Humana

Abstract

Fundo

metilação do DNA do promotor ilhas CpG está associada com gene supressão, e seus perfis genome-wide únicas têm sido associadas a progressão tumoral. Juntamente com tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, pode agora determinar de forma eficiente perfis de metilação do genoma nas células cancerosas. Além disso, tecnologias experimentais e computacionais tornam possível encontrar a relação funcional entre padrões de metilação específicas de câncer e seus parâmetros clínico.

Metodologia /Principais Achados

sistema methylome Câncer (CMS) é um web aplicação de banco de dados baseado projetado para a visualização, comparação e análise estatística de metilação do DNA específico do cancro humano. metilação intensidades foram obtidos a partir de MBDCap-sequenciação, pré-processados ​​e armazenados no banco de dados. 191 amostras de pacientes (169 do tumor e 22 amostras normais) e linhas de células de câncer de mama 41 são depositados no banco de dados, compreendendo cerca de 6,6 bilhões sequência mapeados exclusivamente lê. Isso proporciona retratos epigenéticas abrangentes e de todo o genoma de câncer de mama humano e câncer endometrial à data. Duas visões são propostas para os usuários a entender melhor estrutura de metilação no nível genômico ou alteração de metilação sistémica ao nível do gene. Além disso, uma variedade de faixas de anotação são dotadas de informação genómica. CMS inclui funções analíticas importantes para a interpretação de dados de metilação, tais como a detecção de regiões diferencialmente metilados, cálculo estatístico de intensidades de metilação global, vários conjuntos de genes de categorias biologicamente significativas, interatividade com UCSC através de dados de costume-track. Nós exemplos também presentes de descobertas utilizando o framework.

Conclusões /Significado

CMS fornece visualização e funções analíticas para conjuntos de dados methylome câncer. Uma coleção completa de conjuntos de dados, uma variedade de funções analíticas incorporadas e extensas aplicações com significado biológico e translacional tornar este sistema poderoso e único em pesquisa metilação câncer. CMS é livremente acessível em: https://cbbiweb.uthscsa.edu/KMethylomes/

Citation:. Gu F, Doderer MS, Huang Y-W, Roa JC, Goodfellow PJ, Kizer EL, et al. (2013) CMS: um sistema baseado em Web para visualização e análise de Genome-Wide metilação de dados de cancros humanos. PLoS ONE 8 (4): e60980. doi: 10.1371 /journal.pone.0060980

editor: Eric Y. Chuang, Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan

Recebido: 31 Julho, 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 22 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por R01 CA069065, U54 CA113001 (Programa de Biologia do Câncer Integrative), CA054174 P30 (Cancer Support Center Grant), NCATS 8UL1TR000149 (CTSA) dos Institutos Nacionais de Saúde, Texas CPRIT RP101195-C04, e por presentes generosos do Cancer terapia e Centro de Pesquisa Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metilação do DNA de promotor ilhas CpG está associada à supressão do gene em amostras de tumor comparando a contrapartida normal, e os seus perfis de todo o genoma únicas têm sido associados a progressão tumoral e podem ser usados ​​para prever a sobrevivência do paciente [1]. hipometilação global foi detectada em tumores da mama e do cólon em comparação com os tecidos normais correspondentes [2], [3]. Mais especificamente, no cancro da mama, foi demonstrado que a hipometilação do corpo do gene está associada com o silenciamento do gene, enquanto que a hipermetilação de regiões proximidade de um local de início da transcrição (TSS) tende a causar um efeito semelhante [4]. Além disso, a interacção entre a metilação do ADN e factores de transcrição (TFS) são importantes para a regulação fenótipos celulares humanas. Com o avanço da tecnologia de sequenciação, análise em larga escala de metilação do genoma torna-se viável. Vários métodos experimentais foram desenvolvidos para capturar ADN desnaturado, incluindo MEDIP [5], MBD [6], metilC [7], e RRBS [8]. Juntamente com tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, estes métodos podem agora determinar de forma eficiente perfis de metilação do genoma nas células. Além disso, vários métodos computacionais e estatísticos têm sido propostos para a análise das regiões metiladas diferencialmente (DMR). Estas tecnologias experimentais e computacionais tornam possível encontrar a relação funcional entre os padrões específicos de cancro e supressão de metilação do gene, e a sua associação com os parâmetros clínico, que conduz à identificação de candidatos a biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico [9].

