com ou sem o inibidor de caspases, Z-VAD-FMK (30 uM), Z-DEVD-FMK (30 uM), Z-IETD-FMK (30 uM) e Z-LEHD-FMK (30 ^ M) durante 1 h e, em seguida, tratada com MML (60 uM) durante 24 h. As células apoptóticas foram coradas com Anexina V e PI e, em seguida, as populações foram detectados por citometria de fluxo. (F) As células foram tratadas com inibidores de caspase e MML sob as mesmas condições que a análise por citometria de fluxo e, em seguida, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os gráficos de barras indicam a percentagem de viabilidade celular (topo) e a percentagem de células apoptóticas (fundo), respectivamente. população apoptótica foi avaliada por anexina V positiva, PI negativo (AV + /PI-, bar branco) e anexina V e PI double positivo (AV + /PI +, barra preta) células em apoptose. Todos os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com o controlo;

# p . 0,05 em comparação com o grupo tratado com MML

MML desencadeia a autofagia em células A549

compostos naturais derivados de plantas são conhecidos por exercer os seus efeitos anticancerígenos através da indução de autofagia em células cancerosas humanas [7]. Autophagy é um processo catabólico formando vesículas de dupla membrana, denominada autofagossomas [33]. Para investigar se MML desencadeia a autofagia em células A549, as alterações morfológicas após o tratamento MML foram verificados. Como mostrado na Fig. 3A, vacuolização vasta citoplasma e formações de vacúolos autophagosome, nas células A549 tratadas com MML foram observadas ao microscópio de contraste de fase. Para confirmar a indução de autofagia por MML, coloração MDC e associada a microtúbulos de proteína 1 cadeia leve 3 (LC3) imunomarcação utilizando anticorpos fluorescentes para LC3 foram realizadas. MDC e LC3 são conhecidos como marcadores específicos de vacúolos e autofagossomas autofágicos, respectivamente, e a formação de pontos lacrimais LC3 para o autophagosome pode ser observado por microscopia confocal, que é usada amplamente como método fiável capaz de detectar autofagia [33]. Como mostrado na Fig. 3A, as células de controlo não tratados apresentaram MML-difundido MDC-coloração, enquanto que as células A549 tratadas com MML resultou num aumento de intensidade de fluorescência indicando extensa vacúolos autofágicos MDC-positivos. Além disso, o aumento da localização subcelular de LC3 ponteada também foi detectado em células A549 tratadas com MML em comparação com células de controlo não tratadas e formação LC3 pontos lacrimais foi aumentada de uma forma dependente do tempo (Fig. 3B). Para avaliar ainda mais a formação autophagosome em células tratadas com MML, as alterações nos três principais marcadores relacionados com autophagy, LC3-II, beclin-1 e ATG7, foram analisados ​​por imunotransf erência. ATG7 e os níveis de proteína LC3-II foram notavelmente aumentada de uma forma dependente da dose por tratamento MML, mas beclin-1 nível foi ligeiramente aumentada (Fig. 3C). Em conjunto, estes dados demonstram definitivamente que induz a formação de MML autophagosome em células A549.

células A549 (A) foram tratados com 60? M de triglicéridos de MML, durante 24 h e, em seguida, as imagens morfológicas foram capturadas por microscópio de contraste de fase (400 ×, PC). As setas indicam os vacúolos autophagosome-como endógenos (esquerda) e gráfico de barras indica o número de vacúolos por célula. As células foram tratadas com MML (60 uM, 24 h) e, em seguida, as células foram coradas com MDC e o anticorpo LC3, respectivamente. MDC (cor brilhante, no meio) imagens foram captadas por microscópio de fluorescência e LC3 (verde, à direita) imagens fluorescentes foram detectadas por microscópio confocal (bar; 10 mm). Gráfico de barras indica a intensidade de fluorescência de LC3 FITC. (B) As células foram tratadas com MML (60 uM) durante diferentes períodos de tempo (0-24 h) e coloração LC3 imunofluorescência foi realizada para detectar autofagossomas. Os núcleos foram corados com DAPI. As imagens foram capturadas usando microscópio confocal (bar; 10 um). (C) As células A549 foram tratadas com várias concentrações de triglicéridos de MML (0-60 uM), durante 24 h. A análise Western blot foi efectuada, em seguida, com anticorpos contra ATG7, beclin-1 e LC3, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carga. gráfico de barras indica análise de densitometria de LC3-II /rácio de GAPDH. As células A549 foram tratadas com diferentes concentrações de triglicéridos de MML (0-60 uM), durante 24 h (D) ou 60 pM de triglicéridos de MML para o curso de tempo diferente (E) e, em seguida, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando anticorpos contra p62 e LC3, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carga. (F) As células A549 foram pré-incubadas com ou sem cloroquina (CQ, 25 uM) durante 1 h, depois tratou-se com MML (60 uM) durante 24 h. A análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos, tal como indicado acima. GAPDH foi usada como controlo de carga de transferência de Western. Todos os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P . 0,01 comparado com o controlo

