Abstract

Fundo

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo, com uma sobrevida global de cinco anos Provocado-Molecule taxa de apenas 15%. inibidor canceroso da PP2A (CIP2A) é um ser humano oncoproteína inibir PP2A em muitos tumores humanos. No entanto, se CIP2A pode ser um novo alvo terapêutico para o câncer de pulmão é em grande parte obscura.

Metodologia /Principais Achados

normal e tecidos pulmonares malignos foram derivadas de pacientes com câncer de pulmão 60 do sul da China. RT-PCR, transferência de Western e imuno-histoquímica foram usadas para avaliar a expressão de CIP2A. Descobrimos que, entre os 60 pacientes, CIP2A foi indetectável ou muito baixo em tecidos normais paratumor, mas foi dramaticamente elevados em amostras de tumor em 38 (63,3%) pacientes. CIP2A superexpressão foi associado com o tabagismo. Silenciando CIP2A por siRNA inibiu a proliferação e atividade clonogênica de células de câncer de pulmão. Curiosamente, verificou-se um composto natural, rabdocoetsin B, que é extraído a partir de um Medicinal coetsa erva Rabdosia chinesa tradicional, poderia induzir a sub-regulação de CIP2A e inactivação de Akt, e inibir a proliferação e induzir apoptose numa variedade de células de cancro do pulmão.

conclusões /Significado

Nossas descobertas indicam fortemente que CIP2A poderia ser um alvo eficaz para o desenvolvimento de drogas câncer de pulmão, e os potenciais terapêuticos de agentes CIP2A-segmentação merecem uma investigação mais aprofundada.

citação: Ma L, Wen ZS, Liu Z, Hu Z, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) superexpressão e pequena molécula-Provocado regulação negativa do CIP2A no câncer pulmonar. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10.1371 /journal.pone.0020159

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de janeiro de 2011; Aceite: 12 de abril de 2011; Publicado em: 31 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa Nacional Key de Pesquisa básica (973, 2010CB529201), o Projeto chave do Conhecimento Programa de Inovação da Academia chinesa de Ciências (KSCX1-YW-R-26 e KSCX2-YW-R-235), o National Natural Science Foundation da China (81071930, 30871110), o major científica nacional e Programa Tecnológico para Drug Discovery (2009ZX09103-101), e da Ciência e Tecnologia Projeto Planejamento de Guangzhou (2009Y-C011-2). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cerca de 1,5 milhões de pessoas foram diagnosticadas com cancro do pulmão e 1,4 milhões de pessoas foram estimados para morrer com ele em 2007 [1]. As duas principais formas de cancro do pulmão são câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). Cerca de 85% dos cancros do pulmão são NSCLC, que pode ser dividido em três principais subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, e carcinoma de células grandes. SCLC representa cerca de 15% dos cancros do pulmão [2]. Fumar provoca todos os tipos de câncer de pulmão, mas é mais fortemente relacionado com SCLC e carcinoma de células escamosas; adenocarcinoma é o tipo mais comum em pacientes que nunca fumaram [2]. O tratamento actual é determinada pelo tipo histológico de cancro do pulmão e fase de diagnóstico, incluindo cirurgia, terapia de platina dupleto, terapia de radiação e terapia-alvo. Infelizmente, o prognóstico de câncer de pulmão é pobre com apenas 15% da taxa de sobrevida global de cinco anos para todas as fases combinadas [1]. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar alvos moleculares mais eficazes e novas terapias direcionadas para o câncer de pulmão.

cancerosas Inibidor de PP2A (CIP2A) é uma oncoproteína humana que estabiliza c-Myc inibindo a proteína fosfatase 2A (PP2A ) desfosforilação mediada de MYC na serina 62 [3]. Para além de inibir a degradação de c-Myc, CIP2A parece ser regulada num loop de feedback positivo com c-Myc, promovendo a expressão do outro [4]. CIP2A é sobre-expresso na garganta humana e carcinomas de cabeça, cólon, mama e câncer gástrico, e é inversamente correlacionada com a evolução da doença no câncer gástrico [3] – [7]. No entanto, se CIP2A poderia ser um novo fármaco alvo para cancros não é totalmente investigados e a actividade anti-tumor de agentes CIP2A-alvo permanece em grande parte desconhecida. Nós estudamos a expressão de CIP2A no cancro do pulmão e rastreadas para compostos de chumbo que possa visar CIP2A [8]. Aqui nós mostramos que CIP2A é acentuadamente regulada em tumores de câncer de pulmão em comparação com tecidos pulmonares normais adjacentes pareados por paciente, e relatam que um composto natural que desencadeia downregulation de CIP2A apresenta atividade antitumoral significativa em linhas celulares de NSCLC.

Resultados

CIP2A é sobre-expresso no cancro do pulmão e está associado com o consumo de cigarros

Testamos a expressão de CIP2A ao nível da proteína em células não malignas e malignas, e descobriram que CIP2A foi altamente expressa no cancro do pulmão linhas de células (A549, H1975, 95D e L78) comparado com fibroblastos normais humanos embrionários do pulmão (HLF) e MRC5 e células normais humanas epiteliais brônquicas (HBEpiC) (Figura 1A). Em seguida, analisamos CIP2A em amostras de câncer de 60 pulmonares de pacientes veio do sul da China, cujas características de base foram listadas na Tabela 1. Nós mostramos que CIP2A foi sobre-expresso em 38 amostras (63,3%) de tumor ensaiadas por western blot (Figura 1B). Contudo, nos 60 tecidos pulmonares normais adjacentes pareados por paciente, CIP2A não foi detectada em 57 (95%) das amostras, e foi fracamente expresso em 3 (5%) amostras onde a sua expressão foi muito mais baixa do que em amostras de tumor dos mesmos pacientes . Em amostras de 2 doentes com pseudotumor inflamatório, CIP2A não foi detectado em ambos o pseudotumor e tecidos pulmonares adjacentes (Figura 1C). ensaio imuno-histoquímica confirmou que CIP2A foi dramaticamente elevado com uma pontuação imunorreatividade maior em amostras de tumores em 26 dos 39 pacientes (66,7%) testados (Figura 1D). A nível mRNA,

CIP2A

também foi sobre-expresso em tecidos de tumor de pulmão em comparação com tecidos normais do pulmão em 39 de 58 (67,2%) pacientes testados (Figura 1E). Tomados em conjunto, CIP2A é drasticamente elevada em amostras de tumor de cancro do pulmão, em comparação com tecidos pulmonares normais emparelhadas

(A):. A ​​análise de transferência de Western de CIP2A em células de cancro de pulmão humano (A549, H1975, 95D e L78), embrionária células de fibroblasto de pulmão (HLF e MRC-5), e as células normais epiteliais brônquicas humanas (HBEpiC). (B): análise Western blot de proteínas CIP2A em tumores primários de pulmão (T) e tecidos pulmonares normais adjacentes (N). β-actina é usado como um controlo de carga. Os resultados representativos são mostrados números e são referidos pacientes individuais. (C): análise Western blot de proteínas CIP2A em pseudotumor inflamatório (P) e tecidos pulmonares normais adjacentes (N). β-actina é usado como um controlo de carga. (D): Imagens representativas (painel esquerdo) e pontuação (painel direito) de coloração imuno-histoquímica para a expressão CIP2A em tumores de pulmão primário (T) e tecidos pulmonares normais adjacentes (N). (E): análises de RT-PCR de

CIP2A

ARNm em tumores primários do pulmão (T) e tecidos pulmonares normais adjacentes (N).

GAPDH

é empregado como um controlo de carga. Os resultados representativos são mostrados e os números são referidos pacientes individuais.

superexpressão CIP2A está associado com o tabagismo

Foi analisada a correlação entre CIP2A superexpressão e algumas variáveis ​​clínico-patológicas. Os dados demonstraram que CIP2A superexpressão no cancro do pulmão foi significativamente correlacionada com o tipo histológico de carcinoma de células escamosas (p = 0,003) e sexo masculino (p = 0,008) (Tabela 1) que foram mostrados para conectar-se fortemente com o tabagismo [2], [ ,,,0],9]. Além disso, os nossos dados mostram claramente que a elevada expressão de CIP2A foi associado com pacientes fumador (p = 0,004). Não houve diferença significativa no estado CIP2A foi observada de acordo com a fase patológica (p = 0,639) e à idade (0,082) (Tabela 1). Em uma tentativa de esclarecer os fatores mais significativos relacionados com CIP2A superexpressão, as análises multivariadas foram realizadas, ea análise de regressão logística multivariada (Tabela 2) demonstraram que o cigarro foi a única variável significativa associada CIP2A superexpressão no cancro do pulmão (p = 0,008 ).

o nitrosamina 4- (methylnitro-samino) -1- (3-piridil) -1-butanona, ou a nitrosamina cetona derivada de nicotina (NNK), é um ingrediente-chave do fumo do tabaco substância cancerígena que sistemicamente induz tumores do pulmão em ratos, camundongos e hamsters e também desempenha um papel importante na carcinogênese de pulmão [10], [11]. Em seguida, investigou se NNK poderia induzir diretamente a regulação positiva de CIP2A ou não. Para fazer isso, HBEpiC (Figura 2A) e BEAS-2B (Figura 2B) células epiteliais brônquicas foram expostas a NNK na concentração indicada para os pontos de tempo indicados, lisadas, e por Western blot foi realizada para analisar a expressão de CIP2A. Os resultados mostraram que o tratamento com NNK a 0,1 até 10 | iM para até 18 dias não podia perturbar CIP2A expressão (Figura 2, A e B). Neste estudo, nós não testar o efeito a longo prazo de NNK na expressão CIP2A

in vitro

ou

in vivo

(A):. Células HBEpiC foram tratados com NNK a várias concentrações para os pontos de tempo indicados, e por western blot foi realizada para analisar a expressão CIP2A. (B): células BEAS-2B foram tratados com NNK nas concentrações indicadas nos pontos de tempo indicados, e por Western blot foi realizada para analisar a expressão CIP2A. 0,05% e DMSO a 0,1% foram utilizados como um controlo de solvente correspondente a 5 e 10 μΜ μΜ NNK, respectivamente.

CIP2A é necessária para o crescimento de células de cancro do pulmão e transformação

siRNA específico CIP2A foi utilizado para avaliar os seus papéis na patogénese do cancro do pulmão, e os resultados mostraram que, em comparação com o controlo negativo (CN), CIP2A silenciamento (Figura 3A) conduziu à inibição da actividade clonogénico de células A549, detectada pela formação de focos ( A Figura 3, B e C) e a formação de colónias em agar mole (Figura 3, D e e) ensaios de [3]. Esses fenômenos foram confirmados por resultados de CIP2A silenciamento em L78 células (Figura S1, A a E). Em seguida, as células A549 foram transfectadas com NC ou ARNsi específico CIP2A-(Figura 3F), e injectado subcutaneamente em flancos direito e de 8 ratinhos nus esquerda, respectivamente, e os volumes dos tumores foram estimados a cada dois dias [12]. Curiosamente, o crescimento do tumor-specific siRNA CIP2A significativamente inibido, em comparação com NC-siARN (Figura 3, através de L eu). Em conjunto, estes dados indicam que CIP2A é essencial para a proliferação e a tumorigénese cancro do pulmão, e pode ser um alvo terapêutico eficaz

(A):. A ​​análise por Western blot da expressão da proteína em células A549 CIP2A 72 h após a transfecção com negativo controle (NC) ou siRNA específico do CIP2A. (B e C): placa plana ensaio de formação de clones para a actividade de células clonogénicas A549 72 h após a transfecção com NC ou ARNsi específicos de CIP2A. (B): luz representante imagens miscroscopy. (C): A quantificação da contagem de focos. É mostrada a média + DP de quatro expericias independentes. (D e E): Ensaio de formação de colónias em ágar macio, para as células A549 transf ectadas com NC ou ARNsi específicos de CIP2A. (D): luz representante imagens miscroscopy. (E): A quantificação da contagem de focos. (F): análise Western blot de proteínas CIP2A em células A549 transf ectadas com NC ou siRNA CIP2A-específica durante 72 h. (G): ratinhos nus injectados subcutaneamente com células A549 transf ectadas com NC ou ARNsi específicos de CIP2A. (H): A curva de crescimento do tumor para a experiência mostrada em (G). É mostrada DP média + dos volumes médios de tumor. (I) de imagens de tumores de xenoenxerto obtidos a partir de ratinhos mostrados em (G). * P 0,01, teste t de Student

Rabdocoetsin B é um composto natural de metas CIP2A

Nosso objetivo central foi identificar novos alvos de medicamentos e fornecer compostos de chumbo para o desenvolvimento de drogas.. Nós selecionados para CIP2A de metas de pequenas moléculas através da análise de seus efeitos na expressão CIP2A, e identificou um composto natural extraído de um medicamento coetsa Rabdosia de ervas chinesas, rabdocoetsin B [13], [14] (Figura 4A), pode regular negativamente CIP2A a nível de proteína de 5 a 20 uM em células A549 (Figura 4B). Em células H1975, Rabdocoetsin B, também desencadeada regulação negativa de CIP2A de 5 a 10 pM (Figura 4C). Analisou-se o mecanismo de regulação negativa CIP2A causada por Rabdocoetsin B, e descobriram que rabdocoetsin B inibiu significativamente a transcrição de CIP2A de um modo dependente da dose (Figura 4D) avaliada por em tempo real de RT-PCR.

(a): Estrutura de rabdocoetsin B. (B): As células A549 foram tratadas com rabdocoetsin B RDB () a várias concentrações durante 48 h. As transferências de Western foram usadas para detectar a expressão de proteína CIP2A (painel superior) e a expressão da proteína CIP2A foram quantificadas e normalizadas contra a expressão β-actina (painel inferior) (C): H1975 células foram tratadas com rabdocoetsin B a várias concentrações durante 24 h. As transferências de Western foram usadas para detectar a expressão de proteína CIP2A (painel superior) e a expressão da proteína CIP2A foram quantificadas e normalizadas contra a expressão β-actina (painel inferior) (D): As células A549 foram tratadas com rabdocoetsin B a várias concentrações durante 48 h, ea expressão de mRNA de

CIP2A

foi analisada utilizando em tempo real RT-PCR.

Rabdocoetsin B inibe CIP2A modulada fosforilada Akt

Nas células de carcinoma hepatocelular, CIP2A regula-se-fosfo-Akt (pAkt) e diminui a actividade de PP2A relacionada-Akt, ao passo que o silenciamento CIP2A re-activa PP2A [15]. Desde Akt é constitutivamente activa em células de câncer de pulmão e promove a sobrevivência celular e resistência à quimioterapia e radiação [16], [17], que analisou o efeito da CIP2A em pAkt no câncer de pulmão. Nós mostramos que CIP2A silenciamento por siRNA específico resultou na diminuição da regulação de pAkt mas não Perk, PCNA, β-catenina, EGFR ou Src (Figura 5A). Em seguida, investigou se rabdocoetsin B pode modular a expressão de pAkt, e descobriram que o tratamento com rabdocoetsin B em 5 a 10 ^ M também pAkt regulada para baixo em A549 (Figura 5B) e as células H1975 (Figura 5C). Nós adicional mostrou que em células H1975 em cima rabdocoetsin B a 10 uM, CIP2A foi marcadamente reprimidos em 6 a 12 horas e tornou-se indetectável em 48 h (Figura 5D), enquanto pAKT foi diminuída em 18 h (Figura 5D). Estes resultados foram confirmados em células A549 tratadas com rabdocoetsin B (Figura 5E), indicando que este composto pode inibir a via de CIP2A-Akt no cancro do pulmão

(A):. As células A549 foram transfectadas com NC ou CIP2A- siRNA específico durante 72 h, e a expressão de proteínas indicadas foram detectados utilizando Western blots. (B e C): células H1975 (C) A549 (B) e foram tratados com rabdocoetsin B RDB () nas concentrações indicadas, durante 48 e 24 h, respectivamente, e manchas de Western foram realizadas para analisar a expressão de proteínas indicadas. (D e E): H1975 (D) e as células A549 (E) foram tratados com rabdocoetsin B RDB () para os pontos de tempo indicados, e a análise por Western blot foi realizada com anticorpos específicos para as proteínas indicadas. β-actina é usado como um controle de carga.

Efeitos de Rabdocoetsin B em células de câncer de pulmão

Foram avaliados os efeitos da rabdocoetsin B em células de câncer de pulmão que expressam todo o tipo (WT ) ou com o EGFR mutante. Mostrámos que rabdocoetsin B exibiu efeitos citotóxicos significativos no A549, NCI-H1975, HCC827, SPC-A-1, GLC-82, L78 e linhas celulares de cancro do pulmão 95D (Figura 6, A e B). Rabdocoetsin B induzida apoptose de células A549 (Figura 6c) com activação de casp-8 e casp-9 e a clivagem de PARP (Figura 6D). Rabdocoetsin B também causou ativação da CASP-8 e CASP-9 e clivagem de PARP em NCI-H1975 células (Figura 6E). Estes resultados indicam que rabdocoetsin B inibe a proliferação e induz a apoptose de células de cancro do pulmão através de activar as vias de apoptose endógenos e exógenos

(A):. Cancro do pulmão células foram tratadas com concentrações de Rabdocoetsin B RDB () aumento (de 1 uM a 10 uM) e a viabilidade celular foi medida 48 h por ensaio MTT. (B): a CI50 de células tratadas com rabdocoetsin B. (C): Rabdocoetsin B induz a apoptose de células A549, ensaiada por citometria de fluxo. (D e E): Western blot foram realizados para detectar a expressão de reguladores de apoptose em A549 (D) e H1975 células (E)

Discussão

CIP2A é uma auto-. antigénio [7] que é sobre-expressa em tumores humanos [3] – [7], [18] – [21]. Peng [22] mostrou que, em pacientes norte-americanos com base em, CIP2A é aumentado em 61 dos 72 (84,7%) amostras de tecido de câncer de pulmão, o que é significativamente maior do que em tecidos pulmonares normais (14,3%, 9/63). Recentemente, Dong et al [23] informou que em 29 pacientes do norte da China,

CIP2A

é sobre-expresso a nível mRNA em 24 casos (82,7%) em amostras de tumor em comparação com os tecidos normais correspondentes; proteína CIP2A (detectado por imuno-histoquímica) é encontrado para ser sobre-expresso em 72,2% das amostras de câncer de pulmão 90 e correlacionados com a sobrevivência pobre. Testamos expressão CIP2A em 60 pacientes de Southern [8] China, e relatam que CIP2A é drasticamente aumentada em 63,3% (detectada por transferência Western) ou 67,2% (ao nível do ARNm) de espécimes de tumores em comparação com tecidos normais adjacentes (Figura 1) .

Nós mostramos pela primeira vez que CIP2A superexpressão está associado com o tabagismo. No 60 de pulmão pacientes com câncer examinadas neste estudo, 28 de 36 pacientes tabagistas (77,8%) apresentam aumento da expressão de CIP2A nas amostras de tumor em comparação com seus espécimes normais adjacentes, ao passo que 10 dos 24 (41,7%) casos não-fuma exibem-regulada CIP2A ao nível da proteína (P = 0,004) (Tabela 1). Atualmente o tabagismo continua a ser mais prevalente entre os homens (63%) do que mulheres (3,8%) [24]. Relatamos aqui que CIP2A é sobre-expresso em 30/40 (75%) e 8/20 (40%) em homens e mulheres doentes (p = 0,008) (Tabela 1), respectivamente. Nós também achamos que CIP2A é elevada em 17/19 (89,5%) pacientes com carcinoma de células escamosas, enquanto que 17/35 (48,6%) pacientes com adenocarcinoma tem sobre-expressos CIP2A (p = 0,003) (Tabela 1). A análise de regressão logística multivariada demonstra claramente que o tabagismo é a única variável significativa associada a CIP2A superexpressão no cancro do pulmão em nosso meio (p = 0,008) (Tabela 2). Enquanto a taxa global de fumar nos sectores do Norte e Nordeste é maior do que no Sul e no Leste da China, a prevalência de exposição à fumaça ambiental do tabaco entre os não fumantes no norte da China é significativamente maior do que em não-fumantes no sul da China [24], [ ,,,0],25]. Estes podem contribuir para a diferença na expressão CIP2A entre os pacientes em nosso meio e o relatório do Dong [23]. O fumo do tabaco que faz com que cerca de 5-6 milhões de mortes por ano e 31% e 6% de todas as mortes por câncer de pulmão em homens e mulheres de meia-idade, respectivamente [26], podem induzir alterações genéticas e epigenéticas e reduzir a capacidade de reparação do ADN [2]. Zhao et al [27] recentemente mostrou que, em linhas de células gástricas humanas,

infecção por Helicobacter pylori

pode induzir a expressão CIP2A via oncoproteína bacteriana ativação causou-CagA do Src e MEK vias de sinalização /ERK. Embora NNK (0,1 a 50 uM) não consegue regular positivamente CIP2A em células HBEpiC e BEAS-2B em até 18 dias depois do nosso estudo (Figura 2), não se pode excluir a possibilidade de que NNK pode perturbar a expressão da oncoproteína de uma mais exposição curso de tempo, e esta hipótese garante mais investigação.

CIP2A é crítica para o crescimento de células de cancro de pulmão, uma vez que CIP2A knockdown por siRNA resultados específicos na inibição significativa da proliferação e transformação de células in vitro e in vivo (Figura 3 e Figura S1). Estes dados indicam que CIP2A poderia ser um alvo atractivo para drogas anti-cancerosas novos pulmonares. Curiosamente, identificamos um composto singular rabdocoetsin B, pode regular negativamente a proteína CIP2A em células de cancro de pulmão (Figura 4, A a C) através da inibição da sua expressão ao nível do ARNm (Figura 4D). Estudos mostram que CIP2A pode-se regular de pAkt [15], e os nossos resultados confirmam que CIP2A silenciamento pode diminuir de pAkt (Figura 5A). Mostramos ainda que rabdocoetsin B, também inibe pAkt (Figura 5, B a E). Rabdocoetsin B inibe o crescimento e induz a apoptose de uma variedade de células de cancro do pulmão (Figura 6, A a E). Nossos dados, assim, proporcionar um composto de chumbo para CIP2A de metas terapêuticas anti-tumorais.

Materiais e Métodos

As amostras dos pacientes

Use das amostras foi aprovado pelo Institutional Review Board do Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências e do Hospital do Câncer, Sun Yat-Sen University. Todos os tumores e amostras de tecidos normais adjacentes foram obtidas com consentimento informado por escrito de pacientes no Hospital do Câncer, Sun Yat-Sen University. Para a análise de RT-PCR, as amostras de tecido foram moídos em almofariz arrefecido em azoto líquido, o ARN foi extraído utilizando o Trizol (Invitrogen), e experiências de RT-PCR foram realizadas utilizando PrimeScript® Um passo de RT-PCR Kit Ver.2 (Takara) de acordo com o protocolo do fabricante. As sequências dos iniciadores utilizados para

CIP2A Quais são os seguintes: para a frente 5′-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 ‘, _ reversa 5′- GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3’ [5]

Para o ensaio de Western blot, o tecido. espécimes foram moídos em almofariz arrefecido em azoto líquido, pó tecido foi suspenso em tampão de lise (Tris-HCl a 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 1 mM de na

3VO

4, NaF 1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, cocktail inibidor de protease completo) e clarificados por centrifugação. Quantidades iguais de amostras foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose e imunotrans feridos com anticorpos anti-CIP2A ou anti-actina β anticorpo.

ensaio de imuno-histoquímica e de pontuação de imunorreactividade foram realizadas como descrito [28]. fixados em formalina e tecido de cancro do pulmão espécimes embebidos em parafina (5 uM) foram desparafinados e submetidos a um passo de recuperação de epítopo induzida pelo calor durante 2 min. O H

2O

2 (3%) foi utilizado para bloquear a actividade da peroxidase endógena por 10 min. As secções foram então lavadas com PBS. O anticorpo anti-soro policlonal de coelho CIP2A foi aplicada às lâminas a uma diluição de 1:500 a 4 ° C durante a noite. A detecção foi realizada com o kit de imuno-histoquímica (PV-6001) (Zhongshan Golden Bridge Biotecnologia Co., Ltd., Pequim, China) de acordo com o protocolo do fabricante. As secções foram coradas com 3, 3′-diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com hematoxilina, desidratadas, tratou-se com xileno, e montadas. Os níveis de proteína CIP2A foram marcados como descrito [29].

Agentes

Rabdocoetsin B foi extraído de Rabdosia coetsa pelo professor Han-Dong Sun. A 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di- phenytetrazoliumromide (MTT) foi comprado de Amresco, Inc. (Solon, OH). kit de Anexina V-PE 7AAD Detecção de apoptose foi obtido a partir de BD Biosciences (San José, CA, EUA)

Anticorpos

Os anticorpos utilizados neste estudo foram os seguintes:. anti-β-Actina (Sigma); anti-casp-9 (C9), anti-casp-8 (1C12); anti-PARP, anti-fosfo-p44 /42 MAPK, anti-EGFR, anti-Src e anti-β-catenina (sinalização celular), anti-CIP2A (2G10-3B5), anti-pAKT e ATK (Santa Cruz Biotechnology) ; anti-ERK2 (Abcam); anti-PCNA (Abmart); anti-coelho ou de anticorpo secundário conjugado com HRP anti-ratinho (Pierce); Policlonal de coelho anti-CIP2A (Novus Biologicals, Inc). A detecção foi realizada utilizando um kit de detecção quimioluminescente Ocidental (Cell Signaling).

cultura celular

As linhas de cancro do pulmão NCI-H1975 e células HEK-293 de rim embrionário humano e A549 foram obtidas a partir da americana Cultura de Tecidos Coleção (ATCC) e humano fibroblastos embrionárias de pulmão de células MRC-5 foram adquiridos a partir do celular Resource Center, da Academia chinesa de Ciências Médicas (Beijing). As células normais humanas epiteliais brônquicas (HBEpiC, número de catálogo: 3210) foram adquiridos a ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Califórnia). pulmão humano linhas celulares de carcinoma epidermóide L78 e altamente metastáticas linhas celulares de cancro de pulmão de células grandes 95D foram obtidos a partir do banco de células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai), e as células embrionárias humanas HLF fibroblastos de pulmão foram adquiridos a Kenqiang Instrument Co., Ltd. ( Xangai, China). células epiteliais brônquicas BEAS-2B foram fornecidas pelo professor Hongbin Ji do Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências. A549, HLF e BEAS-2B células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina. células HBEpiC foram cultivadas em um brônquica células epiteliais sem soro Médio (BECM, Cat. No. 3211, ScienCell Research Laboratories) contendo ácidos essenciais e não essenciais aminoácidos, vitaminas, hormônios, fatores de crescimento e minerais. L78, 95D e NCI-H1975 células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina. Células MRC-5 foram cultivadas em meio MEM /EBSS suplementado com ácidos não essenciais amino, soro bovino fetal a 10%. (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina

Avaliação da proliferação celular e apoptose

As células foram tratadas com Rabdocoetsin B para pontos de concentração e hora indicadas. A proliferação celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. A viabilidade celular foi estimada por exclusão do corante azul tripano. Externalização de fosfatidilserina foi testada usando um PE anexina V-7 kit AAD Detecção de apoptose (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Quantitative PCR em tempo real

quantitativa real time PCR foi realizada em CFX

TM96 tempo real Sistema (Bio-Rad), utilizando SYBR® Premix Ex Taq ™ (Perfeito tempo real) (Código TaKaRa: DRR041) de acordo com as instruções do fabricante. Primers para CIP2A e actina foram como se segue: CIP2A: sequência para a frente, 5′-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 ‘, reverso sequência, 5′-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3′; Actina: sequência para a frente, 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ‘, sequência inversa, 5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3’. Os níveis de ARNm CIP2A foram expressos como a razão contra actina com base nos valores do CT.

ensaios de siRNA

Usando HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante, as células foram transfectadas com 100 nM de oligonucleótidos de cadeia dupla siRNA [3]. As sequências de siRNA foram 5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 ‘(CIP2A siRNA1), 5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′ (CIP2A siRNA2) [3], e 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(controlo negativo (CN) siRNA).

clonogênica ensaio

Para a formação de focos, A549 ou L78 células transfectadas com siRNA controle negativo ou específicas-CIP2A foram semeadas em triplicado em placas de 35 mm (300 células por placa). Após 14 dias de cultura, as células foram coradas com Giemsa e os clones contendo mais de 50 células foram contadas. Para o ensaio de formação de colónias de soft-agar, as células foram suspensas em 1 ml de DMEM (para as células A549) ou meio RPMI 1640 (para L78 células) contendo agarose 0,3% de baixo ponto de fusão (Amresco, Solon, OH) e 10% de FBS e plaqueadas sobre uma camada inferior contendo 0,6% de agarose em 35 milímetros plat (1.000 células /placa) em triplicado. Depois de 2-3 semanas de cultura, as placas foram coradas com Giemsa e as colónias foram contadas utilizando um microscópio de luz.

modelos murinos

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da do Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências, com a identificação do AEC2010070202 aprovação. Todos os ratos utilizados neste estudo foram criados e mantidos num ambiente específico isento de patógeno. Os ratinhos nus (n = 8) foram injectados subcutaneamente com células A549 (4 × 10

6) transfectadas com NC ou ARNsi específicos de CIP2A em flancos direito e esquerdo respectivamente, e do tumor foi calculada como descrito [12].

a análise estatística

As diferenças entre grupos de dados foram avaliadas para significância usando Student

t

-teste de dados desemparelhados, χ

2 de teste ou one-way análise de variância e Bonferroni pós -teste. O volume do tumor foi analisada com ANOVA one-way e amostra independente

t

teste utilizando o software SPSS 12.0 para Windows (Chicago, IL). A associação entre a expressão elevada CIP2A e recurso clínico-patológico foi avaliada usando χ

2 de teste ou o teste exato de Fisher, e uma análise multivariada backward de regressão logística foi realizada para investigar as variáveis ​​mais significativas relacionadas com CIP2A sobre-expressão após o ajuste . valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes e os dados foram apresentados como a média ± SD salvo indicação em contrário.

Informações de Apoio

Figura S1.

Os efeitos do esgotamento CIP2A no crescimento e trasnsformation as células L78 ‘. (A): a análise por Western blot da expressão da proteína CIP2A em L78 células 72 h após a transfecção com NC ou ARNsi específicos de CIP2A. (B e C): placa plana ensaio de formação de clone para a atividade clonogênica de L78 células 72 h após transfecção com NC ou siRNA específico do CIP2A. (B): As imagens de microscopia de luz representativas. (C): A quantificação da contagem de focos. É mostrada a média + DP de três experiências independentes. (D e E): Ensaio de formação de colónias em ágar macio-L78 de células transfectadas com NC ou ARNsi específicos de CIP2A. (D): As imagens de microscopia de luz representativas. (E): A quantificação da contagem de focos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020159.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Professores Zhu Chen, Sai- Juan Chen Zhen e-Yi Wang em Shanghai Instituto de Hematologia por seu apoio a longo prazo. Os autores agradecem Professor Jukka Westermarck na Universidade de Turku, na Finlândia para fornecer a construção pcDNA3.1-CIP2A e Professor Hongbin Ji do Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências para fornecer as células BEAS-2B.