Aqui nós descrevemos um sistema methylome câncer romance que recolhe sistematicamente, organiza, visualiza e analisa um grande conjunto de dados de metilação do DNA por sequenciamento de endométrio e de mama humanos. Os conjuntos de dados são obtidos usando o protocolo de MBDCap-SEQ, uma técnica usada para capturar ADN desnaturado usando um domínio de ligação a metil-CpG coluna (DMO) da proteína seguida por sequenciação da próxima geração [10]. O baixo custo e ecrã imparcial de perfis de metilação de ambas as regiões insulares não-CpG CpG e torná-lo adequado para análise do perfil de metilação do genoma. 191 amostras de pacientes (169 tumor e 21 amostras normais) e 41 linhas celulares de cancro da mama foram processados ​​com o protocolo MBDCap-SEQ, gerando um total de cerca de 6,6 bilhões sequência mapeados exclusivamente lê. Conjuntos de dados foram pré-processados ​​e armazenados em um banco de dados MySQL. CMS oferece ferramentas de fácil utilização para a rápida identificação de regiões diferencialmente metilados (DMRS) entre os diferentes grupos de amostras (por exemplo, normal contra o tumor), independentemente da sua proximidade genética. intensidades de metilação foram geradas tanto para todo o genoma (resolução em 100 pb) e gene (para cada gene anotada RefSeq) níveis. Além disso, a ontologia do gene, vias biológicas, e outros bancos de dados conjunto de genes assinatura molecular foram integrados CMS, permitindo a comparação (via metilação) de genes correlacionados funcionais e biológicas em diferentes tipos de câncer, e examinando a alteração sistémica a via biológica, função e rede de interação níveis. Os usuários podem fazer upload de seus perfis de metilação (gerados a partir de tecnologias de sequenciamento de próxima geração em 100 resolução bp) ou conjunto de genes para observar metilação diferencial comparando com nossa coleção exclusiva de tumores. Além disso, os usuários podem baixar intensidades de metilação de uma região de interesse ou o genoma inteiro para análise posterior (por clique no link na página “Recursos” do website). Com CMS, biólogos podem aceder a qualquer gene de interesse, examinar e descobrir fenômeno epigenetically significativo, tais como (mas não limitado a) diferença de metilação entre os tipos de tumores, genes com perfis correlacionados metilação e concordância, diferencialmente genes metilados dentro de um caminho, comparação de DNA marcas de metilação e modificação das histonas.

resultados

CMS integra banco de dados (a partir de dados do genoma de metilação de sequenciamento de cânceres humanos), tecnologia de interface web e funções estatísticas e analíticas poderosas em conjunto, permitindo genome- ampla perfis de metilação visualização e descoberta fenômeno biológico significativo de cancros humanos (Figura S1 no arquivo S1).

Genome-wide MBDCap-sequenciação de cancro do endométrio e mama

Um total de 232 amostras clínicas e as linhas celulares derivadas de mama humano e cancro do endométrio coortes foram processados ​​e depositada no banco de dados. Entre eles, 77 são tumores de mama, 10 amostras normais da mama, linhas celulares de cancro da mama 41 (ICBP [11]), 92 tumores do endométrio (71 amostras não-recorrentes e 21 amostras recorrentes) e 12 amostras endometriais normais. tecnologia MBDCap-sequenciação foi utilizado para detectar as regiões metiladas. fragmentos desnaturado, ligada a uma proteína domínio de ligação metil-CpG, foram eluídos para a sequenciação com a Illumina /Solexa Genome Analyzer II. Aproximadamente 12700000000 sequência lê foram gerados e 52% de leitura foram mapeados para os locais do genoma original. sequenciamento do genoma de metilação do DNA deste grande conjunto de amostras clínicas e linhas celulares fez este um estudo único de perfis methylome tumor (Figura S1 no arquivo S1). Dados de mais de 1000 amostras clínicas, incluindo ovário, oral, rectal, carcinoma hepatocelular, pulmão e cancros da próstata, eventualmente será depositado em banco de dados.

