Abstract

Fundo

O câncer de tireóide é o sistema endócrino mais comum câncer relacionado com o aumento da incidência durante os últimos cinco anos. Os tratamentos atuais para o câncer de tireóide, tais como cirurgia ou terapia com iodo radioativo, muitas vezes exigem pacientes para estar na terapia de reposição hormonal ao longo da vida da tireóide e dadas as taxas de recorrência significativas de câncer de tireóide, são necessárias novas modalidades de prevenção. O presente estudo investiga a propriedade de um composto dietético natural encontrado em vegetais crucíferos, 3,3′-diindolylmethane (DIM), para atingir o fenótipo metastático de células de câncer da tiróide através de um receptor de estrogênio funcional.

Metodologia /Principais achados

linhas celulares de cancro da tiróide foram tratadas com estrogénio e /ou DIM e submetido a

in vitro

adesão, migração e ensaios de invasão para investigar os efeitos anti-metastáticos e anti-estrogênicos de DIM. Observamos que DIM inibe aumento mediado estrogênio na migração das células da tireóide, adesão e invasão, que também é apoiada por estudos ER-α downregulation (siRNA). Western blot e zimografia análises fornecida evidência direta para este DIM inibição mediada de E

2 aprimorados metástase associada eventos em virtude de segmentação enzimas proteolíticas essenciais, a saber MMP-2 e MMP-9.

Conclusão /Significado

Nossos relatórios de dados para a primeira vez que DIM exibe anti-estrogênica como atividade inibindo a proliferação de células de câncer de tireóide reforçada estradiol e

in vitro

metástase associada eventos, ou seja, adesão, migração e invasão. Mais significativamente, a MMP-2 e MMP-9, que são conhecidos para promover e aumentar a metástase, foram determinados como sendo alvos de DIM. Este anti-estrogénio como propriedade da DIM podem levar ao desenvolvimento de um novo suplemento dietético preventivo e /ou terapêutico para pacientes com câncer de tireóide, visando a progressão da doença

Citation:. Rajoria S, Suriano R, George A , Shanmugam A, SP Schantz, Geliebter J, et al. (2011) Estrógeno induzida metastático moduladores MMP-2 e MMP-9 são alvos de 3,3′-Diindolylmethane no cancro de tiróide. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10.1371 /journal.pone.0015879

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de outubro de 2010; Aceito: 25 de novembro de 2010; Publicação: 18 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Rajoria et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Instituto do Câncer 1R01CA131946 Nacional e financiamento clínica do New York Eye and Ear Infirmary, New York, New York. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as incidências de doenças proliferativas da tiróide (TPD), incluindo câncer de tireóide e bócio, são cada vez maiores com câncer de tireóide é o mais comum entre os cânceres endócrinos [1], [2]. Estatísticas recentes revelam 37.000 novos casos foram diagnosticados em os EUA sozinhos em 2009 e em todo o mundo quase 27 milhões de pacientes são afetados [2]. Os bem diferenciados papilar e folicular cancros da tiróide variantes representam mais de 90% de todos os cancros da tiróide e são invasivos metastático [3]. Os tratamentos actuais para a TPD inclui cirurgia envolvendo a remoção completa ou parcial da glândula tiróide, iodo radioactivo (I

131) terapia, quimioterapia ou uma combinação de todos os [4]. Estes tratamentos requerem frequentemente os pacientes a tomar hormonas de substituição da tiróide ao longo da vida [4] [5], com a taxa de recorrência sendo inaceitavelmente elevado, atingindo quase 20-30% [5], [6]. Nos últimos anos, a taxa de recorrência e não a capacidade de resposta aos tratamentos convencionais da tiróide aumentou em garantindo, assim, a investigação de novas medidas preventivas e terapêuticas de preferência utilizando compostos naturais presentes na dieta.