Sabe-se que também se acumulam quando autofagossomas fluxo autophagic indicando todo o processo de autofagia é ineficiente [35], [46]. Para avaliar se MML afecta o fluxo autophagic em células A549, o nível da proteína p62 que é usado para monitorar autophagic fluxo [35], [46] foi verificada por imunotransferência com o seu anticorpo. Como mostrado na Fig. 3D e 3E, o nível de p62 foi significativamente diminuído por tratamento MML de uma forma dose e dependente do tempo. Além disso, para avaliar os efeitos de MML sobre o volume de vesícula autophagic, os níveis de proteína p62 e de LC3 II foram verificadas por imunotransferência após 24 h de tratamento com cloroquina (CQ) conhecido como inibidor da degradação lisossomal. Como mostrado na Fig. 3F, o pré-tratamento com CQ aumentou significativamente os níveis de p62 e LC3 II em comparação com o tratamento de MML sozinho. Estes resultados sugerem claramente que o tratamento MML não interferiu com volume de negócios vesícula autofágica. Colectivamente, estes resultados certamente indicam que MML induzida autofagia sem comprometimento do fluxo autofágica em células A549.

A inibição da autofagia por inibidor autofagia ou knockdown de beclin-1 suprime MML-mediada celular por apoptose morte

foi recentemente documentado que a inibição por um inibidor de autofagia autofagia específica, tal como 3-metiladenina (3-MA), podem promover a apoptose em células de cancro humano [35] – [38]. Assim, foi investigado o efeito de 3-MA na formação de LC3 pontos lacrimais e vacúolos autofágicos em células A549 tratadas com MML. A distribuição pontuada LC3 e formação de autofagossomas MDC-positivos em células induzidas por MML foram notavelmente suprimidos pelo tratamento 3-MA (Fig. 4A). Além disso, o co-tratamento com 3 e MML-MA inibiu significativamente não só a acumulação LC3-II mas também a caspase-3 e PARP clivagens (Fig. 4B). Então, vamos checar o efeito de 3-MA na indução de apoptose utilizando anexina V /PI dupla marcação. Anexina V /células PI-positivas foram marcadamente diminuída, em células co-tratadas com MML e 3-MA, em comparação com os tratados com MML sozinho (Fig. 4C). Resultados semelhantes foram obtidos por co-tratamento de triglicéridos de MML com CQ (Fig. 4D). Estes resultados revelam que, obviamente, a inibição por autofagia 3-MA e CQ pode suprimir a apoptose induzida por MML em células A549.

(A) As células A549 foram pré-incubadas com ou sem 3-MA (10 mM) durante 3 h e em seguida incubadas com MML (60 uM) durante 24 h. As células foram coradas com MDC (cor brilhante) ou anticorpo LC3 (verde), respectivamente. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). As imagens fluorescentes foram obtidos utilizando o microscópio confocal (bar; 10 um). (B) As células foram pré-tratadas com ou sem 3-MA durante 3 h antes do tratamento de triglicéridos de MML (60 uM) durante 24 h. A análise por Western blot foi realizada com anticorpos contra LC3, PARP-1/2 e caspase-3, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carga. Os gráficos de barras indicam a razão de caspase-3 /GAPDH e LC3-II /GAPDH, respectivamente. As células A549 (C) foram pré-tratados com 3H ou sem 3-MA e tratada com MML (60 uM) durante 24 horas e as células foram coradas com FITC-anexina V conjugada /PI e, em seguida, medida por FACS. gráfico de barras que indica a percentagem de células apoptóticas. Percentagem de células em apoptose foi avaliada por anexina V positiva e PI negativo (AV + /PI-, bar branco) e anexina V e PI double positivo (AV + /PI +, barra preta) células em apoptose. (D) As células foram pré-tratadas com ou sem CQ durante 1 h e, em seguida, incubadas com MML durante 24 h. A análise de imunotransferência foi realizada utilizando anticorpos, tal como indicado antes. As células foram tratadas com CQ e MML sob as mesmas condições como mencionadas antes e, em seguida, a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT (parte inferior). gráfico de barras que indica a percentagem de viabilidade celular. Todos os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com o controlo;