Projeto de interface web e banco de dados

a interface web foi desenvolvido em Java usando o SideCache [12] quadro, apoiada por uma biblioteca disponível publicamente JavaScript gráficos (https://www.walterzorn.de/) para o gráfico e imagem da rendição. website CMB é implantado em um servidor web Apache Tomcat (https://tomcat.apache.org/), e apoiado por um banco de dados MySQL de dados de metilação (Figura S1 no arquivo S1). Os métodos de função e analíticos embutidos no quadro foram escritos no roteiro R. Além disso, um serviço Web API também foi implementado para permitir a integração com outros sites do genoma. Esta interface web foi totalmente testado no Firefox, e está bem compatível com o Safari e Chrome. Também é compatível com o IE com uma função desactivada (consulte Visualização da seção de conjuntos de dados de metilação)

A visualização de conjuntos de dados de metilação

CMS podem ser visualizados em dois modos distintos:. Ver genômica e genética vista centric .

Genomic view.

a vista genômico é para a visualização de todo o genoma e análise de intensidade de metilação (Figura 1).

Esta página é projetado para o genome- ampla visualização e de análise de intensidade de metilação (A, B, C). intensidade de metilação é pré-calculado para um tamanho bin 100 pb e é mostrado usando uma heatmap gradiente vermelho. Uma variedade de anotações genômicas e barras de ferramentas funcionais dar aos usuários mais opções em navegar na web. Métodos estatísticos foram embebidos, incluindo análise de DMR (A) e cálculo estatístico (C). Links para UCSC navegador genoma (D) e para a vista gene (E) estão disponíveis para uma análise mais aprofundada

foram implementadas Diferentes tipos de faixas de dados para as funções de visualização genômicos (Figura 1A, B):. Genomic coordenar faixa (a localização genómica da região visualizada, incluindo cromossomo, início região e posições finais); trilha conteúdo GC (a percentagem GC na posição genômica, calculada em 100 resolução pb); h3k4me1 modificação da histona o controle de células-line GM12878 (obtida a partir de UCSC hg19 genoma de construção, mesa wgEncodeBroadHistoneGm12878H3k4me1StdSig.bigWig, liftover para hg18); faixas de conservação sequência de UCSC (obtida a partir de UCSC genoma construção hg18); CpG trilha ilha (obtida a partir de UCSC genoma construção hg18, https://genome.ucsc.edu); trilha Gene anotação (incluindo início do gene e posições finais, símbolo do gene e número de acesso); e faixa (s) Intensidade metilação (a intensidade metilação é representado pela profundidade de cor, escuro vermelho corresponde ao valor de metilação alto, branco significa baixo ou nenhum valor metilação, em 100 resolução pb). anotação detalhada é mostrado na visualização flutuante dica quando um usuário move o mouse sobre o conteúdo GC, ilha CpG e faixas de anotação gene. Um único clique na faixa (s) perfis de metilação podem gerar uma caixa de diálogo pop-up com uma intensidade de metilação (lê número para essa posição particular, esta função é desativada no IE). A faixa de intensidade de metilação é flexível com várias opções (seleccionados de “Tracks” botão drop-down na barra de ferramentas). Geralmente, existem dois tipos de intensidade de metilação faixas que os usuários podem optar por display –

indivíduo ou

Resumo

faixas. Uma faixa individual mostra a intensidade de metilação do genoma em 100 tamanho bin pb de cada tumor amostra normal /selecionada. Os usuários podem optar por apresentar um tumor única (por exemplo, mama ou do endométrio), ou todos os tumores juntos. trilha Resumo (Figura 1C, ver secção métodos estatísticos incorporado abaixo) contém estatísticas globais de média, freqüência e diferença de todos os tumores.