Dieta sempre foi de primordial importância na sua associação com o desenvolvimento do cancro e prevenção de [7] – [9]. No que diz respeito à prevenção do câncer, vários estudos têm encontrado uma associação inversa do risco de câncer com o consumo de produtos dietéticos, como o tomate, soja e vegetais crucíferos [7] – [10]. Em particular, os vegetais crucíferos, como brócolis, couve, couve-flor e repolho foram aceites por várias organizações, incluindo o Instituto do Câncer e Federal Drug Administration Nacional, para ter um efeito preventivo contra o desenvolvimento de tumores, especialmente no tecido responsivo estrogênio [7], [8 ]. Os vegetais crucíferos contêm vários produtos químicos, incluindo fito-indole-3-carbinol (I3C), que é um agente quimiopreventivo oral eficaz contra os cancros da mama e da próstata [11] – [13]. I3C converte-se espontaneamente para o seu produto dimérico, 3,3′-diindolylmethane (DIM) a um pH baixo [11] – [14]. DIM é um composto estável e uma avaliação da segurança revela que a administração a longo prazo de DIM (até 12 meses) em ratinhos não conduziu a qualquer renal evidente, cardio ou toxicidade gastro-intestinal [15]. Isto sugere que o DIM pode ser um composto bioactivo naturalmente disponíveis promissora, que pode ser usado como um agente anticancerígeno, uma vez que proporciona uma resposta mais segura e previsível.

Actualmente, o mecanismo celular e bioquímico preciso pelo qual DIM exerce os seus efeitos anticancerígenos continua a ser totalmente elucidado, mas com base na literatura disponível, DIM interfere com várias vias de transdução de sinal. Nos cancros da mama e da próstata, DIM foi observado para induzir a dose de apoptose dependente de inibição de AKT cinase e mediada por IKK fosforilação IκBα, conduzindo assim a inactivação de AKT e translocação de NFkB para o núcleo, resultando na redução do crescimento e proliferação de células [16] , [17]. Além disso, tem sido relatado que o DIM exerce os seus efeitos quimiopreventivos em cancros dependentes de hormonas, tais como cancros da mama por supra-regulação de p21

WAFI /CIP1 e a activação da via JNK [18]. Curiosamente, um alvo potencial da actividade da DIM é o metabolismo do estrogênio. Dalessandri et ai. mostrou que DIM aumentou os níveis de 2-hydroxyestrones em mulheres pós-menopáusicas com um histórico de câncer de mama, resultando em um aumento global de 2-hydroxyestrones a 16a-hydroxyestrone ratio [19] favorecendo assim as condições anti-proliferativa. Smith et ai. demonstraram que a DIM, juntamente com uma fitoestrogénio, a genisteína pode modular o metabolismo de estrogénio no sentido de 2-hidroxilação em células de cancro da próstata sensível a estrogénio [20]. Recentemente, descobrimos também no nosso laboratório que DIM pode modular o metabolismo de estrogénio em pacientes com TPD, resultando num aumento na proporção de 2-hydroxyestrones a 16a-hidroxiestrona (dados não publicados), sugerindo a utilização de compostos da dieta, tais como DIM, em prevenção TPD.

com base em todas as informações disponíveis e discutido na literatura, este estudo foi desenhado para definir o mecanismo (s) responsável pelos efeitos anti-câncer de DIM em cancro da tiróide. Relatamos DIM que pode ter efeitos terapêuticos por agindo como um agente de quimio-preventiva possuindo propriedades anti-estrogénicas em células da tiróide, em virtude de o estrogénio regular negativamente induzida fenótipos celulares de adesão, invasão e migração. Os nossos dados indicam que o anti-estrogénio como a propriedade de DIM é atribuída a segmentação da expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs), que são proteases essenciais envolvidos na adesão, migração e invasão de células cancerosas. Além disso, o fato de que as MMPs estão sob a regulação da transcrição do elemento de resposta de estrogênio (ERE) empresta mais credibilidade que DIM possui propriedades anti-estrogênicos.

