Abstract

indutor Extracelular metaloproteinases da matriz (EMMPRIN), uma proteína da membrana plasmática da imunoglobulina (Ig) superfamília, tem sido relatada a promover a invasão de células de cancro e metástases, em vários tumores malignos humanos. No entanto, os papéis das diferentes isoformas EMMPRIN e seus mecanismos associados na cabeça e progressão do cancro do pescoço permanecem desconhecidos. Usando quantitativa PCR em tempo real, descobrimos que EMMPRIN isoforma 2 (EMMPRIN-2) foi a única isoforma que foi sobre-expresso em ambos os tecidos de câncer de cabeça e pescoço e linhas celulares e que foi associada com cabeça e pescoço metástase do câncer. Para determinar os efeitos de EMMPRIN-2 na cabeça e progressão do cancro do pescoço, nós transfectadas células cancerígenas de cabeça e pescoço com um vector de expressão EMMPRIN-2 e EMMPRIN-2 siRNA para modular exogenamente EMMPRIN-2 expressão e analisou a importância funcional do EMMPRIN-2 em cabeça e pescoço invasão e metástase do câncer. Descobrimos que EMMPRIN-2 promoveu cabeça e invasão de células do cancro do pescoço, migração e adesão in vitro e aumento da metástase pulmonar in vivo. Estudos mecanísticos revelou que EMMPRIN-2 sobre-expressão promovida a secreção de moléculas de sinalização extracelulares, incluindo as metaloproteinases de matriz-2 (MMP-2), do tipo uroquinase activador de plasminogénio (uPA) e catepsina B, em células de cancro da cabeça e do pescoço. Enquanto a MMP-2 e uPA tem sido demonstrada ser importantes mediadores da sinalização EMMPRIN, o papel da catepsina B em cascatas moleculares EMMPRIN-mediadas e tumorigénese não foi estabelecida. Descobrimos que EMMPRIN-2 e sobre-expressão de catepsina B a regulação negativa inibiu significativamente a invasão, migração e adesão de células Tca8133, sugerindo que a catepsina B é necessária para a migração de células EMMPRIN-2 aumentada e invasão de cancro da cabeça e pescoço. Os resultados do nosso estudo demonstram o importante papel da EMMPRIN-2 na progressão da cabeça e pescoço câncer pela primeira vez e revelam que o aumento da secreção extracelular de Catepsina B pode ser um novo mecanismo subjacente a progressão do tumor EMMPRIN-2 melhorado no câncer de cabeça e pescoço.

Citation: Huang Z, Tan N, Guo W, Wang L, Li H, Zhang T, et al. (2014) sobre-expressão de EMMPRIN de isoformas 2 está associada a Head and Neck Cancer Metástase. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10.1371 /journal.pone.0091596

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de novembro de 2013; Aceito: 12 de fevereiro de 2014; Publicação: 04 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (# 81.101.592, a Z. Huang) e província de Guangdong Natural Science Foundation (# S2013010014794, a Z. Huang) e pelos prêmios da hospedeiros de bordo Medical Research Institute (# 062.545, a Z. Guo) e por doações do National Science Foundation Natural da China (# 81.272.951, para J.Li). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Head and neck cancer (HNC) é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1], e tornou-se mais prevalente nos países em desenvolvimento durante a última década [2]. Mais de 650.000 novos casos de HNC são diagnosticados a cada ano no mundo [3], [4]. Só na Europa, aproximadamente 143.000 novos casos e mais de 68.000 mortes ocorrem devido à doença a cada ano [4]. Cirurgia combinada com quimioterapia e radioterapia é agora aceite como o tratamento mais eficaz para pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas. No entanto, a taxa de mortalidade por câncer de cabeça e pescoço não mudou significativamente nos últimos 30 anos, ea taxa de sobrevivência de 5 anos continua a ser inferior a 50% [2]. falha do tratamento foi principalmente atribuída à recorrência local e metástases à distância [5]. Actualmente, as decisões terapêuticas são feitas com base em parâmetros clínico-patológicas, incluindo a idade, o nó tumor fase de metástase, e grau histológico. Embora útil, esses fatores muitas vezes não conseguem fornecer informações precisas sobre as características biológicas dos tumores [3]. Portanto, insights sobre as alterações moleculares associadas com a cabeça e metástase do cancro do pescoço irá fornecer insights críticos sobre os mecanismos fundamentais subjacentes cabeça e progressão do câncer de pescoço e contribuir ainda mais para a melhoria da gestão clínica dos pacientes com câncer de cabeça e pescoço.