Uma coleção de bem desenhados ferramenta barras funcionais está incluído nesta página. Os usuários podem navegar ao redor do genoma de zoom in e out, movendo para a esquerda ou para a direita ao longo da direção genômica, ou se mudar para genes vizinhos. Os usuários podem pesquisar gene /região de interesse, digitando diretamente símbolos de genes ou coordenadas região.

análise DMR (ver secção métodos estatísticos incorporado abaixo) foi implementado no visualizador genômica. Em função DMR, os usuários podem selecionar amostras de candidatos, marcando as caixas de seleção na faixa (s) Intensidade metilação, e em seguida, preencha os parâmetros necessários (ver Materiais e Métodos). Os valores padrão são pré-selecionados. A DMR irá imprimir um arquivo em formato de texto delimitado por tabulação (ver Materiais e Métodos). Todos os arquivos de saída serão gerados sob demanda e de forma eficiente, mas pode ser limitada pela velocidade de download de rede do usuário.

Links para navegador genoma UCSC foram gerados (Figura 1D, consulte Visualização de metilação do DNA e histonas seção de dados de modificação, por exemplo, de uso). Uma lista de genes incluídos na região genômica atual é mostrado no canto inferior esquerdo da página web vista genômica, e as ligações são criadas para acessar o gene vista centrada para os genes específicos (Figura 1E).

Gene Centric Ver.

Uma forma alternativa de visualizar dados de metilação é a visão de Gene-centric que mostra a heatmap metilação de conjuntos de genes selecionados (Figura 2).

Esta página é projetado para visualização e análise de metilação intensidade ao nível do gene. Na barra de ferramentas, quatro camadas de opções estão disponíveis para permitir conjuntos de genes seleções específicas. intensidades de metilação de regiões promotoras dos genes (+/- 2 kb em torno da região TSS) foram pré-calculadas e foram mostrados usando um heatmap gradiente vermelho. Uma caixa de branco /verde no lado de símbolo do gene mostra as regiões do promotor desse gene particular, com ou sem CpG ilha (s). Clicando no símbolo do gene no lado esquerdo do painel de heatmap trará o usuário de volta para o espectador genômica centrada no gene selecionado, permitindo a visualização de padrões de metilação detalhe.

Nesta página, os usuários podem digitar um símbolo gene e visualizar o estado de metilação do gene dada em todas as amostras de tumor, juntamente com os 40 principais genes mais correlacionada com padrões de metilação semelhantes calculados pela correlação de Pearson (ver Materiais e Métodos). Alternativamente, quatro camadas de opções estão disponíveis para permitir seleções de função específica biológica, a rede de interação e conjuntos de genes correlacionados (Figura 2). Há oito classes primárias de conjuntos de genes (alguns deles podem incluir subconjuntos). Estes são predefinidas na primeira camada, incluindo genes correlacionados (ver Materiais e Métodos), cromossômicas, Gene Ontologia, conjuntos de perturbação, vias biológicas, microRNAs, fatores de transcrição, e bairro gene Câncer. Os nomes do conjunto de genes primários e as suas fontes são listados na Tabela 1 [13] – [19]. estado de metilação de um conjunto de gene escolhido pode ser visualizado para todos os tumores CMS dentro, ou quaisquer tipos de tumores de selecção do utilizador. Grandes conjuntos de genes pode retardar o tempo de processamento metilação heatmap, portanto, é preferível escolher conjuntos de genes mais pequenos para iniciar o processo. A opção “Filtro Search” permite que um usuário para encontrar todos os conjuntos de genes (exceto aqueles entre os “Genes correlacionadas”), que contêm as palavras no campo de busca.