Materiais e Métodos

cultura celular

Quatro linhas de células da tiróide foram utilizados neste estudo, BCPAP (linha celular de cancro papilar da tiróide humana), 8505c (linha celular de cancro papilar da tiróide humana), CGTHW-1 (linha folicular humano de células de cancro da tiróide) e ML-1 (humana carcinoma folicular). BCPAP, 8505c e CGTHW-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), penicilina 10000 Ul /ml, estreptomicina 10000 ug /ml (Mediatech) e 2 mM de L-glutamina (Mediatech), mL-1 foi cultivada em DMEM (Mediatech) suplementado com 10% de FBS, penicilina 10000 Ul /ml, estreptomicina 10000 ug /mL e 2 mM de L-glutamina. BCPAP, 8505c, linhas celulares CGTHW-1 e ML-1 foram adquiridos a partir de DSMZ, Braunschweig, Alemanha. MCF-7 (linha celular de cancro da mama humano) foi obtido de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) e cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%, penicilina, estreptomicina, insulina e L-glutamina.

análise Western Blot

as células foram colhidas utilizando 0,25% de tripsina (Mediatech), lavou-se com PBS, e lisadas (1 × 10

6/100 ul de tampão de lise) utilizando o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão [Tris-HCl 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 0,5% de NP40, 1 ^ M de Pefabloc] e incubou-se em gelo durante 30 minutos com agitação em vórtex intermitente. Os lisados ​​foram centrifugados a 14000 rpm durante 30 min a 4 ° C e o sobrenadante foram recolhidos. Os lisados ​​celulares (20 de protea) foram sujeitas a 12% de SDS-PAGE sob condições redutoras (presença de β-mercaptoetanol), como descrito anteriormente [21], [22]. Resumidamente, as proteínas foram transferidas para membranas Immobilon-P a 220 mA durante 2 h e as membranas foram bloqueadas com 4% de leite em pó em TBST [Tris-HCl a 200, pH 7,4, NaCl a 150 mM e 0,01% de Tween-20 adicionado fresco /litro de 1 × TBS (TBST)] para, pelo menos, 2-3 h num agitador à temperatura ambiente. Subsequentemente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C, quer com ER-α (Abcam, Cambridge, MA), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou o anticorpo actina (Santa Cruz Biotechnology) em TBST. As membranas foram lavadas três vezes com TBST e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano respectivo (HRP), durante 2 horas à temperatura ambiente, em TBST contendo leite a 2%. Depois de quatro lavagens com TBS-T e uma lavagem com TBS, as membranas foram desenvolvidas por ECL substrato (Pierce Rockford, IL) e autorradiografia em filmes detectado Denville.

XTT ensaio de proliferação de células

Dois mil células em 200 ul de meio foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços e incubadas durante a noite para permitir a aderência das células. O meio foi removido e 3,3′-diindolylmethane (DIM), gentilmente fornecido pelo Dr. Michael Zeligs (bioresposta, Boulder, Colorado) foi adicionada em concentrações de quer 10, 25, 50, 75, 100, ou 500 ^ M de um volume total de 200 ul e incubou-se durante 24 h. Os meios foram descartados e meios de crescimento frescos foram adicionados sem DIM seguido pela adição de 50 ul de XTT [1 mg /mL em meio RPMI isento de soro + metossulfato de fenazina (25 nM)]. Após 4 horas de incubação, o OD foi feita num leitor de microplacas a 450 nm e de referência a 630 nm. Os valores de DO médios foram calculados para cada dose nos respectivos pontos de tempo e a percentagem de sobrevivência como uma função do tempo e da dose foi usada para comparar os grupos experimentais e de controlo.

Ensaio clonogénico

Para determinar o efeito de DIM no, BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML-1 clonogenicidade células foram plaqueadas em placas de seis poços (200 células por poço). As células foram deixadas aderir durante a noite após o que meios frescos contendo 10 ±

-8 M E

2 ± 50 pM DIM foi adicionado ou deixada sem tratamento. Após 21 dias em cultura, as células foram fixadas e coradas usando 0,025% de azul de Coomassie brilhante R250 (em 50% de metanol e 10% de ácido acético) para visualizar as colónias de células. As colónias foram contadas, e determinou-se a inibição percentual de clonogenicidade nas células tratadas.