extracelular indutor da metaloproteinase de matriz (EMMPRIN), também conhecido como CD147 ou basigin, é uma proteína de membrana do plasma da imunoglobulina (Ig) superfamília e foi denominado com base na sua função de induzir a produção de metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs), das enzimas-chave que estão envolvidas na manutenção da integridade e volume da matriz extracelular (ECM) [6]. EMMPRIN participa numa variedade de fisiologias de células normais, incluindo a capacidade de resposta de linfócitos, processos reprodutivos femininos, e o transporte intracelular [7] – [9]. expressão elevada EMMPRIN tem sido correlacionada com a progressão do tumor em gliomas, tumores de células gigantes do osso, carcinoma de células escamosas da laringe, carcinoma do ovário seroso e melanomas [10]. EMMPRIN promove a progressão do câncer, aumentando a invasão de células de câncer e metástase. A importância funcional da EMMPRIN durante a progressão do tumor foi principalmente atribuída à sua capacidade para estimular a produção de MMPs [8] – [10]. Em células tumorais, EMMPRIN promove a produção de MMP-1, MMP-2 e MMP-9 e facilita a síntese de MT1-MMP e MT2-MMP [11] – [13]. Além disso para mediar a degradação da ECM, EMMPRIN desempenha papéis multifuncionais na progressão do cancro. Por-se-regulação da expressão de VEGF e o seu principal receptor, VEGFR-2, em ambas as células de tumor e células endoteliais, EMMPRIN pode promover a angiogénese, o que é um evento crítico, não só durante o crescimento do tumor, mas também durante a metástase de células de cancro [14], [15]. EMMPRIN também pode actuar como uma molécula de adesão e interagir com β1-integrina [16], [17]. Muitas outras moléculas foram relatados para interagir com EMMPRIN, incluindo caveolin-1, uPA, transportadores de monocarboxilatos (MCT), e CYP450s [18].

Devido ao splicing alternativo, pelo menos 4 diferentes variantes de ARNm que codifica EMMPRIN diferentes isoformas da proteína EMMPRIN (EMMPRIN-1 a -4) foram identificadas. Entre estes quatro variantes, EMMPRIN-2 é a isoforma mais abundante expressa em células tumorais [19]. EMMPRIN-1 codifica a mais longa, isoforma específica do retina, que se distingue por um domínio de tipo Ig adicional (três domínios semelhantes a Ig no total) na porção extracelular [20]. As outras duas variantes, EMMPRIN-3 e EMMPRIN-4, foram pela primeira vez identificado em células estromais do endométrio humano e linhas de células de carcinoma cervical [19]. EMMPRIN-3 é a isoforma mais curta, que consiste em apenas um domínio de tipo Ig na sua porção extracelular [21], e que interage com o complexo internalizado EMMPRIN [19].

EMMPRIN O nosso estudo anterior identificou receptor-ligando como um alvo eficaz para a imunoterapia para carcinoma de células escamosas de língua [22]. No entanto, as características precisas das isoformas EMMPRIN e seus papéis na iniciação e progressão do câncer de cabeça e pescoço permanecem desconhecidos. Enquanto EMMPRIN isoforma 3 é um regulador negativo demonstrado na proliferação e invasão de células cancerosas [23], EMMPRIN isoformas 1, 2 e 4 tem sido sugerido que desempenham um papel oncogénica em malignidades humanas, incluindo o cancro oral. Neste estudo, nós investigamos os papéis fundamentais das isoformas EMMPRIN na progressão do cancro de cabeça e pescoço. Nossas descobertas demonstram o importante papel da EMMPRIN-2 e seus mecanismos associados em cabeça e pescoço invasão e metástase de câncer pela primeira vez.

