Abstract

carcinoma de células renais renal (CCR) é o sexto tipo de câncer mais comum em os EUA. Enquanto RCC é altamente metastático, há poucas opções terapêuticas disponíveis para pacientes com carcinoma de células renais metastático e sobrevida livre de progressão dos pacientes, mesmo com a terapêutica mais novo alvo é apenas até dois anos. Assim, novos alvos terapêuticos para esta doença são desesperadamente necessários. Com base em nossos estudos anteriores mostrando metabolômica alteração de α peroxissoma activados pelo proliferador do receptor (PPAR?) Eventos relacionados, tanto na RCC paciente e materiais ratos de xenotransplante, esta via foi ainda analisada no estudo atual no cenário da RCC. PPARa é uma proteína do receptor nuclear que funciona como um factor de transcrição de genes, incluindo os que codificam enzimas envolvidas no metabolismo de energia; enquanto PPARa foi reportado para regular o crescimento tumoral em diversos cancros, não foi avaliado em RCC. Um antagonista específico PPARa, GW6471, induzida tanto a apoptose e o ciclo celular de detenção em G0 /G1 na BVS (+) e BVS (-) linhas celulares de RCC (786-O e Caki-1) relacionado com a atenuação do ciclo celular proteínas reguladoras C -Myc, ciclina D1, e CDK4; estes dados foi confirmada como específico para PPARa antagonismo por métodos de ARNip. Curiosamente, quando a glicólise foi bloqueado por vários métodos, a citotoxicidade de GW6471 foi sinergicamente aumentada, sugerindo uma mudança para oxidação dos ácidos graxos da glicólise e fornecendo uma abordagem terapêutica inteiramente nova para RCC

Citation:. Abu Aboud O, Wettersten HI, Weiss RH (2013) Inibição da PPAR? induz a paragem do ciclo celular e apoptose, e estabeleça sinergias com a glicólise inibição em células de cancro do rim. PLoS ONE 8 (8): e71115. doi: 10.1371 /journal.pone.0071115

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de abril de 2013; Aceito: 26 de junho de 2013; Publicação: 07 de agosto de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 1R01CA135401-01A1 e 1R01DK082690-01A1 (a RHW) e do Serviço Médico de os EUA Departamento de Assuntos dos Veteranos (a RHW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais (CCR) é globalmente o 13º câncer mais comum, e um dos poucos cancros cuja incidência está aumentando por razões que não são totalmente claras, mas podem estar relacionados ao tabagismo e obesidade (revisto em [1 ] e [2]). Ao longo dos últimos anos, as terapias orientadas tornaram-se cada vez mais disponíveis e têm mostrado uma promessa considerável para o tratamento de carcinoma de células renais e outros tumores malignos; No entanto, mesmo com tal expectativa de vida terapias geralmente só é prolongado por menos de um ano, devido ao desenvolvimento de resistência ao fármaco [3]. À luz do aumento do número de pacientes com a doença em estágio avançado e a prevalência da resistência às drogas atualmente disponíveis, novos alvos terapêuticos são desesperadamente necessários. A identificação de tais alvos poderiam levar tanto para a concepção de novas drogas e /ou para a reavaliação das drogas existentes para utilização em pacientes com CCR.

O peroxissoma α receptor activado por proliferador (PPAR?) Pertence ao receptor da hormona esteróide superfamília [4]. Até à data, três subtipos de PPAR (α, SS, e γ) foram identificados em várias espécies incluindo seres humanos [5]. Como ocorre com outros receptores de hormonas esteróides, após a activação do ligando, os PPARs heterodimerizar com o receptor retinóide X (RXR), se ligam à sequência de promotor específico (o elemento de peroxissoma resposta do proliferador ou PPRE), e como resultado provocar a expressão de uma variedade de genes alvo [6], incluindo aqueles envolvidos em glicose, lipídios e metabolismo de aminoácidos [7].