Transwell Migration Assay

BD Biocoat Controle inserções (BD Biosciences, Bedford, MA) com uma membrana de poros de 8 mm os filtros foram utilizados para o ensaio de migração, como descrito anteriormente [21], [23]. Resumidamente, as células foram deixados em jejum durante 18 horas utilizando meio de inanição [fenol meio isento de vermelho de suplementado com 10% de carvão despojado de FBS (Sigma Chemical Co.) e penicilina (10000 UI /ml)]. As células foram então colhidas por tripsinização e 2,5 × 10

4 células foram semeadas na câmara superior em 500 ul de meio contendo FBS a 1% ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM. A câmara inferior continha 750 ul de meio suplementado com FBS a 5%. Após 18 horas de incubação, as células não migram foram removidos a partir da superfície superior da membrana por esfregar suavemente com algodão com ponta cotonete. As células na superfície inferior da membrana foram então fixadas com metanol e coradas utilizando 1% de toluidina a 1% de bórax mancha azul, seguido de duas lavagens com água destilada. Inserções foram em seguida deixada airdry e contadas no campo 10X. Os dados são expressos como o número de células que migraram por 10X micrografia de campo para cada poço de amostra e normalizadas para as contagens de células obtidas a partir de controlos não tratados.

arranhões Ferida Ensaio

capacidade migratória de BCPAP, 8505c, CGTHW células-1 e ML-1 também foi avaliada por um ensaio de ferida zero. 5 × 10

5 células foram plaqueadas numa placa de seis e deixadas aderir e crescer monocamadas de células confluentes para 60-70%. Subsequentemente, três feridas foram verticais causada por poço usando um 2,5 ul ponta da pipeta estéril, seguido por remoção de quaisquer detritos celulares e as células isoladas. A monocamada de células foi então incubada feridos em meio completo fresco com ou sem 25 uM e 50 DIM e estradiol. Uma linha horizontal foi feito para permitir a visualização de células no mesmo ponto. As células foram inspeccionados três em três horas até que as células de controlo foram de raspar completamente migrado de uma extremidade da ferida para o outro, que foi de 24 horas para BCPAP, 8505c e CGTHW-1 e 48 horas para ML-1. Fotos foram tiradas logo acima e abaixo da marca horizontal usando um microscópio de luz em 5X.

A adesão celular ensaio

, 8505c, células BCPAP CGTHW-1 e ML-1 foram recolhidas como descrito e semeado a uma densidade de 5 × 10

5 células por poço em 6 bem-placas de cultura em meios suplementados com ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM ou deixada sem tratamento e deixadas a aderir durante 2 horas. Após os pontos temporais indicados, meio com células não-aderente foi descartada e os poços foram suavemente lavadas duas vezes com PBS para remover as células fracamente ligados. As células aderentes foram então raspadas e contou-se utilizando 0,4% de solução de azul de tripano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). O número de células aderentes foram contadas utilizando um hemocitómetro e o efeito de DIM sobre a adesão de células foi expresso como percentagem de diminuição na contagem de células aderentes para células tratadas com relativa DIM para controlar células.

ensaio de invasão

ensaio de invasão foi realizada como previamente descrito [21] utilizando BD Biocoat factor de crescimento reduzida câmaras Invasão Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) com filtros de membrana com poros de 8 mícrons, que foram revestidas com Matrigel. O protocolo foi essencialmente o mesmo que o ensaio de migração, excepto que o factor de crescimento câmaras reduzida de invasão de Matrigel foram re-hidratadas durante 2 horas, utilizando soro livre meio RPMI a 37 ° C antes do carregamento para células inserções. Uma vez re-hidratado, 2,5 × 10

4 células foram ressuspensas em meio RPMI (500 mL) contendo 1% de FBS com ± 10

-8-ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 pM DIM e foram cuidadosamente transferido para a superfície superior dos filtros na câmara. As células foram deixadas a invadir durante 18 horas, após o que as células foram coradas e contadas da mesma forma como descrito para o ensaio de migração. invasão percentual foi calculada com base na percentagem de células invasoras através do factor de crescimento reduzida de invasão de Matrigel câmaras em relação às células que migram através da membrana de controlo.