No painel heatmap, a metilação intensidades foram pré-calculada pela média normalizada (normalização linear, ver Materiais e Métodos) lê o número dentro de +/- 2 kb de um local de início da transcrição (TSS), e foram armazenadas na base de dados MySQL. Diferente da visão genómica, o gene espectador centric é organizado da seguinte forma: amostras de tumores ou normais são dispostos em colunas, e os genes são linhas, semelhante ao formato de microarray comum. A escala de cor de heatmap gene de vista centrada é a mesma que a de vista genómico. regiões promotoras, com ou sem CpG ilha (s) são anotados com uma caixa branca /verde do lado do símbolo do gene. O painel heatmap torna possível visualizar diferentes perfis /similares /especiais de metilação (Veja Descoberta pelo uso de seção CMS) entre diferentes tipos de tumor, ou entre os genes dentro das categorias biologicamente significativas semelhantes.

Ao clicar no símbolo do gene no lado esquerdo do painel de heatmap trará o usuário de volta para o espectador genômica centrada no gene selecionado, permitindo a visualização de padrões de metilação detalhe na suas regiões vizinhas promotor, exão, intron e.

Entrada e saída

Em vista genômico, os usuários que desejam visualizar e analisar seus próprios dados pode permitir que uma faixa personalizada. Os dados enviados pelos usuários são privadas, com base na sessão (não armazenados após o fim da sessão), e não será visto pelos outros. Um outro lado, para uma região de interesse (menos de 1 Mbp, mostrado no canto inferior direito da página web de vista genómico), os usuários podem baixar as informações (em formato CAMA) para posterior análise lê.

Em vista centrada gene, que também forneceu uma opção de upload de arquivos para permitir que os usuários façam upload de seus conjuntos de genes personalizadas (apenas símbolos oficiais de genes). O conjunto de genes personalizado será mostrado como “a entrada do usuário” no botão drop-down da camada Gene Set. Os usuários também podem baixar a intensidade metilação do painel heatmap atual, clicando no botão no canto inferior direito da página.

Incorporado métodos estatísticos

hipermetilação das ilhas CpG do promotor do gene é uma das alterações mais freqüentes que levam ao câncer, e um importante mecanismo epigenético de silenciamento de genes. Para permitir a detecção das regiões de metilação diferencial entre dois grupos de amostras, a função de identificação DMR foi incorporado no quadro. No CMS, faixas methylome individuais (incluindo utilizador enviou costume-track) ou faixas de resumo pode ser atribuído a um dos dois grupos, definido como “tratados” e “controle” (veja Visualização de secção conjuntos de dados de metilação). Um algoritmo de detecção de DMR, com base em

t

-test, teste de Wilcoxon ou de correlação de Pearson pode ser seleccionado para avaliar a significância de metilação diferencial até 1 mega pares de bases. A descrição do algoritmo de DMR é fornecido nos Materiais e Métodos.

Para além da função de DMR, que também controla resumo concebido para visualizar as intensidades médias de metilação e para revelar características intrínsecas de cada grupo de tumor. Três tipos de faixas de síntese são apresentados juntos como mostrado na Figura 1C, que são: (a) Média pista, o que fornece o estado de metilação média ao longo de um determinado grupo de amostras. Atualmente, as estatísticas de resumo são avaliados ao longo i) todas as amostras, ii) Normais, tumores e linhas de células de câncer de mama, e iii) os tumores não-recorrentes do endométrio, tumores recorrentes e normal do endométrio; (B) faixa de frequência de metilação (ver Materiais e Métodos). Média e faixas de frequência fornecer informações se a alteração de metilação é a partir de amostras de maioria ou amostras minoritárias com grande intensidade de metilação; (C) música Difference, que visualiza metilação diferencial pela diferença média /freqüência entre grupos de amostras a cada tamanho de bin, como tumor vs normal médio para a mama, e não recorrente /recorrente vs normal freq para endometrial.