Os receptores PPARa têm um papel importante, embora provavelmente pleiotropic dadas as suas múltiplas funções, o papel na malignidade. Se eles funcionam como supressores de tumor ou indutores em cânceres é ainda incerto; tais funções podem relacionar com o tipo de cancro e /ou específico microambiente do tumor. Enquanto supressão do tumor por PPARa foi relatado em alguns cancros incluindo melanoma [8] e glioblastoma [9], o PPARa também foi encontrada para levar a progressão do crescimento do tumor em outros cancros, incluindo o carcinoma hepatocelular [10] e do cancro da mama [11]. No nosso estudo contínuo de cancro do rim, utilizando métodos metabolômicos, encontramos assinaturas metabólicas de modulação PPARa numa célula de carcinoma de células renais humana (Caki-1) modelo de xenoenxerto em todas as três matrizes “” (tecido, soro, e urina) [12]. Se esta conclusão é devido à causalidade da ativação PPAR na oncogênese ou se é simplesmente um câncer “assinatura” não foi determinada nesse estudo. No entanto, este resultado conduziu-nos a avaliar agonistas e antagonistas do PPARa, pela primeira vez, como potenciais terapias RCC.

A seguir se mostram, utilizando um antagonista específico PPARa, bem como métodos de siRNA, que PPARa específicos antagonismo resulta em a paragem do ciclo celular precoce, assim como a apoptose em linhas celulares de RCC. Além disso, nós fornecemos evidências de que quando as células RCC são privados do substrato glicólise, eles se tornam mais sensíveis aos antagonistas PPARa, sugerindo que as células RCC alterar suas vias do metabolismo energético sob estas condições, e apontando para a viabilidade da combinação de antagonistas PPARa e inibidor da glicólise terapia para esta doença.

Materiais e Métodos

linhas celulares

linhas de células RCC, Caki-1, e 786-S foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Rockville , MD, EUA), e o “rim normal humano” (NHK) a linha celular foi obtida a partir de Lonza (Basileia, Suíça). 786-S e células Caki-1 foram mantidas em RPMI e as células NHK foram mantidas em DMEM, ambos suplementados com 10% de FBS, 100 unidades /mL de estreptomicina, e 100 mg /mL de penicilina. As células foram mantidas em 5% de CO

2 e a 37 ° C

Materiais

lâminas embebidas em parafina fixados com formalina (eosina hematoxilina [H E] e a coloração não corado). de tecidos RCC arquivados foram obtidos a partir da UC Davis Departamento de Patologia após aprovação IRB apropriado. O agonista PPARa, WY14,643 (WY) e antagonista, GW6471 (GW) foram dissolvidos em DMSO. WY, GW, DMSO, 2-desoxi-D-glucose (2-DG), anticorpo de solução de MTT, e anticorpo monoclonal de murganho anti-actina-SS foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). 2-DG foi dissolvido em água. anticorpo policlonal de coelho anti-PARP, anticorpo anti-CDK4 monoclonal de ratinho, anticorpo anti-ciclina D1 policlonal de coelho e o anticorpo anti-c-Myc policlonal de coelho foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EUA). anticorpo anti-coelho policlonal de PPARa foi obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA, EUA). De cabra anti-ratinho e de cabra HRP anti-coelho conjugado de IgG foram obtidos a partir de Bio-Rad (Hercules, CA, EUA). Vectashield e DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3′-diaminobenzidina foram adquiridos da Vector Laboratories (Burlingame, CA, EUA). solução de ECL Plus foi obtido a partir de Thermo Fisher Scientific (Waltham MA, EUA). O siRNA de controlo mexidos PPARa e foram obtidos a partir de QIAGEN (Gaithersburg, MD, EUA). Lipofectamina RNAiMAX foi obtido a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA).

A imuno-histoquímica

RCC humana (tipos 1 e 4) e nos tecidos normais adjacentes foram desparafinadas, pré-tratada em tampão de citrato de sódio, e bloqueados no tampão de bloqueio (soro de cabra normal a 5% e 0,3% de Triton X-100 em PBS) durante uma hora à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as lâminas foram incubadas com anticorpo anti-PPARa monoclonal de ratinho da Millipore (Billerica, MA) durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram lavadas com TBST e incubadas com 0,3% de peróxido de hidrogénio em TBST durante 15 minutos. As lâminas foram lavadas com TBST, incubados com HRP de cabra anti-IgG de ratinho conjugado durante duas horas à temperatura ambiente. Após a lavagem, DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3′-diaminobenzidina foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante. Hematoxilina foi utilizado para o contador de coloração. As lâminas foram lamínulas com Vectashield.

Ensaio MTT

ensaio de viabilidade celular foi realizada como descrito anteriormente [13]. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços, e após os tratamentos indicados, as células foram incubadas numa solução de MTT mistura /meios. Em seguida, a solução de MTT foi removida e o precipitado cristalino azul em cada cavidade foi dissolvido em DMSO. absorção visível de cada poço a 540 nm foi quantificada utilizando um leitor de microplacas.