MMP detecção

células da tiróide foram semeadas a uma densidade de 5 × 10

5 células por poço em pratos de 6 poços de cultura e deixadas aderir durante a noite após o que foram, em seguida, transferido para meio isento de soro e incubadas com 10 ±

-8-ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM ou deixados sem tratamento por 24 horas. O meio condicionado foi recolhido, centrifugado para remover todos os detritos, e armazenaram-se aliquotas a -80 ° C até serem analisadas para a MMP-2 e a secreção de MMP-9 e a actividade conforme descrito anteriormente [24], [25]. Resumidamente, a concentração de proteína total do meio condicionado foi determinada utilizando o corante de ensaio de proteína Bio-Rad e proteínas iguais foram utilizados para cada experiência. Para zimografia de gelatina, geles de SDS-PAGE foram copolimerizados com gelatina a 0,1% (Sigma Chemical Co.) e 1 ug de proteína foi resolvido em condições de não redução. A seguir à electroforese, os geles foram lavados duas vezes em tampão de renaturação (2,5% de Triton X-100 em água destilada) durante 1 h num agitador orbital. Os zimogramas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente seguido por 36 horas a 37 ° C em tampão de zimografia (5 mM CaCl

2, 0,2 mM NaN

3 e 1 uM de ZnCl

2 em 50 mM de Tris HCl) com tampão muda a cada 12 horas. Os geles foram em seguida corados com azul de Coomassie (corante de G-250, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e descorados com 10% de metanol e 7,5% de ácido acético. A análise por Western blot foi realizada utilizando meio condicionado de células de cancro da tiróide (concentrações iguais de proteína), tal como descrito na secção anterior, utilizando a MMP-2 e MMP-9 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), anticorpos. Para a inibição de MMP, foi utilizado geral MMP inibidor de 1,10 fenantrolina (Sigma Chemical Co.). 2,5 × 10

4 células foram ressuspensas em meio RPMI (500 mL) contendo 1% de FBS com ± 10

-8-ME

2 ± 20 uM 1,10 ± fenantrolina 25 uM DIM e semeadas em BD Biocoat inserções de controle para migração e matrigel revestido inserções para a invasão, como descrito nas seções anteriores.

condições de siRNA e transfecção

para silenciar estudos de receptores de estrogénio, ER-α pequena interferência RNA (siRNA) e siRNA transfecção reagente (DharmaFECT1) foram obtidos a partir de Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). células BCPAP e MCF-7 foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se aderir durante a noite. As células foram transfectadas durante 48 horas, e as células foram colhidas subsequentemente trasfected e semeadas em BD Biocoat Controlo inserções (migração) e pastilhas revestidas de Matrigel (invasão) em meios contendo 1% de FBS ± 10

-8-ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM. células cancerosas não transfectadas tireóide tratadas com ± 10

-8 M E

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM foram utilizados como controlos positivos apropriados. Os estudos de migração e invasão foram realizadas conforme descrito nas seções anteriores.

cálculo estatístico

As experiências aqui apresentadas representam três repetições, com significância estatística determinada usando um

t

teste de Student emparelhado com uma probabilidade ( ‘

p

‘ value) ≤0.05 usado para rejeitar a hipótese nula.

resultados

as células da tireóide expressam receptores de estrogénio

a tireóide é não conhecido por actuar como um tecido responsivo estrogénio tradicional tais como da mama. A fim de determinar o estado do receptor de estrogénio em células da tiróide, utilizou-se quatro linhas de células da tiróide como os modelos de cultura de células. BCPAP e 8505c são linhas papilares de células humanas de câncer de tireóide, CGTHW-1 e ML-1 são linhas folicular de células humanas de câncer de tireóide. Observou-se que todas as linhas celulares ensaiadas tiróide expressa ambas as isoformas de receptor de estrogénio (ER), ER-ER-α e β (Fig. 1) em níveis comparáveis. MCF-7, uma linha celular de cancro da mama ER clássico expressando, foi utilizado como um controlo positivo para a detecção de ambas as formas polimórficas de ERs (ER-ER-α e β).

de proteína celular total (20 ug) foi resolvido por SDS-PAGE seguido por análise de transferência de Western para o ER-α (diluição 1:500), ER-β (diluição 1:1000) e actina (diluição 1:5000). Todas as linhas celulares utilizadas neste estudo (BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML-1) expressam tanto ER-ER-α e β em níveis comparáveis.