# p . 0,05 em comparação com o grupo tratado com MML

inibição mais específica da via autofagia pode ser alcançado por nocaute ou nocaute de relacionados autofagia-(

ATG

) genes e

beclin-1

gene. Para confirmar ainda mais se a autofagia pode regular a apoptose, beclin-1, um regulador crítico da autofagia, foi derrubado usando RNA pequeno hairpin (shRNA) e depois muda de autofagossomas endógenos foram verificados por LC3 imunocoloração. Como mostrado na Fig. 5A, distribuição LC3 endógeno é marcadamente diminuída em células beclin-1 knockdown tratados com MML (shBeclin-1) em comparação com células shControl tratados com MML. Além disso, como mostrado na Fig. 5B, knockdown de

beclin-1

gene marcadamente suprimida beclin-1 expressão da proteína e da acumulação de LC3-II em comparação com shControl. Consistente com os resultados usando 3-MA e CQ, caspase-3 e clivagens PARP foram também significativamente inibido pela repressão da autofagia através knockdown de

beclin-1 gene

. MTT resultado do ensaio mostrou também que o efeito citotóxico de triglicéridos de MML foi significativamente reduzida por knockdown de

beclin-1

gene (Fig. 5C). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram claramente que a inibição por autofagia 3-MA e CQ ou beclin-1 knockdown impediu a apoptose induzida por MML em células A549.

células knockdown (A) de controlo e beclin-1 foram tratados com MML (60 uM) durante 24 h e, em seguida, LC3 coloração de imunofluorescência foi realizada para detectar autofagossomas. Os núcleos foram corados com DAPI. As imagens foram capturadas por microscópio confocal (bar; 10 um). (B) As células knockdown (shControl, shBeclin-1) foram tratados com MML (60 uM) durante 24 h. A análise por Western blot foi realizada com anticorpos contra beclin-1, LC3, PARP-1/2 e a caspase-3, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carga. Os gráficos de barras indicam a razão de LC3-II /GAPDH e GAPDH clivada da caspase-3 /, respectivamente. (C) beclin-1 knockdown células de controlo e foram tratados com MML (60 uM) durante 24 h e, em seguida, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. gráfico de barras que representa a percentagem de viabilidade celular. Todos os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com o controlo;

# p . 0,05 em comparação com o grupo tratado com MML

MML induz a autofagia através de diminuição dos níveis de p53

Foi relatado recentemente que a p53 desempenha um papel crucial na regulação da autofagia [39] – [41]. Para investigar se a p53 está envolvido na autofagia MML-mediada, assim, os níveis de proteína p53 e LC3-II foram analisados ​​por imunotransferência. Como mostrado na Fig. 6A, o tratamento de MML reduzida notavelmente os níveis de p53 em comparação com células de controlo não tratadas, mas o aumento dos níveis LC3-II. Além disso, a caspase-3 e PARP clivagens foram também aumentadas por tratamento MML. Além disso, os níveis de LC3-II e os níveis de caspase-3 e PARP clivada foram significativamente aumentados em células co-tratadas com MML e pifithrin-α (TFP-α), um inibidor de p53 farmacológica, em comparação com os tratados com MML ou PFT-α sozinho . Estes resultados indicam claramente que a redução nos níveis de p53 por MML poderia aumentar a indução de autofagia e apoptose em células A549 que albergam p53 de tipo selvagem. Para confirmar adicionalmente o papel de p53 em autofagia induzida MML, autofagossomas foram investigados por imunocoloração LC3. Como mostrado na Fig. 6B, foi observada uma acumulação significativa de LC3 pontos lacrimais em células co-tratadas com MML e TFP-α, indicando a indução de Augment autofagia por perda de p53. Além disso, a percentagem de células de anexina V /PI-positivas foi de cerca de 10% mais elevada em células co-tratadas com MML e TFP-α do que aqueles tratados com MML sozinho (Fig. 6C). Estes resultados sugerem fortemente que a autofagia e apoptose induzida MML-estão intimamente relacionados com a perda de p53.

células A549 (A) foram co-tratados com ou sem pifithrin-α (TFP-α, 20 uM) e MML ( 60 uM) durante 24 h. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.