Cell Cycle Analysis

análise do ciclo celular foi realizada utilizando Muse ™ Analyzer celular da Millipore (Billerica, MA), seguindo as instruções do fabricante . Em resumo, após os tratamentos indicados, as células foram lavadas com PBS e coradas com iodeto de propídio (PI). Após a coloração, as células foram processadas para análise do ciclo celular

Apoptosis Assay

anexina V Ensaio celular mortos foi realizada utilizando Muse ™ celular Analyzer da Millipore (Billerica, MA), seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, após os tratamentos indicados, as células foram incubadas com Anexina V e inoperante Reagente celular (7-AAD) e os eventos de células mortas, tarde apoptóticas, apoptóticas cedo, e vivos foram contados.

imunotransferência

a imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [13]. Em resumo, após os tratamentos indicados, as células foram lavadas com PBS, lisadas em tampão de lise, e os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado durante uma hora à temperatura ambiente, incubou-se com os anticorpos indicados e, em seguida sondadas com peroxidase de rábano com etiquetas anti-murganho ou anticorpos anti-IgG de coelho. O sinal foi detectado utilizando ECL Além disso soluções.

Transfection siRNA

As células indicadas foram plaqueadas numa placa de seis por immunoblotting ou frascos T25 para análise do ciclo celular e ensaios de apoptose. Após 24 horas, as monocamadas de células a aproximadamente 75% de confluência foram submetidas a transfecção siRNA. A mistura de transfecção foi preparado em meio Opti-MEM GlutaMax de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) com ARNsi e Lipofectamina RNAiMAX de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração final de siRNA adicionado às células foram de 100 nM. As células foram cultivadas na presença de mistura de transfecção durante 24 h e no dia seguinte, a mistura de transfecção foi substituído por meio RPMI fresco, e a cultura celular foi prosseguida durante mais 48 horas. Após a transfecção, as células foram recolhidas por imunotransferência, análise do ciclo celular, ou ensaio de apoptose.

Análise estatística

Comparações de valores médios foram realizadas utilizando amostras independentes do teste-t. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

PPARa mostra a expressão aumentada em alto grau, em comparação com baixo grau RCC

Para começar a determinar a relevância. de PPARa na RCC, primeiro avaliou seus níveis de proteína nos tecidos grau 1 e grau 4 RCC por imuno-histoquímica. tecidos RCC arquivados tomadas a partir de amostras de nefrectomia foram avaliados por imuno-histoquímica com um anticorpo específico PPARa. tecidos RCC com um diagnóstico histológico de Fuhrman grau 4 apresentaram coloração acentuada da PPAR enquanto houve coloração mínima de grau 1 tecidos (Fig. 1). De interesse, a maioria do citoplasma em células de grau 1 foi composto se um constituinte “clear”, conhecido por ser glicogênio e lipídios, que não manchar com anticorpo PPAR? [14].

tecidos tumorais RCC de diferentes graus Fuhrman foram preparados para imuno-histoquímica, tal como descrito em Materiais e Métodos e sondadas com anticorpo PPARa. As fotomicrografias apresentados são representativos de pelo menos três pacientes para cada grupo. Bar = 50 mm.

A PPAR antagonista específico, mas não um agonista, atenuada RCC celular Viabilidade

O aumento dos níveis de PPAR observada em tecidos de alto grau fornece pouca informação sobre a funcional estado ou propriedades de sinalização deste receptor. Para começar a responder a esta pergunta, nós avaliamos o papel funcional de PPARa na viabilidade celular RCC pelo ensaio MTT. Ambos Caki-1 (tipo selvagem de VHL) e 786-O (BVS mutado) as células foram incubadas separadamente com um agonista PPARa específica, WY14,643 [15], ou um antagonista específico PPARa, GW6471 [16], em concentrações 12,5-100 uM durante 72 horas, e a viabilidade celular foi avaliada. Enquanto WY14,643 quer não teve nenhum efeito sobre, ou ligeiramente aumentado, a viabilidade celular, GW6471 significativamente e de forma dependente da dose inibiu a viabilidade celular (até aproximadamente 80%) em ambas as linhas celulares (Fig. 2).