Efeito

DIM tem anti-proliferativa em células da tireóide

DIM, um composto natural a partir de vegetais crucíferos tem sido observado para ter propriedades anti-proliferativa contra cânceres sensíveis vários hormonais [14], [16] – [18]. Quisemos avaliar o efeito de DIM sobre a actividade proliferativa de cancro da tiróide e, a fim de fazer isso, um ensaio XTT foi realizado e os resultados são mostrados na Tabela 1. Todas as linhas de células (BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML -1) usado neste estudo foram tratados com várias concentrações de DIM para 24 horas. A inibição dependente da dose da viabilidade celular foi observada com uma inibição de 50% a uma concentração de aproximadamente 50 uM DIM durante 24 h de tratamento em todas as quatro linhas de células, BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML-1. Com base nestas observações (Tabela 1), a concentração DIM 25 mM foi utilizado para caracterizar ainda mais os efeitos da DIM sobre as células da tiróide, tanto a nível molecular e fenotípica.

DIM inibe a capacidade clonogênica da tireóide células

Uma das propriedades da indicação de células cancerosas, é a capacidade de se dividir em condições isoladas usando parácrina mínima e possivelmente mais factores autócrinos [26]. O efeito anti-cancerígeno de DIM-se na capacidade de, 8505c, células BCPAP CGTHW-1 e ML-1 a dividir-se indefinidamente foi avaliada por um ensaio de sobrevivência de células clonogénicas. Duas centenas de células por poço em placas de seis poços foram tratadas com 50? M de estradiol DIM ± durante 21 dias. Como mostrado na Tabela 2, as células da tiróide não tratados têm a capacidade de formar clones ao passo que o tratamento com estrogénio resultou em aproximadamente 8 (8505c) -33% (ML-1) aumento da formação de clones dependendo linhas celulares. DIM formação clone completamente revogada de todas as linhas de células, independentemente de terem sido tratados com estradiol. Estas experiências estabelecer a capacidade de resposta diferencial das diferentes células do cancro de tiróide ao estradiol e a actividade anti-estrogénica de DIM.

DIM reduz a capacidade migratória de células da tireóide

As células tumorais têm uma melhorada capacidade de migrar para os tecidos vizinhos e certos agentes, tais como o estradiol foram observados para auxiliar neste processo de migração. Os agentes terapêuticos que podem diminuir a capacidade destas células para migrar presumivelmente pode eficazmente reduzir o risco de metástases. Nós já demonstraram que as células da tireóide têm a capacidade de aumentar a migração em resposta ao estrogênio [21] e para determinar se DIM podem afetar o potencial migratório destas células,

in vitro foram realizados

ensaios de migração. células da tireóide esfomeados foram semeadas em uma câmara de migração Transwell com estradiol ± fulvestrant ou ± 25 um DIM e permissão para migrar. Observou-se que células da tiróide eram capazes de migrar e esta capacidade de migrar foi aumentada quando as células foram tratadas com E

2 (barras cinzentas) em comparação com células não tratadas com aumento de 30% na migração de BCPAP, 50% para 8505c, 89% para CGTHW-1 e 63% para o ML-1 (Fig. 2A). Este aumento na migração das células foi revogada quando fulvestrant foi utilizado juntamente com estradiol [barras pontilhadas) o que sugere que a capacidade migratório destas células da tiróide é influenciado por estrogénios e um antagonista de receptor de estrogénio foi revogada a migração destas células. DIM (25 uM) diminuiu significativamente a migração das células da tiróide (barras pretas). Esta redução foi observada ser de aproximadamente 37-57% e foi linha celular dependente. Além disso, a adição de estradiol juntamente com 25 um DIM (barras listradas) não melhorou a capacidade migratória de células da tireóide, significando o antiestrogen como capacidade do DIM.