perfis

tumor de metilação específica

Os mecanismos de tumorigênese são diferentes entre os tipos de câncer, por isso é importante para encontrar diferenças genéticas /epigenética para posterior análise. Aqui utilizou-se o gene HOXB2 (humano homeobox B2), um membro da família Antphomeobox que codifica uma proteína nuclear com um domínio da caixa homeo de ligação ao ADN e um gene conhecido associado com o crescimento de tumores e invasão [20], [21] como um exemplo para ilustrar como CMS é capaz de determinar perfis de metilação específicas de tumor de mama e cancro do endométrio.

em vista genômico, os usuários podem digitar HOXB2 na caixa de navegação e escolha “Todos os tumores” nas faixas suspensa caixa, depois clique no botão “Atualizar View”. Para uma melhor visualização dos perfis de metilação, os usuários podem clicar no botão “zoom in” botão quatro vezes. Claramente hipermetilação foi encontrada entre os tumores de mama e normal (Figura 3A), incluindo quatro regiões (

p -valor

0,01) calculada pela função DMR utilizando os parâmetros por defeito. No entanto, hipometilação foi encontrada entre tumores do endométrio e tecidos normais (Figura 3B), incluindo uma região com

p

-valor 10

-4 (Tabela S1 no arquivo S1). Além disso, os usuários podem navegar a faixa de resumo, selecionando “Todos os resumos” na caixa drop-down faixas. A faixa média, representando centenas de faixas individuais, simplifica a visualização de regiões diferencialmente metilados dando um resultado mais intuitivo. Além disso os genes que são hipermetilado apenas em tumores da mama (comparar com normais da mama), os utilizadores podem também encontrar genes que estão hipermetilado apenas em tumores do endométrio (comparar com normais endometriais) (tal como CCDC81, Figura S2 em S1 Ficheiro), e em ambos os tumores (tais como SOX11, Figura S3 no ficheiro S1).

HOXB2 foi hipermetilado em tumores da mama em comparação com a mama normal (a), enquanto hypomethylated em tumores de cancro do endométrio em comparação com o normal do endométrio (B).

perfis de metilação similar entre genes biologicamente relacionados

genes Homeodomínio codificam fatores de transcrição que afetam a diferenciação e proliferação durante o desenvolvimento. No genoma humano, quatro grupos de genes (homeodomain HOXA, HOXB, HOXC e HOXD) são distribuídos nos cromossomas 7p15, 17q21, 12q13 e 2q31, respectivamente. genes homeodomain não agrupado são distribuídos por todo o genoma. Uma pergunta direta é “quais são os outros genes que exibem o mesmo padrão de metilação como a de HOXB2, talvez compartilhando o mesmo mecanismo de metilação?” Continuando com o processo anterior a vista genômico, os usuários podem clicar no link gene no lado inferior esquerdo para obter a vista centrada gene. Os 40 melhores genes correlacionados de HOXB2 são mostrados na Figura 4. A maioria deles tem um perfil semelhante ao metilação HOXB2, que é hipermetilado em tumores da mama (Figura 4, a caixa traço azul), e é quer hypomethylated ou não mostra nenhuma diferença em tumores endometriais comparar aos tecidos normais (Figura 4, caixa de traço verde).

gene definido com perfis de metilação semelhantes de HOXB2 foram encontradas, escolhendo o “gene Correlated” conjuntos de genes no gene vista centric. A maioria dos genes são hipermetilado em tumores de mama (caixa de traço azul), e sem diferença significativa em amostras de endométrio (caixa de traço verde).