Materiais e Métodos

1. tecidos humanos e linhas celulares

Um total de 51 pares de tecidos de câncer de cabeça e pescoço e correspondentes tecidos não tumorais adjacentes foram coletados 2009-2011 no Departamento de Cirurgia Oral e Maxilofacial, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Universidade Yat-Sen, Guangzhou, China. As amostras de tecidos foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido após a ressecção e armazenado a -80 ° C. Ambos os tecidos não tumorais, tumorais e adjacentes foram examinados histologicamente. consentimento informado por escrito foi obtido para a recolha de todos os materiais humanos, eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Sun Yat-sen Memorial Hospital da Universidade de Zhongshan. Todas as amostras foram colhidas a partir de pacientes antes do tratamento clínico. As características clínicas dos pacientes foram resumidos na tabela 1.

As linhas de células de câncer de cabeça e pescoço Tca8113 e ACCM foram gentilmente cedidas pelo Colégio de Estomatologia da Shanghai Jiao Tong University (Xangai, China) [24 ], [25]. células TSCCA foram gentilmente cedidas pela Sun Yat-Sen University Cancer Center [26] e da fonte de células SCC25 foi descrito na nossa publicação anterior [27]. As linhas celulares Tca8113 ACCM e foram cultivadas em RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), enquanto que as linhas de células e TSCCA3 SCC25 foram cultivadas em DMEM (Invitrogen de Carlsbad, CA). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 100 UI /mL de penicilina G e 100 ug /mL de sulfato de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e as células foram cultivadas em 37 ° C incubadoras contendo 5% de CO

2 e uma atmosfera húmida.

2. A transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real

O ARN total foi extraído dos tecidos ou células, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. DNA complementar foi sintetizada com o Kit Prime-Script RT Reagente (Takara, Dalian, China). RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) foram realizadas com SYBR Premix Ex Taq (Takara). Os iniciadores utilizados são mostradas na Tabela S1.

3. Western Blotting

As células foram lisadas em NP-40 tampão de lise contendo um cocktail inibidor da protease e um cocktail de inibidores de fosfatase (Roche, Rotkreuz, Suíça). Após a separação utilizando SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, EUA). Subsequentemente, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite não gordo em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween-20 durante 1 hora à temperatura ambiente. Os blots foram sondados com os anticorpos primários relevantes durante a noite a 4 ° C, lavadas e sondadas com um anticorpo secundário conjugado peroxidase de rábano-específicas da espécie (Cell Signaling, Beverly, EUA). Um método de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL Western Blotting Pierce Substrato, thermol, Beverly, MA, EUA) foi utilizado para visualizar as manchas. Os anticorpos primários utilizados foram anti-EMMPRIN, anti-MMP-2, anti-uPA, anti-catepsina B (Santa Cruz Biotechnology, EUA), e anti-β-actina (Sigma-Aldrich, MO, EUA).

4. EMMPRIN-2 O plasmídeo construtos, transfecção, a produção de lentivírus e estabelecimento de linhas celulares que expressam estavelmente

O lentiviral vector de expressão EMMPRIN-2-pWPXL EMMPRIN-2 foi construído substituindo o fragmento do vector GFP pWPXL (plasmídeo Addgene 12257 , Didier Trono) com a sequência de codificação de EMMPRIN-2 (número de acesso NM_198589), que foi amplificado a partir da biblioteca de ADNc de fígado humano usando EcoRI e BamHI como enzimas de clonagem. Os oligonucleótidos foram sintetizados para gerar shRNAs recozimento que tiveram como alvo a sequência de EMMPRIN-2 a partir da posição 430-449 (5′-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 ‘) e a sequência de catepsina B a partir da posição 670-689 (5’-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 ‘). As sequências dos oligonucleótidos para as construções de plasmídeos são listados na Tabela S2. Os fragmentos foram clonados separadamente no vector pLVTHM (Addgene plasmídeo 12247, Didier Trono), utilizando os locais de restrição MluI e ClaI. partículas lentivirais foram colhidas 48 horas após a co-transfecção de pWPXL-EMMPRIN-2 ou pLVTH-shRNA com psPAX2 e pMD2.G em células HEK-293T utilizando Lipofectamina 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). As células alvo (Tca8113 e ACCM) foram transduzidas com lentivírus recombinante mais 6 ug /mL de polibreno (Sigma-Aldrich). Após 2 semanas de cultura em uma incubadora a 37 ° C que contém 5% de CO

2 e uma atmosfera húmida, o ARN total e as proteínas foram extraídas e a expressão de EMMPRIN-2 ou catepsina B foi ainda verificado utilizando Western blot e RT-quantitativa PCR [28].