(A) 2,5 × 10

4 células foram novamente suspensos em 500 mL de RPMI com FBS a 1% ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM e semeadas na câmara superior do BD Biocoat Controle inserções (8- de poro de filtros de membrana). 750 ul de RPMI contendo FBS a 5% foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após 18 horas, as células que migraram foram fixadas, coradas e contadas sob a objectiva 10X. Os grupos são não tratadas (barras brancas) como se segue-, E

2 tratadas (barras cinzentas), E

2 + fulvestrant (barras tracejadas), 25 uM DIM (barras pretas) e E

2 25 ? M DIM tratados (barras listradas). Os dados são expressos como números de células contadas (células que migraram para cada amostra) e normalizadas para o número de células obtido a partir do controlo não tratado. O asterisco indica diferenças estatisticamente significativas (

p Art 0,05) entre as amostras indicadas. ensaio ferida zero para BCPAP (B) e CGTHW-1 (C). 5 × 10

5 células foram colocadas em placas e deixadas a crescer até as monocamadas confluentes, após o que um semi ‘ferida vertical “foi criada e as células foram então deixadas a migrar na presença de 25 uM, quer 50 | iM ou DIM. As células foram visualizadas sob 5X de três em três horas e documentação fotográfica foi feita às 18 horas, quando as células migraram completamente de uma extremidade de ‘zero’ a outra extremidade em controlos não tratados.

Para validar adicionalmente o efeito de DIM na capacidade migratória das células da tiróide, um ensaio de zero ferida foi realizada, o que é um

in vivo

representação parcial do fenótipo metastático [27]. células da tiróide (BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML-1) foram cultivadas numa monocamada confluente de 60-70% seguido por formação de arranhões e incubação subsequente com ± DIM. Descobrimos que a DIM causou uma diminuição na migração das células por 50-60% (como observado visualmente) de um modo dependente da dose em células da tiróide [BCPAP (Fig. 2B) e CGTHW-1 (Fig. 2C)]. Resultados semelhantes foram observados com 8505c e ML-1 (dados não mostrados). Também observamos anteriormente que o estradiol aumenta a migração e esta migração foi inibida por fulvestrant, semelhante aos resultados do ensaio zero ferida obtidos neste estudo utilizando DIM [21].

DIM diminui a capacidade de adesão de células da tiróide

a fim de metástase com êxito, células tumorais têm de aderir à matriz extra celular (ECM) dos órgãos secundários [26], [28]. Foi avaliado o efeito de DIM na adesão de células da tiróide através da realização de um ensaio de adesão. As células da tireóide foram autorizados a aderir na presença de 10

-8 ME

2 ou ±

foi calculada 10 -6 fulvestrant M (um antagonista do receptor de estrogênio clássica) ± 25 um DIM para 2 horas e% de adesão (Fig. 3). Um aumento na adesão foi observada quando as células foram tratadas com E

2 (barras cinzentas), que foi anulada com fulvestrant (barras pontilhadas), sugerindo que a adesão é um fenótipo activa em células da tiróide, possivelmente, que requerem actividade funcional do ER. Curiosamente, foi observada uma diminuição significativa na adesão quando as células foram tratadas com 25? M DIM (barras negras), com uma diminuição de 58% na adesão para BCPAP, 42% para 8505c, 70% para CGTHW-1 e 45% para o ML-1 . Combinação de estradiol e 25 uM DIM (barras listradas) não pode melhorar a adesão de células da tiróide, sugerindo que o DIM pode impedir estrogénio melhorada a adesão e pode, potencialmente, actuar como um anti-estrogénio agente eficaz /metastático, como a diminuição da adesão celular por DIM é semelhante à diminuição da adesão observada com o fulvestrant antagonista do receptor de estrogénio.