RCC (células Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO, WY14,643 (WY), ou GW6471 (GW) nas doses indicadas de 12,5 a 100 uM durante 72 horas e um ensaio de viabilidade celular foi realizada como descrito em Materiais Métodos. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três repetições. * P 0,05 comparado com o DMSO. As barras de erro indicam o desvio padrão.

O PPAR Antagonista causada Ambos paragem do ciclo celular e apoptose em linhas celulares de

A diminuição da viabilidade celular observada após incubação de ambas as linhas de células RCC com o PPAR? GW6471 antagonista poderia ocorrer como um resultado de qualquer diminuição da proliferação, indução de apoptose, ou ambos. Para começar a responder a essa pergunta, primeiramente avaliados a proliferação celular usando métodos de citometria de fluxo. Ambos os tipos de células foram incubadas com GW6471 ou veículo DMSO durante 24 horas, após o que a análise do ciclo celular foi realizada. GW6471 prendeu o ciclo celular na fase G0 /G1, em ambas as células Caki-1 e 786-S (Fig. 3), o que sugere que o ensaio de MTT é, pelo menos em parte, indicando paragem do ciclo celular.

células RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO (Cont) ou GW6471 (GW) 25 ^ M durante 24 horas e análise do ciclo celular foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três repetições.

Para determinar se o antagonismo PPARa resultou em apoptose em adição a paragem do ciclo celular, o próximo avaliada anexina V coloração sob condições semelhantes como acima. Após o tratamento de ambas as linhas celulares com GW6471 ou DMSO durante 24 horas as células foram submetidas a análise de fluxo, após coloração com cytometery anexina V, como descrito em Materiais e Métodos. Como avaliado por classificação de células, GW6471 aumentou a quantidade de células apoptóticas totais em ambas as linhas de células Caki-1 e 786-S (Fig. 4a). Para confirmar a apoptose nestas condições, a clivagem de PARP em células tratadas com GW6471 em comparação com DMSO também foi avaliado (Fig. 4B). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a redução do sinal observado no ensaio de MTT, após incubação das células com GW6471 é devido tanto à paragem do ciclo celular e a indução de apoptose.

. células RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO ou GW6471 (GW) nas doses indicadas, durante 24 horas e um ensaio de apoptose baseia-V anexina foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. células B. RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO ou GW6471 (GW) nas doses indicadas, durante 24 horas e imunotransferência foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. ß-actina foi imunotransferidas como um controlo de carga. Os dados mostrados são representativos de pelo menos três repetições.

Para avaliar ainda mais o mecanismo de parada do ciclo celular e indução de apoptose por GW6471, medimos níveis de ciclo celular e apoptose proteínas sinalizadoras relevantes envolvidas na regulação da checkpoint G0 /G1. Ambas as linhas celulares foram tratadas durante 24 horas com GW6471, e, em seguida, o lisato celular foi imunotransferidas com CDK4, ciclina D1, e c-Myc de anticorpos; todas estas proteínas foram marcadamente diminuída pelo antagonista do PPARa, apoiando a G0 /paragem em G1 e observada, sugerindo um mecanismo para a mesma (fig. 5).

células RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratados com DMSO (Cont) ou GW6471 (GW) 25 ^ M durante 24 horas e imunotransferência foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. As imagens mostradas são representativas de, pelo menos, três pacientes para cada grupo.

siRNA Transfec�es confirmar a especificidade do PPARa Inhibitor

Para confirmar que os efeitos observados com a inibição GW6471 são específicos para PPAR? inibição, usamos uma abordagem siRNA. células Caki-1 foram transientemente transfectadas com um ARNsi PPARa ou mexidos controlo sequencial de siARN, como descrito em Materiais e Métodos. Quando comparado com o ARNsi de controlo, PPARa ARNsi atenua os níveis de proteína de PPARa (Fig. 6A), semelhante ao que foi observado com GW6471 nesta linha celular (comparar Fig. 6A a Fig. 5 painel da esquerda), confirmando tanto eficácia do siRNA e especificidade de GW6471 direcção PPARa. Várias tentativas foram feitas para transfectar células 786-S com o siRNA idêntico, mas estes não tiveram sucesso.

células Caki-1 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi PPARa a 100 nM durante 72 horas e processadas para imunotransferência, célula análise do ciclo, e ensaio de apoptose, tal como descrito em Materiais e Métodos. nível de proteína A. PPARa foi atenuada nas células transfectadas com ARNsi PPARa. B. PPARa siRNA transfecção preso ciclo celular na fase G0 /G1. C. CDK4, ciclina D1, e c-Myc os níveis de proteína foram atenuados em células transfectadas com ARNsi PPARa. D. PPARa siARN transfecção induziu apoptose. Os dados apresentados são cada representante de pelo menos três repetições.

Para confirmar que o ciclo celular e eventos apoptóticos observados com GW6471 de incubação foram, de facto, devido à inibição PPARa e não para fora do alvo efeitos da antagonista, avaliou-se as células sob condições de siRNA transfecção paralela a GW6471 incubação. siRNA transfecção de células Caki-1 preso no ciclo celular em G0 /G1 (Fig. 6B), os níveis de proteína atenuadas de CDK4, ciclina D1, e c-Myc (Fig. 6C), e induziu apoptose (Fig. 6D) numa modo idêntico ao que foi observado com o tratamento GW6471, o que indica que a paragem do ciclo celular e atenuação destas proteínas por GW6471 foi, de facto, devido ao PPARa antagonismo. Assim, os efeitos de GW6471 sobre o ciclo celular, as suas proteínas reguladoras, e apoptose resultou de PPARa antagonismo específico.

PPARa e Antagonismo glicólise inibição sinérgica atenua RCC Viabilidade Celular

Desde PPARa foi conhecido para ativar a oxidação dos ácidos graxos (FAO) e para diminuir a utilização de glicose [17], a hipótese de que PPAR antagonismo pode fazer com que as células para diminuir sua dependência em relação FAO e assim ser primorosamente dependente da glicólise para a sua fonte de energia; tal constatação sugere uma nova abordagem para a utilidade clínica de antagonistas PPARa, especialmente no que diz respeito à terapia RCC. Para avaliar esta hipótese, foram tratadas células RCC com GW6471 e /ou o inibidor da glicólise 2-DG e viabilidade celular, em seguida, medidos. Nestas condições, houve uma atenuação sinérgica de viabilidade celular com GW6471 e 2-DG. Para confirmar que a 2-DG, que compete com a glucose e, consequentemente, atenua a glicólise celular, fazendo com que as células se para diminuir a utilização de glucose, que as células tratadas com GW6471 cultivadas em meio de glucose esgotada. Tanto o tratamento e glicose exaustão sensibilizados células RCC 2-DG para PPARa antagonismo (Fig. 7), sugerindo a dependência basal de células RCC na FAO induzida por PPARa tais que as células mudar para glicose dependência quando FAO é atenuada com a inibição PPAR. Para avaliar as potenciais diferenças na RCC contra linhas celulares RTE “normais”, foram realizados experimentos paralelos em uma linha “normal” humana de células de rim (NHK) obtido comercialmente e encontrou mudanças semelhantes (Figura S1). Estes dados sugerem que a dupla inibição da PPAR e glicólise é um romance potencial e poderosa combinação abordagem terapêutica para RCC.

A. células RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 uM, e /ou 2-DG (5 mM) durante 72 horas e a viabilidade celular do ensaio foi realizado como descrito em Materiais e Métodos. células B. RCC (Caki-1 e 786-S) foram tratadas com DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 uM, meios de baixa glicose (Lo Glu), ou GW6471 em baixo teor de glucose, durante 72 horas e a viabilidade celular foi avaliada pela um ensaio de MTT, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três repetições. ** Efeito sinérgico em comparação com cada tratamento separadamente. As barras de erro indicam o desvio padrão

Discussão

RCC é o sexto tipo de câncer mais comum em os EUA e é um dos poucos cancros cuja incidência está aumentando.; a sobrevida em 5 y para pacientes com RCC metastático é um lúgubre 26% (TNM Stage IV com base em estatísticas de 2005) [18]. Para a aproximadamente um terço dos pacientes que se apresentam com doença metastática, existem vários medicamentos aprovados pela FDA disponíveis, entre eles os inibidores de multi-quinase (por exemplo sorafenib e sunitinib) [19] e o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) inibidores [ ,,,0],20]. Desde sobrevida livre de progressão, mesmo com esses novos medicamentos é um reles a dois anos, e porque quase todos os pacientes apresentando inicialmente com sucumbem câncer metastático à sua doença [21], é essencial para explorar abordagens terapêuticas inovadoras para pacientes com carcinoma de células renais metastático.

PPARa é um factor de transcrição activados por ligando que pertence à superfamília de receptores nucleares de hormonas [22]. Este receptor tem sido mostrado para estimular o metabolismo do ácido gordo de [17], para atenuar a glicólise [17], e para regular a tumorigénese através da promoção da transcrição dos seus genes-alvo [23] – [28]. Apesar extenso conhecimento dos vários alvos de PPARa, o papel exacto deste receptor na regulação do cancro é ainda incerto.

agonistas PPARa foram mostrados para diminuir o crescimento do melanoma, glioblastoma, e fibrossarcoma, e estes efeitos têm sido associados com a inibição induzida por PPARa de proliferação de células endoteliais, bem como o PPARa-dependente a sub-regulação de citocromo P450, resultando na inibição da neoangiogénese [29], [30]. Por outro lado, a activação do PPARa foi mostrada para aumentar a proliferação em linhas celulares de cancro da mama [11]. Além disso, a administração a longo prazo de agonistas PPARa cancro do fígado provocado em roedores [31], e

Pparα-

ratinhos nulos eram resistentes aos efeitos de agonistas de PPARa hepatocarcinogénico [31], [32]. Estes dados mostram que o PPARa desempenha um papel no cancro pleiotrópico, mas se ele funciona como um supressor de tumor ou uma oncoproteína parece ser altamente dependente do tipo de cancro ou mesmo tipo de célula.

Como uma base para o presente estudo, nós recentemente descoberto uma assinatura metabólica de RCC em ratinhos xenoenxertados com células de carcinoma de células renais humana (Caki-1) [12]. Nosso estudo é apoiado por um outro em cânceres do trato geniturinário comparando mRNA e miRNA profiling, que mostrou evidenciado de uma via PPAR enriquecido em RCC, mas não no cancro da bexiga [33]. Enquanto estes estudos suportam um efeito oncogénico de PPARa nos RCC, os mecanismos moleculares da tumorigénese por PPARa e uma potencial abordagem terapêutica de inibição PPARa não foram avaliadas em RCC. No presente estudo mostramos pela primeira vez que o PPARa antagonismo atenua o crescimento de células RCC através de paragem do ciclo celular /fase G1 G0 e a indução de apoptose relacionado com a diminuição da CDK4, ciclina D1, e os níveis de c-Myc.

Embora tenha havido estudos que mostram alteração up-regulação dos metabólitos relacionados PPAR? [12] e genes [33] na RCC, nenhum estudo demonstrou dos níveis reais de proteína PPAR? associados com tumorigênese. Neste estudo, que mostram um aumento no nível PPARa nos tecidos CCR vs. tecidos alto grau de baixa qualidade, o que sugere que os níveis de proteína PPARa está associada com a agressividade do RCC. Porque PPARa regula a oxidação dos ácidos gordos (FAO) através da sua transcrição do gene alvo [34], e à luz do facto de que as alterações dependentes do grau de vias de energia (incluindo FAO) proteínas tem sido relatada [35], é possível que o PPARa, pelo menos parcialmente desempenha um papel nas diferenças de agressividade e metabolismo energético em função do grau de RCC. Esta possibilidade é apoiada pela descoberta de que as células de baixo grau RCC tem mais extensa citosol claro, que consiste de lipidos e glicogénio, do que as células de grau superior [14], [36].

Para avaliar se o PPARa é um alvo terapêutico potencial viável para CCR avançado, analisou-se a eficácia de PPARa antagonismo utilizando um antagonista específico PPARa, GW6471, em linhas celulares de RCC. Os nossos dados mostraram pela primeira vez que tal manipulação causada paragem do ciclo celular G0 /G1, bem como a indução de apoptose. É possível que estes eventos estão relacionadas com alterações do metabolismo da energia que tem sido bem estudada em células normais e em muitas doenças, incluindo doenças cardiovasculares e do cancro, em que o PPARa tem sido sugerido como um alvo terapêutico [10], [17], [ ,,,0],37], [38]. Para o nosso conhecimento, a nossa é o primeiro estudo a mostrar parada do ciclo celular por inibição PPARa na RCC.

PPARa antagonismo de ambos GW6471 e uma siRNA específico mostraram decréscimos em c-Myc, ciclina D1 e CDK4. Estes resultados são confirmados por um estudo que apresentaram aumentos PPARa-dependentes de c-Myc, ciclina D1, e proteína CDK4 [39] pelo agonista PPARa WY-14643 em células de fígado de ratinho do tipo selvagem, mas não nas células nulas PPARa. O proto-oncogene celular,

c-myc,

está associada com uma variedade de cancros humanos e é fortemente implicado no controlo da proliferação celular, a morte celular programada, e diferenciação [40]. PPARa foi mostrado para estabilizar a proteína c-Myc através da repressão do let-7c miARN [41]. Assim, é possível que a atenuação da proteína c-Myc em células RCC por PPARa antagonismo foi aumentada através de deixar-7c resultando em diminuição da estabilidade da proteína c-Myc. O complexo ciclina D1 /CDK4 promove a progressão do ciclo celular através da fosforilação de pRb incluindo o seu substrato (revisto em [42]). Atenuação de c-Myc reprime a expressão da ciclina D1 /CDK4 e actividade em G1 /S de transição [43], [44]. Estas descobertas sugerem que a nossa observação de que PPARa inibição resulta em níveis de c-myc diminuiu podem ser responsáveis ​​pela diminuição da ciclina D1 /CDK4 e, assim, provocar a paragem do ciclo celular em G0 observada /G1 em células RCC.

Uma significativa encontrando, este estudo demonstrou que a inibição não só preso PPARa do ciclo celular, mas também causou apoptose em células RCC. Curiosamente, a inibição de CDK4 foi relatado para induzir a apoptose [45], fazendo com que a translocação de RelA, o principal componente de NFkB, a partir do citoplasma para o nucleoplasma e, em seguida, para o nucléolo resultando na repressão da produção de proteína anti-apoptótica incluindo survivina. Uma vez que observou-se inibição de CDK4 profunda após PPARa antagonismo, é possível que a apoptose induzida por inibição PPARa foi um resultado de, pelo menos, a atenuação de CDK4 em células RCC.

Para aumentar ainda mais o potencial de inibição de PPARa como uma abordagem terapêutica, procurámos combinação tratamentos que aumentam a eficácia do antagonista de PPAR. Uma vez que um dos papéis de PPARa envolve o aumento da FAO [10], bem como diminuir a glicólise no transcrição e níveis funcionais que conduzem a uma diminuição da piruvato e produção de lactato [17], a hipótese de que o PPARa antagonismo pode resultar em dependência aumentada das células da glicólise devido à atenuação da FAO. A nossa constatação de que a eficácia de GW6471 foi significativamente maior no meio destituído de glicose do que os meios regulares confirmou ainda mais esta suposição e ainda sugerido que o efeito sinérgico do antagonista de PPARa e tratamento de combinação 2-DG foi especificamente devido à inibição da glicólise e não para efeitos fora do alvo de 2-DG. Além disso, esta constatação apoia a futura avaliação da terapêutica dupla que poderiam ser usados ​​simultaneamente atacando assim RCC no seu calcanhar de Aquiles do metabolismo energético.

Nossas descobertas de que as células NHK mostraram mudanças semelhantes nestas condições deve ser temperada por diversas questões . Em primeiro lugar, o comportamento de todas as linhas de células, especialmente células afirmou ser “normal”, precisam ser avaliadas no seu contexto in vivo antes que as conclusões podem ser tiradas sobre o seu comportamento, devido a questões como a influência de células do estroma, bem como citocinas liberar e outras influências autócrinos. Em segundo lugar, a administração de GW6471 num modelo de coelho (4 mg /kg como uma injecção de bolus IV) [46], não resultou em alterações macroscópicas no rim ou alterações na produção de urina em comparação com os animais de controlo após 5 horas (Christopher Lotz, comunicação pessoal ).

em conclusão, apresentamos aqui pela primeira vez que (1) o PPARa é regulada positivamente em tecidos RCC alto grau em comparação com tecidos de baixa qualidade, (2) inibição PPARa atenua a viabilidade celular por meio de RCC c-myc, CDK4, ciclina D1 e diminuição mediada paragem do ciclo celular e a indução de apoptose, e (3) inibição da glicólise sinergiza com PPARa contra a viabilidade celular. Tomados em conjunto, estes dados sugerem inibição PPARa como uma nova abordagem terapêutica para o CCR avançado.

Informações de Apoio

Figura S1.

Glicose depleção sinergia com o antagonista de PPAR? ocorre em células primárias normais epiteliais de rim humano (NHK). NHK células foram tratadas com 2-DG e submetido a nenhum meio de glicose, tal como descrito na Fig. 7. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três repetições. ** Efeito sinérgico em comparação com cada tratamento separadamente. As barras de erro indicam o desvio padrão

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071115.s001

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