Nos 40 genes correlacionados, três deles pertencem a HOXB família de genes (HOXB2, HOXB4 e HOXB7), três genes contêm homeodomain (Dlx1, LHX4 e VAX2) e dois deles pertencem à família de genes HIST (HIST1H3I e HIST1H4L). Um perfil semelhante metilação dos genes dentro da mesma família de genes define a concordância metilação, o que pode levar ao silenciamento de genes sincronizado. Além disso, os usuários também podem encontrar os vizinhos genômicos de HOXB2 escolhendo “cromossômica” conjunto de genes na camada de um “, chr17” na camada dois, “q” braço em três camadas e “chr17q21” na camada de quatro. Este cytoband abrange 287 genes, e abriga o gene cluster HOXB incluindo três genes (HOXB2, HOXB4 e HOXB7) sobreposto com os genes correlacionados 40 HOXB2. Note-se que os três genes são ambas da mesma família de genes e a mesma localização genómica, o que pode indicar concordância biológica significativa para aqueles genes. Os usuários podem encontrar valores em falta para vários genes em sets “cromossômicas” de genes, devido à falta de anotação transcrição do NCBI Referência Sequência de libertação (RefSeq) contida no navegador genoma UCSC ou símbolos de genes obsoletos. Este fenômeno também acontece para os outros 7 classes de categorias.

conjuntos de genes diferencialmente metilados dentro de um caminho

Para examinar a mudança sistêmica da atividade da via biológica ou funções que se referem a HOXB2 ou outra família HOX genes, examinámos o seguinte gene define para ilustrar a descoberta funcional, utilizando ferramentas de CMS. HOXB13, um membro da família HOX reside no conjunto de HOXB2 e mostra um padrão de metilação semelhante como HOXB2. HOXB13, é também um membro da “via mediada por androgénio”, como mostrado na Figura 5. Ela mostra um padrão hipermetilação distinta entre os tumores de mama, mas não de células de cancro da mama-linhas e cancros endometrial. Especificamente, o padrão hipermetilação distinta de BRCA1, SNURF, GMTM2, NROB1, CDK11B, LATS2, HRAS, MAPK3, RPS6KA3 e EGR1 demarcar estado de metilação do cluster de tumor de mama (não linhagens de células), juntamente com HOXB13.

O “sinalização mediada por androgénio” conjunto de genes que contém genes HOX de fragmentação foram seleccionados como um exemplo. Vários genes dentro da caixa de traço azul são hipermetilado em tumores de mama em comparação com tecidos normais, enquanto outros não mostram nenhuma diferença significativa. Para amostras de endométrio, não houve diferença significativa é encontrada para qualquer um dos genes entre tumores e normais.

Também comparamos os perfis de metilação de genes resistentes Tamoxifen [22], e identificaram vários genes hipermetilação em tumores de mama, tais como ACTA1, ISG15, PTK6 e SEPHS2 (Figura 1E). A maioria deles não apresentou diferença significativa em amostras de endométrio.

Visualização de metilação do DNA juntamente com os dados de modificação da histona

Um link URL conveniente para UCSC abre a região genômica atual no navegador genoma UCSC para os usuários que desejam visualizar outros dados genômicos (inferior direito da vista genômico, Figura 1D). Como alternativa, os usuários podem selecionar até quatro faixas de intensidade e exibir essas faixas, juntamente com outras faixas padrão no navegador UCSC genoma.

Por exemplo, gene DLC1 foi relatado para ter aumentado a metilação do DNA em seu local de início da transcrição (TSS ) região, enquanto diminuiu a modificação da histona em H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac na região TSS [4]. Os usuários podem digitar DLC1 na página web vista genômico, e visualizados região do TSS (CHR8: 13,033,864-13,035,942) clicando no botão “zoom in” botões e “Move”. Podemos ter a impressão geral de que os tumores de mama são hipermetilado em relação ao normais da mama, enquanto os tumores do endométrio não mostram nenhuma diferença em relação aos normais endometriais. Os usuários podem pegar 4 amostras aleatoriamente, marcando a caixa de seleção no lado direito da página para amostras de mama (por exemplo, brn80, brt22, brt69 e brt37), e, em seguida, clique no botão “Visualize as linhas selecionadas no botão do navegador UCSC Genome” em no canto inferior direito da página, para abrir uma página web UCSC. Para comparar com as faixas de modificações de histonas, os usuários precisam selecionar “completa” para cada faixa de costume e as faixas Broad histona. As faixas de modificação das histonas (Figura 6) estão em conformidade com relatório anterior [4], embora esses dados não pode vir de câncer de mama. faixas personalizadas (metilação do ADN) de cânceres de mama têm aumentado metilação (semelhante a constatação anterior) com uma exceção (a faixa 3 rd, brt22), que mostra padrões específicos de pacientes (Figura 6A). Não surpreendentemente, não houve aumento da metilação encontrado para amostras endometriais (Figura 6B).