5. Em ensaios de migração e invasão in vitro

Para os ensaios de migração Transwell, 2 × 10

4 células foram plaqueadas na câmara superior de cada inserto (BD Biosciences, NJ). Para os ensaios de invasão, 1 × 10

5 as células foram plaqueadas na câmara superior de cada molde de inserção, que tinham sido revestidas com 150 ug de Matrigel (BD Biosciences, MA). As células em ambos os ensaios foram tripsinizadas e ressuspensas em DMEM, e 700-900 mL de meio que tinha sido suplementado com soro de bovino fetal a 10% foi adicionado para as câmaras inferiores de cada poço. Após 12 horas de incubação a 37 ° C, as células restantes nas primeiras câmaras ou nas membranas superiores das inserções foram cuidadosamente removido, e as células que tinham migrado ou invadido para dentro das câmaras inferiores foram fixadas e coradas com uma solução de corante contendo 0,1% de violeta de cristal e 20% de metanol. As células que migram e que invadem foram fotografadas e contadas utilizando um microscópio invertido IX71 (Olympus, Tóquio, Japão). Os mesmos experimentos foram realizados um mínimo de três vezes.

6. Adesão Celular Ensaio

Um ensaio de adesão celular foi realizado de acordo com o protocolo que foi descrito em uma publicação anterior [29]. Para este ensaio, placas de 96 poços de cultura de fundo plano foram revestidas com 30 ug de Matrigel (BD Biosciences, MA) em meio DMEM durante 3 horas a 37 ° C. As placas que tinham sido revestidos com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente serviram como controlos negativos. As células foram recolhidas utilizando tripsina /EDTA, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em DMEM. As células (2,5 x 10

4) foram adicionados a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. As placas foram agitadas a 1000 rpm durante 30 segundos e lavadas três vezes com DMEM para remover células não ligadas. As células que permaneceram ligados às placas foram quantificadas utilizando o Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Ensaio (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções recomendadas pelo fabricante. Após subtracção da ligação de poços revestidos com BSA-celular de fundo, a percentagem de células aderentes foi calculada dividindo a densidade óptica das células aderentes por que da entrada inicial de células. Finalmente, as células que haviam sido fixadas e coradas numa solução de corante contendo 0,1% de violeta de cristal e 20% de metanol foram fotografadas usando um microscópio invertido IX71 (Olympus). Todas as experiências de adesão foram conduzidos em cavidades em triplicado e repetidas um mínimo de três vezes.

7. modelos de ratos para análise in vivo da metástase

Para o

in vivo

análises das capacidades metastáticas das linhas celulares, cada ratinho nu (dez por grupo, macho BALB /c-nu /nu ) foi cauda-injectados intravenosamente com 1 × 10

6 Tca8113 células que expressam de forma estável células EMMPRIN-2 ou Tca8113 que expressam o vector vazio. Os ratinhos foram sacrificados após 6 semanas, e os pulmões foram dissecados, fixados com formalina neutra tamponada com fosfato e embebido em parafina. focos metastáticos nos pulmões foram contados microscopicamente em H E-secções de tecido corado. Os ratos foram manipulados e alojados em conformidade com os protocolos que tinham sido aprovados pela Comissão de Shanghai Medical Experimental cuidados animais eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Shanghai Medical College, Universidade de Fudan.

8. Gelatina ensaio de zimografia

O ensaio de zimografia de gelatina foi realizada para determinar a actividade da MMP-2 [30]. Resumidamente, as células foram incubadas em meio isento de soro, e o meio foi recolhido após 24 horas. Forma de um número igual de células foi separada utilizando 10% de gel de acrilamida contendo 1 mg /ml de gelatina Tipo A (Sigma-Aldrich). Os géis foram incubados numa solução 2,5% de Triton-X-100 à temperatura ambiente com agitação suave para remover o SDS e re-natureza a MMP-2. Os géis foram então incubados no desenvolvimento de tampão (Tris-HCl a 50, NaCl 0,2 M, CaCl 5 mM de

2, e 0,02% de Brij35) durante 24 horas a 37 ° C para induzir a lise de gelatina pela MMP-2 renaturada. Após a reacção, os géis foram corados com solução de coloração (0,1% de Azul Brilhante de Coomassie R250, metanol a 30%, e 10% de ácido acético) durante 1 hora e descorado numa solução contendo 30% de metanol e 10% de ácido acético. As imagens dos geles foram adquiridos utilizando o ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Os mesmos experimentos foram realizados um mínimo de três vezes.

9. Ensaios ELISA

preparação

Amostra: As células (2 x 10

6) foram adicionados a cada placa de 10 cm e cultivadas durante 24 horas. Para remover as células não ligadas, as placas foram lavadas três vezes com meio isento de soro. Em seguida, as células foram incubadas com 15 ml de meio isento de soro, e o meio foi recolhido usando um Ultra 15 ml 10K coluna Amicon (Millipore) após 24 horas. actividade de uPA, as concentrações de catepsina B de MMP-2 e foram quantificados usando um uPA Actividade Assay Kit (Millipore), um humano MMP-2 Quantikine Kit ELISA (R D Systems) e um kit de catepsina B humana Duo Set (R D Systems) de acordo com os protocolos recomendados fabricantes. Todas as análises das amostras foram realizadas em triplicado e repetidas um mínimo de três vezes.

10. Análise estatística

Os resultados são apresentados como a média +/- o erro padrão da média (SEM). As diferenças entre os grupos foram avaliadas usando análise de uma via da variância (ANOVA) ou teste t de Student bicaudal, como especificado nas legendas da figura correspondentes.

P Art 0,05 foi definido como o nível de significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 17.0.

Resultados

1. EMMPRIN-2 é sobre-expressos em câncer de cabeça e pescoço e está associado ao câncer de cabeça e pescoço metástase

Apesar de expressão alterada de várias isoformas EMMPRIN tem sido implicado a desempenhar um papel na HNC tumorigênese, as contribuições individuais dos diferentes EMMPRIN isoformas para a iniciação e progressão de HNC permanecem obscuros. Para melhor elucidar os papéis das isoformas EMMPRIN em HNC, examinámos a expressão de diferentes isoformas EMMPRIN em tecidos e linhas celulares de HNC. A expressão de todos os 4 isoformas EMMPRIN foi examinado pela primeira vez em 12 casos de tecidos de câncer oral, utilizando quantitativa PCR em tempo real. Enquanto EMMPRIN isoformas 1, 2 e 4 apresentaram expressão relativamente abundante, EMMPRIN isoforma 3 era dificilmente detectáveis ​​em tecidos de cancro oral testados (Figura S1). Portanto, o nosso estudo contínuo focada nos papéis de isoformas EMMPRIN 1, 2 e 4 na cabeça e progressão do câncer de pescoço. A expressão de EMMPRIN isoformas 1, 2 e 4 foi analisado em 51 tumores HNC e seus tecidos orais normais correspondentes usando RT-PCR quantitativo. Como mostrado na Figura 1A, EMMPRIN-2 e EMMPRIN-4 parecem ser os principais isoformas que foram expressas em tecidos da cabeça e pescoço, enquanto EMMPRIN-1 apresentada apenas muito baixos níveis de expressão. Observou-se que EMMPRIN-2 era a única isoforma EMMPRIN em que os níveis de expressão de mRNA foram significativamente aumentada nos tumores, em comparação com os tecidos adjacentes correspondentes não cancerosos (Fig. 1a). Aproximados dos aumentos de 2 vezes (C /A, 1,90) em média níveis de expressão EMMPRIN-2 foi detectada em tecidos de tumor ao longo dos controlos normais adjacentes. Não houve diferenças significativas em EMMPRIN-1 e EMMPRIN-4 expressão de mRNA foram detectados entre os tumores e os tecidos não cancerosos adjacentes (Fig. 1A).

(A) a expressão do mRNA EMMPRIN em 51 cabeça e tecidos de câncer de garganta e os tecidos não-cancerosas adjacentes foi analisada utilizando qPCR. EMMPRIN 2-expressão de ARNm em tecidos de tumor da cabeça e pescoço é mais elevada do que nos tecidos não cancerosos adjacentes (

P

0,01). Não foram observadas diferenças significativas na EMMPRIN-1 e EMMPRIN-4 expressão de mRNA entre os tecidos tumorais e os tecidos não cancerosos adjacentes (

p Art 0,05). (B) Comparação de EMMPRIN 2-expressão de ARNm de entre 26 casos de tumores metastáticos e 25 casos de tumores sem qualquer sinal de metástases locais e distantes. EMMPRIN-2 expressão do mRNA foi significativamente aumentada em tecidos de câncer de cabeça e pescoço metastático em comparação com tecidos de cabeça e pescoço câncer não metastático (

p Restaurant 0,05). detecção (C) qPCR da expressão de mRNA EMMPRIN em linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço. (D) Detecção de expressão EMMPRIN em linhas de células de câncer de cabeça e pescoço utilizando Western blot. Altos níveis de proteína codificada pelo gene EMMPRIN-2 foram detectados em todos os quatro das linhas celulares de cancro.

Para determinar a associação entre EMMPRIN 2-expressão e a progressão e metástase de HNC, nós em comparação a expressão do mRNA EMMPRIN-2 em 26 casos de tumores metastáticos e 25 casos de tumores sem qualquer sinal de metástase local e distante. Embora marginalmente expressão aumentada EMMPRIN-2 foi detectada em tumores em comparação com os tecidos normais adjacentes a partir de pacientes com tumores não-metastáticas (Fig. 1B), marcadas diferenças na EMMPRIN-2 de expressão foram observados entre tumores e tecidos normais de controlo de pacientes com metástases tumores (Fig. 1B). Além disso, EMMPRIN-2 foi significativamente maior do que nos tumores metastáticos em tumores não-metastáticas (Fig. 1B). Não houve diferenças significativas no sexo ou idade dos pacientes com tumores metastáticos e não-metastáticos foram encontrados.

As conclusões dos tecidos HNC foram confirmados pelas análises realizadas nas linhas de células de carcinoma epidermóide (ACCM, Tca8113, TSCCA e SCC25). EMMPRIN-2 e EMMPRIN-4 foram os principais isoformas que foram expressos em todas as linhas de células de 4, e os níveis de expressão relativos de EMMPRIN-2 foram muito mais elevados em linhas celulares de cancro (que variam 0,05-0,15, Fig. 1C) do que na os tecidos não-cancerosas HNC (com uma média de cerca de 0,01, a Fig. 1A). Altos níveis de proteína que foram codificados pelo gene EMMPRIN-2 também foram detectadas em todas as linhas celulares de cancro, utilizando 4 western blot (Fig. 1D).

2. EMMPRIN-2 promove a cabeça e invasão de células do cancro do pescoço, migração e adesão in vitro, e metástase in vivo

Para determinar os papéis funcionais de EMMPRIN-2 sobre-expressão na invasão, migração e adesão de células HNC , que experimentalmente sobre-expressos e regulados negativamente EMMPRIN-2 num vector de expressão utilizando exógeno EMMPRIN-2 e expressão do siRNA (siEMMPRIN-2) nas linhas celulares de cabeça e pescoço, e ACCM Tca8113. Como mostrado na Figura 2, a expressão aumentada de EMMPRIN-2 promovida cabeça e a invasão de células do cancro do pescoço, adesão e migração, tanto no ACCM e linhas celulares Tca8113. Em contraste, experimental sub-regulação de EMMPRIN-2 utilizando siRNA atenuada invasão celular, migração e adesão nas linhas de células testadas (Fig. 2A, B e C).

superexpressão exógena de EMMPRIN-2 utilizando uma expressão construção de cabeça aumentada e invasão de células do cancro do pescoço (A), a migração (B) e adesão (C), enquanto que a regulação negativa da EMMPRIN-2 utilizando siRNA (siEMMPRIN-2) suprimiu cabeça e invasão de células do cancro do pescoço (A), a migração ( B) e aderência (C). As diferenças na invasão celular, migração e adesão entre os grupos concep- ou transfectadas com ARNsi e os controlos simulados foram estatisticamente significativas (

P

0,05). Os efeitos de 2-EMMPRIN expressão sobre a metástase do tumor in vivo foram investigados em modelos de ratinho nu. (D) Tca8113 de cabeça e pescoço linhas celulares de cancro com estavelmente expressa EMMPRIN-2 ou um vetor de controle simulado foram injectados intravenosamente em ratinhos nus. focos metastáticos nos pulmões de ratinhos nus foram calculados na semana 6 após a injecção. O número médio de focos metastáticos nos pulmões dos murganhos com os EMMPRIN-2 células que expressam foi de 28,4 em comparação com 6,4 nos pulmões dos ratinhos injectados com células portadoras do vector de controlo (

P

0,01).

Nós estendemos ainda mais as nossas observações in vitro para analisar os efeitos da EMMPRIN-2 sobre a metástase de células HNC in vivo. Tca8113 células que sobre-expressam de forma estável EMMPRIN-2 ou o vector de controlo foram injectados intravenosamente em ratinhos nus por meio da veia da cauda. Os ratinhos foram sacrificados 6 semanas após as injecções e os pulmões foram dissecados, fixados com formalina neutra tamponada com fosfato e embebidos em parafina. focos metastáticos nos pulmões dos ratinhos nus foram contadas microscopicamente em H E coradas secções de tecido. números significativamente maiores de focos metastáticos foram observadas nos pulmões de ratinhos que tinham sido injectados com células expressando Tca8113 EMMPRIN-2. O número médio de focos metastáticos nos pulmões de ratinhos com os EMMPRIN-2 células que expressam foi de 28,4, comparada com 6,4 nos pulmões de ratinhos que tinham sido injectados com células Tca8113 ostentam o vector de controlo (Fig. 2D).

3. EMMPRIN-2 superexpressão promove a secreção das moléculas de sinalização extracelulares de MMP-2, e catepsina B de uPA em células de cancro do pescoço e

EMMPRIN foi bem demonstrada para melhorar a invasão de células de cancro em várias malignidades humanas, aumentando a expressão das moléculas de sinalização extracelulares de MMP-2 e uPA [6], [10], [31], [32]. Além disso, a catepsina B, um membro da família proteolítica enzima lisossómica catepsina, também tem sido relatado que desempenham papéis cruciais na invasão e metástase [33] do cancro. Para identificar os mecanismos subjacentes que regem os efeitos de EMMPRIN-2 na invasão de células de cancro e metástases, examinámos a expressão e secreção do uPA, a catepsina B e a MMP-2 em células de cancro do pescoço e depois exogenamente que modulam a expressão de EMMPRIN-2. A transfecção de um vector de expressão EMMPRIN-2 ou siRNA (siEMMPRIN) selectivamente aumentada ou atenuou a expressão de EMMPRIN-2 ao nível do ARNm, tanto no ACCM e células Tca8113, enquanto que a expressão das outras isoformas EMMPRIN, uPA, catepsina B e MMP -2 permaneceram inalterados (Fig. 3A). Resultados similares foram observados quando a expressão da proteína foi detectada usando western blot (Fig. 3B).

Os níveis de expressão de mRNA de uPA, catepsina B, MMP-2 e diferentes isoformas EMMPRIN em cabeça e pescoço células cancerosas (A) foram examinadas após expressão exógena de EMMPRIN-2. A transfecção de um vector de expressão EMMPRIN-2 ou siRNA (siEMMPRIN) selectivamente aumentada ou atenuados os níveis de expressão de ARNm de EMMPRIN-2 em ambas as células Tca8113 ACCM e, enquanto a expressão de outras isoformas EMMPRIN, uPA, catepsina B e MMP-2 permaneceram inalterados (

p Art 0,05). resultados de expressão de (B) o mRNA foram confirmadas por análise de expressão de proteína utilizando Western blot. (C) Detecção de extracelular de MMP-2, catepsina B e uPA utilizando ELISA. MMP-2, a secreção de catepsina B e de uPA no meio de cultura foi aumentado em células que tinham sido transfectadas com o vector de expressão EMMPRIN-2, enquanto a secreção foi diminuída em EMMPRIN-2 siRNA células transfectadas (

P

0,05). (D) Análise de actividade extracelular da MMP-2 utilizando um ensaio de zimografia de gelatina. Extracelular actividade MMP-2 foi aumentada após EMMPRIN-2 foi aumentada, enquanto que a actividade de MMP-2 foi reduzida após EMMPRIN-2 knockdown expressão.

Além disso, foram examinados os níveis extracelulares de todas as três proteínas usando ELISA. Os níveis extracelulares de MMP-2, uPA e catepsina B no meio de cultura celular foram aumentadas por EMMPRIN-2 transfecção vector de expressão e foram diminuiu EMMPRIN-2 transfecção siRNA em ambas as células Tca8113 (Fig. 3C) e ACCM. Estes achados sugerem que EMMPRIN-2 promove especificamente a secreção extracelular, ao invés da expressão, de uPA, MMP-2 e catepsina B em células de câncer de cabeça e pescoço. Os efeitos de EMMPRIN-2 sobre a secreção extracelular de MMP-2 foram adicionalmente verificados utilizando um ensaio de zimografia de gelatina. Tal como mostrado na Figura 3D, extracelular actividade de MMP-2 aumentou em ambas as células ACCM e Tca8113 que tinham sido transfectadas com o vector de expressão EMMPRIN-2, enquanto a actividade extracelular da MMP-2 diminuiu nas linhas celulares que haviam sido transfectadas com EMMPRIN-2 siRNA (Fig. 3D).

4. Catepsina B é um importante mediador dos efeitos da EMMPRIN-2 sobre a invasão, migração e adesão de células de câncer de cabeça e pescoço

Para determinar o papel funcional da catepsina B in-induzida EMMPRIN-2 invasão, migração e adesão, nós regulada para baixo expressão Catepsina B em células Tca8113 com superexpressão EMMPRIN-2 utilizando Catepsina B siRNA. O tratamento com catepsina B de siRNA resultou em reduções correspondentes em catepsina B de ARNm e os níveis de proteína em ambas as células Tca8113 sobreexpressam parentais e EMMPRIN-2, enquanto EMMPRIN-2 e MMP-2 foi afectada pela catepsina B a transfecção (fig. 4A e B). a secreção extracelular da catepsina B, também foi reduzida por tratamento de siRNA em células Tca8113, ambos na presença e na ausência de sobre-expressão EMMPRIN-2 (Fig. 4C). Como pode ser observado nas experiências descritas acima, as células que sobre-expressam Tca8113 EMMPRIN-2 mostraram aumento da invasão celular, migração e adesão em comparação com as células parentais Tca8113 (Figura 4D). Em contraste, a regulação negativa da catepsina B, utilizando siARN inibiu significativamente a invasão, migração e adesão de células Tca8113 superexpressando EMMPRIN-2 (Fig. 4D), implicando a importância funcional da catepsina B em EMMPRIN-2-mediada de sinalização para a invasão tumoral e . metástase

(a) O tratamento com catepsina B siRNA resultou em reduções correspondentes nos níveis de catepsina B de mRNA em ambos EMMPRIN-2 superexpressão e células Tca8113 parentais (

p Art 0,05), enquanto EMMPRIN -2 e MMP-2 foi afectada pela Catepsina B siARN transfecção (

P

0,05). (B) Os efeitos sobre a Catepsina B, EMMPRIN-2 e de expressão de MMP-2 seguintes catepsina B siARN transfecção em EMMPRIN-2 que sobre-expressam e células Tca8113 parentais foram confirmados usando análises Western blot. (C) A secreção extracelular da catepsina B, também foi reduzida por tratamento de siARN em Tca8113 células, tanto na presença como na ausência de sobre-expressão EMMPRIN-2 (

P

0,05). (D) Tal como observado nas experiências anteriores, as células que sobre-expressam Tca8113 EMMPRIN-2 mostraram aumento da invasão celular, migração e adesão em comparação com células Tca8113 parentais. Em contraste, a regulação negativa da Catepsina B utilizando siRNA inibiu significativamente a invasão, migração e adesão de células Tca8113 superexpressão EMMPRIN-2.

Discussão

Apesar do progresso que tem sido feito no tratamento da cabeça localmente avançado e cancro do pescoço, o prognóstico permanece sombrio, e sobrevida de 5 anos não deve exceder 40% [34]. recorrência local e metástases são responsáveis ​​pela maioria das mortes devido ao câncer de cabeça e pescoço.