5 × 10

5 células foram suspensas em meio completo contendo 10 ±

-8-ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM e banhados em 6 pratos bem cultura. Após 2 horas as células aderidas viáveis ​​foram removidas por raspagem e contadas por azul de tripano. Os grupos são não tratadas (barras brancas) como se segue-, E

2 tratadas (barras cinzentas), E

2 + fulvestrant (barras tracejadas), 25 uM DIM (barras pretas), e E

2 + 25 um DIM tratados (barras listradas). Os dados são expressos como% de células aderidas em comparação com células não tratadas que foram definidas como 100% de adesão. Único asterisco indica diferenças estatisticamente significativas (

p Art 0,05). Entre as amostras indicadas

DIM inibe a invasão de células da tireóide

A formação de focos metastáticos secundário por células tumorais requer a invadir o ECM de órgãos secundários [26] e inibir esta invasão é uma estratégia em que a terapia do cancro tem sido amplamente investigada. O efeito de DIM no potencial invasivo de BCPAP, 8505c, CGTHW-1 e ML-1 foi analisada através do uso de uma câmara de invasão Transwell revestida com uma matriz biológica

In vitro

(matrigel). As células da tireóide foram carregados numa câmara de Transwell com estradiol ± fulvestrant ou ± 25 um DIM e foram autorizados a invadir através do matrigel. Observou-se que células da tiróide foram capazes de invadir através de matrigel e invasão por estas células foi aumentada quando as células foram tratadas com E

2 (barras cinzentas) com um aumento de 40% na invasão para BCPAP, 36% para 8505c, 30% de CGTHW-1 e 31% para a ML-1 (Fig. 4). Este aumento na invasão de células foi revogada quando fulvestrant foi utilizado em combinação com estradiol (barras pontilhadas) o que sugere que um antagonista de receptor de estrogénio pode bloquear a propensão invasiva de células da tiróide. Para avaliar o efeito de DIM no invasão de células da tiróide, todas as linhas celulares foram tratadas com 25? M DIM (barras pretas) e uma diminuição significativa (

P

0,05) na invasão foi observada. Esta diminuição de invasão foi de aproximadamente 52% para BCPAP, 50% para 8505c, 80% para CGTHW-1 e 48% para o ML-1, quando comparado com células de controlo (normalizados para 100% e

P

0,05 ). Além disso, o estradiol pro-proliferativo, em combinação com DIM (barras listradas), não melhorou a capacidade invasiva de células da tiróide. Estes dados sugerem que DIM anula o estrogênio reforçada processos celulares de invasão, assim, possivelmente como alvo um grande passo na progressão tumoral e metástase.

2,5 × 10

4 células ressuspensas em 500 � de meio contendo 1% de FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 um DIM foram semeadas na câmara superior do fator de crescimento reduzida câmaras de matrigel invasão. 750 ul de meio de crescimento contendo 5% de FBS foi usado como quimioatractor na câmara inferior. invasão percentual foi calculada com base no número de células invasoras através das câmaras em relação às células que migram através da membrana de controlo após 18 horas. Os grupos são não tratadas (barras brancas) como se segue-, E

2 tratadas (barras cinzentas), E

2 e ICI (barras tracejadas), 25 uM DIM (barras pretas) e E

2 25 um DIM tratados (barras listradas). Os dados são representados como% invasão que é o número médio de células invadidas por 10X micrografia de campo para cada poço de amostra em relação à migração através da membrana de controlo e normalizada para o controlo não tratado. O asterisco indica diferenças estatisticamente significativas (

p Art 0,05). Entre as amostras indicadas

DIM suprime estrogênio induzida MMP secreção

MMPs são marcadores confiáveis ​​de tumor invasão celular e migração. Além disso, os tumores malignos são conhecidos por terem aumentado expressões MMP em comparação com tumores benignos, que provoca a degradação da matriz extracelular, resultando num aumento da migração e invasão de células tumorais [29], [30]. Fitoquímicos, tais como genisteína e I3C foram mostrados para atingir a actividade de MMPs e a secreção em cancros que respondem estrogénio [31].