A região TSS de DLC1 é usado como um exemplo. 4 amostras foram selecionados aleatoriamente, marcando a caixa de seleção no lado direito da página para amostras de mama (por exemplo, brn80, brt22, brt69 e brt37). A opção “full” para cada faixa de costume e as faixas Broad histona foi selecionado para a comparação de metilação do DNA e modificação da histona marcas. Resultados semelhantes foram obtidos como relatório anterior [4]. Uma exceção (3

faixa rd, brt22) foi encontrado que mostra padrões específicos do paciente (A); e não houve aumento da metilação encontrado para amostras endometriais (B).

Discussão

Em nossos estudos, HOXB2 foi usado como um exemplo para descobrir informações biologicamente significativa pelo uso de CMS . Isto é porque HOXB2 foi encontrado como um regulador do crescimento de tumores no cancro da mama [23]. Curiosamente, verificou-se HOXB2 foi hipermetilado em tecidos normais do endométrio em comparação com tumores do endométrio (Figura 3B). No estudo anterior, HOXB2 foi relatada como sendo importante em células normais do endométrio [24]. Além disso, HOXB2, HOXB4 e HOXB7 juntos mostraram a função chave na cancros do pulmão [25]. Em nosso estudo, nós também identificou que esses 3 genes são correlacionados em seus perfis de metilação. Isto pode sugerir que estes três genes funcionam em conjunto em cancros da mama e do endométrio. Além disso, HOXB13 BRCA1 e são todos de “via mediada por androgénio” (Figura 5), ​​e podem ser todas encontradas para ser hipermetilado em tumores da mama do que os tecidos normais no nosso estudo. Isso também é consistente com o relatório anterior, que HOXB13 actua como repressor da sinalização do receptor de andrógeno no cancro da próstata, o que pode afetar BRCA1 (co-fator associado com AR) [26].

Houve vários epigenética sites disponíveis na anterior publicados relatórios. Um dos mais famosos é Roteiro Projeto Epigenomics (REP) (https://www.roadmapepigenomics.org/). Este projecto foi composta por um grupo de várias bases de dados, ferramentas de navegador /visualização e ferramentas de bioinformática. Os usuários podem visualizar muitos tipos de marcas epigenéticas em seu navegador (por exemplo UCSC REP, https://www.epigenomebrowser.org/), ou fazer o download dos dados a partir de um dos repositórios de dados (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/epigenomics). Comparado com o CMS, REP é mais abrangente tanto na variedade de dados e ferramentas de derivativos. No entanto, CMS é projetado para fornecer amostras de tumores clínicos, e temos métodos estatísticos adicionais especificamente para a análise de todo o genoma e comparação dessas amostras (como detecção de DMR e genes correlacionados função).

Conclusão

neste estudo, propusemos CMS para visualização e análise de conjuntos de dados de metilação para cânceres. Um grande número de conjuntos de dados foram coletados e transformados em nosso banco de dados. Várias ferramentas estatísticas foram embutida para análise de dados. A visualização foi desenvolvido através de uma interface web baseada em Java. descobertas úteis foram feitas pela extensa aplicação deste quadro. Um grande conjunto de dados, uma variedade de ferramentas e extensa aplicação com significado biológico e translacional torna esta estrutura poderosa e única em pesquisa metilação câncer.

Tissue Espécimes, linha de células de Materiais e Métodos Comprar e MBDCap- seq

as amostras de tecido foram obtidos como parte do nosso trabalho em curso sobre caracterização de alterações moleculares no endométrio e da mama carcinomas.

as linhas celulares de cancro da mama ICBP DNA genômico foi isolado pelo Kit QIAamp DNA Mini ( Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante.