Sumário

A exposição de células a radiação ionizante (IR) induz, não só, a activação de múltiplas vias de sinalização que desempenham papéis críticos na determinação do destino celular, mas também alterações das vias moleculares envolvidos na morte celular ou sobrevivência . Recentemente, a metilação do DNA foi estabelecida como um processo epigenético críticos envolvidos na regulação da expressão do gene em células cancerosas, sugerindo que a inibição de metilação de ADN pode ser uma estratégia eficaz o tratamento do cancro. Por causa alterações da expressão de genes por metilação do DNA têm sido considerados para influenciar radioresponsiveness, nós investigamos o efeito de um inibidor da metiltransferase de ADN, 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), em radiossensibilidade. Além disso, investigamos os mecanismos celulares subjacentes de tratamentos combinados de irradiação ionizante (IR) e 5-aza-dC em células cancerígenas do cólon humano. linhas celulares de cancro do cólon foram inicialmente testados para a sensibilidade à radiação por IR

in vitro

e foram tratados com duas doses diferentes de 5-aza-DC. A sobrevivência destas linhas celulares foi medida usando MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) e ensaios clonogénicos. Foram examinados os efeitos de 5-aza-dC, juntamente com a irradiação sobre o crescimento celular, a distribuição do ciclo celular, apoptose, e a expressão de genes relacionados com apoptose. Combinação tratamento por irradiação com 5-aza-dC diminuiu significativamente a actividade de crescimento em comparação com o tratamento com irradiação isoladamente ou com 5-aza-dC tratamento sozinho. A percentagem de células HCT116 na fase sub-G1 e a sua taxa de apoptose foi aumentada quando as células foram tratadas com irradiação em combinação com 5-aza-dC em comparação com o tratamento quer por si só. Estas observações foram fortemente apoiada pelo aumento da actividade da caspase, aumentou caudas de cometa utilizando ensaios de cometa e o aumento dos níveis de proteína de moléculas associadas a apoptose (caspase 3/9, clivado PARP). Os nossos dados demonstraram que a 5-aza-dC radiossensibilidade de células cancerígenas do cólon melhorada, e os efeitos da combinação de 5-aza-dC com radiação mostrou maiores efeitos celulares do que a de um único tratamento, sugerindo que a combinação de 5-aza-dC e radiação tem o potencial para se tornar uma estratégia clínica para o tratamento de câncer

Citation:. Kim JG, Bae JH, Kim JA, Heo K, Yang K, Yi JM (2014) Combinação Efeito da regulação epigenética e radiação Ionizante em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10.1371 /journal.pone.0105405

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 25 de maio de 2014; Aceito: 21 de julho de 2014; Publicação: 19 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por um R D Programa (50596-2014), através do Instituto Dongnam da Radiological Ciências Médicas financiados pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia. Este trabalho também foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) e Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (MSIP), o governo coreano, através do seu Programa de Tecnologia Nuclear Nacional (2013M2A2A7043665). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a epigenética é o estudo das alterações hereditárias na expressão gênica ou fenótipo celular causadas por outros do que mudanças nas sequências de ADN subjacentes mecanismos [1]. A regulação epigenética da expressão do gene é mediada por mecanismos tais como a metilação do DNA, modificações de histonas, e o posicionamento do nucleossoma ao longo do DNA. Tipicamente, a hipermetilação do ADN desempenha um papel crítico na inactivação dos genes envolvidos na regulação do ciclo celular, a reparação do ADN, a apoptose, a sinalização celular, da transcrição, e outros processos celulares [2].

Aberrações na metilação do ADN são frequentemente observadas em muitos tipos de cancro diferentes [3], [4]. Em particular, o silenciamento de genes supressores de tumores ou outros genes relacionados com o cancro por hipermetilação aberrante de DNA nas regiões reguladoras do promotor ou contribui para a tumorigénese [5], [6]. Ao contrário de alterações genéticas, eventos epigenética, incluindo a metilação do DNA, são reversíveis, tornando regulação epigenética extremamente interessantes do ponto de vista de desenvolvimento de novas abordagens para terapia. a hipermetilação do ADN pode ser revertida por agentes de desmetilação de ADN. Em adição, DNA metiltransferase (DNMT) inibidores podem restaurar a expressão de genes silenciados por metilação do DNA. Nos últimos anos, o inibidor DNMT, 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), foi demonstrado que possuem actividades anti-cancro em pacientes com leucemia, síndrome mielodisplásico, e vários tumores sólidos [7], [8] . Embora uma única terapia epigenética não demonstrou reacções significativas contra a maioria dos tumores sólidos, [9], estudos pré-clínicos sugerem que uma combinação de modificadores de epigenética, tais como inibidores DNMT ou inibidores de histona-desacetilase, pode ser eficaz. Além disso, a combinação destes modificadores epigenética com agentes quimioterapêuticos convencionais podem também ser eficazes. Por conseguinte, estes tipos de terapias combinatórias está a ser examinado em ensaios clínicos [10], [11]. No entanto, alguns relatórios têm investigado radiossensibilidade associado com a exposição ao 5-aza-dC [12] – [15]. Recentemente, tem havido um interesse crescente nas estratégias de uso de substâncias que regulam a radiossensibilidade celular para aumentar a radiossensibilidade do tumor. Portanto, no presente estudo, relatamos o potencial terapêutico da combinação de 5-aza-dC com radiação (IR) para aumentar a radiossensibilidade ionizante em células de carcinoma colorectal e examinar os mecanismos celulares subjacentes a esses efeitos.

Materiais e Métodos

cultura celular e 5-aza-dC tratamento

as linhas celulares de carcinoma colo-rectais humanos: HCT116, SW480, Colo320, e RKO, as quais foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, VA, EUA), bem como um células duplo knockout (NSO) para DNA metiltransferase-1 e DNA metiltransferase-3b na linha celular HCT116 [16], que retém 5% de metilação de ADN genómico, foram cultivadas a 37 ° C com 20 % S

2 e 5% de CO

2. Os HCT116, NSO, células SW480 e foram mantidas em meio de McCoy 5A (WelGENE, Daegu, Coreia). células Colo320 foram mantidas em meio RPMI (WelGENE). As células RKO foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (WelGENE) contendo 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA) e 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EUA). As células foram tratadas com 5-aza-dC (0,5 ou 1 uM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Uma vez por dia durante 3 dias (Figura S1)

irradiação ionizante (IR) exposição

As células tratadas com 5-aza-dC durante 3 dias ou células de controlo não-tratadas foram expostas a raios gama de uma fonte de

137Cs-ray (Eckert Ziegler, Berlim, Alemanha) numa dose taxa de 2,6 Gy /min. A seguir à irradiação, em doses de 2, 5, e 10 Gy, as células foram incubadas durante 3 dias a 37 ° C, 20% de O

2, e 5% de CO

2.

ensaio clonogénico

HCT116, células SW480, RKO, Colo320, e NSO foram semeadas em placas de 6 poços (5000 células /poço) e tratou-se com 5-aza-dC e IR. As células foram cultivadas durante 2 semanas. O meio de cultura foi substituído com meio fresco a cada 2 dias. As colónias foram fixadas e coradas com 1,25% de violeta cristal, lavadas extensivamente para remover o excesso de corante, e visualizados utilizando um scanner MultiXpress C9250ND (SAMSUMG, Seul, Coreia do Sul). As colónias com 50 células /colónias foram contadas utilizando o programa Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA)

ensaios

proliferação celular e a viabilidade celular

A proliferação celular foi. determinada utilizando o -2,5-ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) (MTT). As células (2 x 10

5 células /poço) foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas a 37 ° C. Após 48 h, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e 5 mg /ml de MTT em PBS foi adicionado a cada poço durante 4 h. Depois de remover a solução de MTT, uma solução de solubilização (sulfóxido de dimetilo /etanol, 01:01) foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazano. A absorvância a 570 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas Paradigma (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA). As células HCT-116 tratadas com 5-aza-dC e /ou irradiação foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

4 células /poço em placas de 6 poços. Depois de 24, 48, 72 e 96 h, as células foram colhidas, diluiu-se com uma solução de trabalho azul de tripano e contadas para gerar uma curva de crescimento.

O crescimento do tumor análise

Para

avaliação in vivo

do crescimento do tumor, foi utilizado um modelo de ratinho de xenoenxerto subcutâneo portador de tumor SCID gerada por infectar células. C.B-17 SCID fêmeas foram adquiridos a partir do Laboratório Central. Animais (Seul, Coréia). Seis ratinhos fêmea semanas de idade foram divididos em grupos experimentais (n = 3, em cada grupo). Os ratinhos foram injectados por via subcutânea nos lados direito da área dorsal com 5 × 10

6 células diluído em 100 ul de PBS. Os volumes dos tumores foram medidos uma vez por semana. O volume do tumor foi estimada utilizando a seguinte equação: (eixo curto)

2 × (eixo longo) × 0,5

análise de citometria de fluxo

análise do ciclo celular foi realizada utilizando iodeto de propídio (PI. ). As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e fixadas em 75% de etanol a 4 ° C durante 1 h. Antes da análise, as células foram lavadas novamente com PBS, suspensos em uma solução fria PI com 1 mg /ml de RNase, e incubadas no escuro durante 30 min à temperatura ambiente. Análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando um instrumento FACScan (BD FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A apoptose de células tratadas foi avaliada utilizando uma anexina V /FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Resumidamente, todas as células foram semeadas e tratadas em pratos de 100 mm. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio. As células foram coradas com ficoeritrina (PE) de anexina V e 7-amino-actinomicina e incubou-se durante 15 min no escuro. Após a coloração, o tampão de ligação foi adicionada às células, que foram analisadas usando o instrumento FACScan. software FACSDiva (BD Biosciences) foi utilizado para a análise de dados.

Caspase 3/7 atividade ensaio

Para o ensaio da atividade caspase 3/7, as células (5 × 10

3 células ) foram semeadas com 100 uL de meio de McCoy 5A para uma placa de 96 poços. Após 24 h de incubação, 100 uL de a 3/7 kit de ensaio de caspase-Glu (Promega, Madison, WI, EUA) e tampão de substrato de mistura foram adicionados a cada poço. As células e as soluções foram misturadas suavemente durante 30 minutos e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. actividade de fluorescência foi medida utilizando um luminómetro (ATTO, Tóquio, Japão). Todos os ensaios foram repetidos três vezes e continha controlos negativos.

danos no ADN ensaio

danos no DNA foi determinada utilizando o Kit de Ensaio OxiSelect cometa (Biolabs celular, San Diego, CA, EUA). 5-aza-CC e /ou células HCT116-tratados IV (1 × 10

5) foram misturados com agarose de ponto de fusão de baixo ponto (razão 1:10) e, em seguida, a corrediça cometa foi cheio com 75 uL de a mistura. As lâminas foram incubadas a 4 ° C durante 30 min e, em seguida, imersas em tampão de lise a 4 ° C no escuro durante 1 h. O tampão de lise foi então aspirado das lâminas, e as lâminas foram imersas em solução alcalina a 4 ° C no escuro durante 30 min. Em seguida, para eliminar a solução alcalina, as lâminas foram armazenadas em Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão durante 5 min. As lâminas foram colocadas numa câmara de electroforese horizontal e submetido a electroforese com tampão TAE a 25 V durante 20 min. As lâminas foram secas e coradas com corante de ADN (Cell Biolabs). Caudas de cometa foram detectados sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Tokyo, Japão).

análise Western blot

As células foram lisadas em tampão de lise, e os lisados ​​de células totais que contêm quantidades iguais de proteínas foram carregadas 4-12% de geles de electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio e, em seguida, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite dissolvido em PBS contendo 0,02% de Tween-20 e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários específicos. As membranas foram subsequentemente incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano específica. As bandas de proteína foram visualizadas usando um sistema de fusão FX5 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Alemanha). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-caspase 3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), anti-caspase 9 (Cell Signaling Technology), anti-clivada PARP1 (Cell Signaling Technology), anti-survivina (Abcam , Cambridge, MA, EUA), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), e anti-α-actina (Sigma-Aldrich).

A análise estatística

Os resultados eram apresentados como média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Estudante de

t

-teste. A

P

-valor foi considerado inferior a 0,05 estatística significativa.

Ética Declaração

Todos os protocolos de animais utilizados no estudo atual foram revisados ​​e aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Comité na Dongnam Institute of Radiological Ciências Médicas (dirams-IACUC-11-005).

Resultados

Efeitos de 5-aza-DC no radiossensibilidade de linhas celulares de cancro colorectal

Para determinar se 5 -aza-dC aumenta a sensibilidade celular a IV, o cancro do cólon linhas celulares HCT116, SW480, RKO, Colo320, e NSO foram expostos a 5-aza-dC em duas doses diferentes (0,5 uM e 1 uM) durante 72 h antes de ser expostos a três doses diferentes IR (2 Gy, 5 Gy e 10 Gy) (figura S1). Em seguida, um ensaio clonogénico foi realizada mostrando que a 5-aza-dC poderia radiossensibilizar todas as linhas de células de cancro do cólon testados, e a combinação de 5-aza-dC e IR foi superior ao tratamento do que só 5-aza-dC. As células NSO, geneticamente inibir DNMT1 e 3b, demonstrou supressão de crescimento também por IV com forma dependente da dose (Figura 1A).

(A) ensaio clonogénico de HCT116, células SW480, Colo320, e RKO tratadas com 5-aza -DC (0,5 e 1 uM) e /ou RI (2 Gy, 5 Gy e 10 Gy). ensaio clonogénico de irradiado (2 Gy, 5 Gy e 10 Gy) células NSO. As células foram semeadas em placas de 6 poços (5000 células /poço) e tratou-se com 5-aza-dC /IV. Após 2 semanas, as culturas foram fixadas com etanol e coradas com 1,25% de violeta de cristal. Fotografias de colónias individuais também são mostrados. (B-E) fracção de sobrevivência (SF) de HCT116 /NSO (B), SW480 (C), Colo320 (D) e células RKO (E) tratados com 5-aza-dC (0,5 e 1 uM) e /ou ionizante radiação (IR, 2 Gy, 5 Gy e 10 Gy). O SF foi calculada como colônias /média células semeadas. O rácio de aumento de dose foi calculada como a razão entre a curva de SF obtido por tratamento com uma combinação de 5-aza-dC e IV ao obtido por meio de tratamento só com IR. Os dados são expressos como o desvio-padrão médio ± de três experiências independentes.

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-Valores foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

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. 0,001

curvas de sobrevida de radiação foram gerados para cada linha de células tratadas com 5-aza-DC e IR para entender se a irradiação pode ser sensibilizados por 5 -aza-dC, em linhas celulares de cancro do cólon (Figura 1B-E). Utilizando a dose necessária para gerar uma fracção de sobrevivência (SF) de 0,5 como uma referência, as taxas de dose de realce (Ders) foram estimados. As células tratadas com 5-aza-dC durante 72 h antes da irradiação mostraram um aumento na sensibilidade à radiação, com um DER: 1,19 (0,5? M de 5-aza-dC) e 1.41 (1? M de 5-aza-dC) em células HCT116, 1,23 (0,5? M de 5-aza-dC) e 1,42 (1 uM 5-aza-dC) em células SW480, 1,23 (0,5? M de 5-aza-dC) e 1,28 (1 uM 5-aza-dC) em células Colo320, e 1,14 (0,5? M de 5-aza-dC) e 1.31 (1? M de 5-aza-dC) em células RKO (Figura 1B-e). Os nossos dados sugerem que uma dose mais baixa de 5-aza-dC poderia radiossensibilizar células de cancro colorrectal. Porque 1 uM 5-aza-dC ou 10 Gy de IR são citotóxicos, doses relativamente baixas de 5-aza-dC (0,5 uM) e IV (2 Gy e 5 Gy) foram escolhidos para mais estudos para examinar os efeitos da combinação de um inibidor DNMT, 5-aza-dC e IR.

A combinação de 5-aza-dC e IR induzida por supressão do crescimento de células cancerígenas do cólon

Analisamos a proliferação celular em células HCT116 tratada com 5 -aza-dC ou IV sozinho ou com a combinação de 5-aza-dC e IR. As curvas de crescimento demonstrou que o tratamento com uma combinação de 5-aza-dC e IV (2 Gy e 5 Gy) resultou em inibição estatisticamente significativa do crescimento em células HCT116 e SW480 em cada ponto de tempo examinado (24, 48, 72, e 96 h ) em comparação com o que em células de controlo, em células tratadas apenas com 5-aza-dC, ou em células tratadas apenas com IV (2 Gy e 5 Gy) (Figura 2A;

P

0,05). Além disso, realizou-se o ensaio de MTT em ambas as células SW480 e HCT116 que tinham sido tratados com ou sem 5-aza-dC (0,5 uM) e, em seguida, irradiada-los com 2, 5, e 10 Gy, respectivamente. A absorvância do ensaio realizado em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IR foi significativamente menor (

P

0,05) do que a partir de células tratadas com 5-aza-dC ou IV sozinho ( A Figura 2B). Também foi realizada a análise da curva de crescimento e o ensaio de MTT em células NSO, que também apresentaram uma diminuição da supressão do crescimento, bem como a proliferação, dependendo da dose de radiação (Figura 2A e B). Assim, estes resultados indicam que os efeitos de 5-aza-dC e IR sobre a inibição do crescimento são aditivos. Com base em nossa

in vitro

dados de inibição do crescimento significativo em células tratadas com a combinação de 5-aza-DC e IR, estávamos interessados ​​em determinar se estes efeitos podem ser observados

in vivo

. Para este fim, as células HCT116 foram expostas a 5-aza-dC (0,5 uM) durante 72 h antes da exposição ao IV (2 Gy e 5 Gy), e, em seguida, foram injectados subcutaneamente em ratinhos SCID. Figura 2C mostraram retardou significativamente o crescimento tumoral com o tratamento combinado de 5-aza-dC e IV (2 Gy e 5 Gy) em comparação com um único tratamento com 5-aza-dC ou IR. Além disso, o volume dos xenoenxertos de células tratadas tanto com 5-aza-dC e IV foram reduzidos em comparação com aqueles a partir de células tratadas com 5-aza-dC ou IV sozinho.

(A) o crescimento celular curvas obtidas usando 0,5 uM duas doses diferentes de radiação (2 Gy e 5 Gy) em células cancerígenas do cólon (HCT116, NSO e SW480) e (B) Os ensaios de MTT em células cancerígenas do cólon 5-aza-dC e tratados com 5-aza-dC (0,5? M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy). Os dados são expressos como o desvio-padrão médio ± de experiências em triplicado. (C) O crescimento do tumor após o tratamento com 5-aza-dC (0,5? M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy) em ratinhos SCID. células HCT116 (5 × 10

6 células) que tinha sido tratado com 5-aza-dC (0,5 uM) e irradiado (2 Gy e 5 Gy) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos SCID (n = 4), e a média o tamanho do tumor foi medido uma vez por semana durante 7 semanas.

P

-Valores foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

Para elucidar os mecanismos de inibição do crescimento por 5-aza-dC, IR, eo tratamento de combinação, usamos citometria de fluxo análise para determinar se a inibição de crescimento estava associada com as alterações do ciclo celular. A análise da distribuição do ciclo celular mostraram que a proporção de células tratadas em G1, S, e fases G2-M não foi diferente da das células de controlo, excepto que não havia um aumento na proporção de células na fase sub-G1, sugerindo um aumento na apoptose (Figura 3). A proporção de células HCT116 tratadas com 5-aza-dC ou IR (2 Gy) sozinho na fase sub-G1 de células foi oito vezes (5-aza-dC), duas vezes (IR, 2 Gy), e quatro vezes (5 Gy) maior do que a de células de controlo e mais oito vezes maior em células tratadas com 5-aza-dC e IV do que em células de controlo. Curiosamente, ao contrário das células HCT116, SW480 células mostraram G2 /M prisão após IR sozinho (2 Gy e 5 Gy) em comparação com controles [2-Gy G2 /M fração: 46,77% (vs. 28,03% em células de controle); 5 Gy G2 /M de Fracção: 58,88% (22,03% vs em células de controlo)]. No entanto, a fase de sub-G1 de células tratadas com 5-aza-dC ou IR (2 Gy) por si só era de seis vezes (5-aza-dC), duas vezes (2 Gy), e sete vezes (5 Gy) maior do que as células de controlo e um excesso de 19 vezes de aumento de células tratadas com 5-aza-dC e IV do que em células de controlo. Nós também confirmou que a fase sub-G1 de células irradiadas com 2 Gy ou 5 Gy em comparação com células de controlo foi aumentada em células NSO. Portanto, podemos concluir que os efeitos inibidores de crescimento de 5-aza-dC ou do IR são devido a um aumento da apoptose.

células cancerosas Colon (HCT116, NSO e SW480) tratados com 5-aza-dC (0,5 ? M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy) foram coradas com iodeto de propidio e analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACS. As colunas mostram a percentagem de células em cada fase do ciclo celular. coluna preto, fase sub-G1; coluna de cinza brilhante, fase G1; escura coluna de cinzas, fase S; coluna branco, fase G2-M.

A combinação de 5-aza-dC e IV contribui para a indução da apoptose em células de cancro do cólon

Para clarificar a indução de apoptose pela 5-aza-dC combinado com IV em células HCT116 e SW480, as células foram duplamente coradas com anexina V marcada com fluoresceína-isotiocianato e PI. O nível de apoptose induzida por 5-aza-dC combinado com IR foi maior do que por IV (1,7 vezes para 2 Gy ou 1,8 vezes durante 5 Gy) ou 5-aza-dC sozinho ( 2,4 vezes) em HCT116 células. Curiosamente, observou-se resultados semelhantes nos níveis de apoptose elevada induzida pelo tratamento combinado com 5-aza-dC e IV em comparação com IV (3,4 vezes para 2 Gy ou 2,4 vezes durante 5 Gy) ou 5-aza-dC ( 1,5-vezes) em células SW480 sozinho (Figura 4A). Além disso, foram investigados os mecanismos celulares subjacentes aos efeitos apoptóticos da combinação de 5-aza-dC e IR. Uma das cascatas de sinalização mais comuns envolvidas em apoptose é a activação da apoptose família altamente específico de caspases, as quais, uma vez activadas, iniciar a morte das células por clivagem e activação de caspases efectoras apoptose [17] de condução. Para determinar se as caspases mediada os efeitos de 5-aza-dC e IV, foram medidas as actividades das caspases 3 e 7, que são essenciais para a efectores de apoptose em células de mamíferos [18]. Em ambos os extractos de células tratadas com 5-aza-dC e IV, quer isoladamente ou em combinação, as actividades das caspases 3 e 7 foram grandemente aumentada em células tratadas com 5-aza-dC e IV (2 Gy e 5 Gy) em comparação com aqueles em células tratadas com IR ou sozinhos 5-aza-dC (Figura 4B). Estes resultados correspondem com o aumento na apoptose causada pelo tratamento combinado de 5-aza-dC e IV e é mostrado na Figura 4A. Em ambas as análises, as células NSO foram também mostrado aumentar o nível de apoptose por IV. Estes resultados são fortemente apoiada pela cauda do cometa mais longas observadas no ensaio de cometa, indicando uma maior quantidade de danos do ADN celular em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IV, em comparação com células de controlo ou as células tratadas com 5-aza-dC ou IV sozinho (Figura 4C e D).

(a) Os níveis de apoptose foram medidas utilizando anexina V e 7-amino-actinomicina e analisadas utilizando um FACS citómetro de fluxo. Os níveis de apoptose em HCT116, células NSO e SW480 tratadas com 5-aza-dC (0,5? M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy) foram expressos como percentagens da população total de células em ambas as fases precoce e tardia da apoptose. (B) As atividades de caspases 3 e 7 foram determinados utilizando o ensaio de Caspase-Glo e foram representados como percentagens de HCT116, NSO e células SW480 tratados com 5-aza-dC (0,5 M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy) em comparação com células não tratadas. O gráfico representa os dados (média ± desvio padrão) de três experiências independentes. (C) micrografias representativas de corante de ADN fluorescente usando o teste do cometa. fragmentação de ADN através do ensaio de cometa em HCT116, células SW480 e NSO tratadas com 0,5 uM de 5-aza-dC e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy). (D) A quantificação de células de DNA danificado representa a média de três campos microscópicos aleatórios por amostra, e as barras de erro representam ± desvio padrão. NS indica nenhuma significância.

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-Valores foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

As caspases 3 e 9 são também conhecida por estar envolvida na apoptose induzida por radiação [19]. Assim, utilizou-se transferência Western para confirmar os níveis de activação de caspases 3 e 9 em células tratadas com 5-aza-dC e /ou IV. A Figura 5 mostra os níveis mais elevados de caspases activadas 3 e 9 em HCT116, NSO, células SW480 e tratados com 5-aza-dC ou IV sozinho comparado com aqueles em células de controlo. Curiosamente, Western blotting, no três, testadas linhas celulares de cancro do cólon, revelaram que os níveis de proteína das caspases 3 e 9 foram também aumentadas em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IV, quando comparada com células tratadas com qualquer agente isoladamente ou em células de controlos. O nível de PARP1 clivado, que é um outro efectora chave de indução de apoptose [20], [21], foi também aumentada em células tratadas com 5-aza-dC ou IR isoladamente, em comparação com células de controlo, e ainda mais aumentada em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IR. Em contraste, os níveis de expressão de proteína de survivina foram diminuídas nas células tratadas com 5-aza-dC e IV sozinho e em combinação em comparação com aqueles em células de controlo. Além disso, testou-se o nível de p53 bem. Curiosamente, o nível de expressão de p53 aumentada em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IV do que nas células tratadas apenas com 5-aza-dC. Estes dados são acordo com o relatório anterior, que consiste em células que expressam a p53 de tipo selvagem são melhor IR sensível do que o tipo de p53 mutante [14]. Estes padrões de expressão de proteína foram confirmados em células NSO irradiados. Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que a combinação de 5-aza-dC e IR induz sinergicamente um nível mais elevado de apoptose em comparação com um tratamento único, utilizando 5-aza-dC ou IV em várias células cancerígenas do cólon.

? Western blot? análise para a expressão de proteínas associadas à apoptose (caspase 3, caspase clivada 9, Parp1 clivado, survivina, e p53) em células HCT116 e SW480 tratadas com 5-aza-dC (0,5? M) e /ou irradiação (2 Gy e 5 Gy), bem como em células NSO irradiados, usando caspase 3 clivada, caspase 9 clivada, PARP1 clivado, survivina, anticorpos e p53.

Discussão

resultados de exposição de IV em a activação simultânea ou infra-regulação de múltiplas vias de sinalização que desempenham papéis críticos no controlo específica do tipo de célula de sobrevivência ou morte. RI é um agente genotóxica bem conhecido e carcinógeno humano que provocam danos celulares através de mecanismos directos e indirectos [22]. Recentemente, vários estudos têm-se centrado nas moléculas e processos que influenciam a resposta das células de IR. Muitos tipos diferentes de moléculas são conhecidos para aumentar a radiossensibilidade ao afectar os pontos de verificação do ciclo celular, a reparação do ADN, a transcrição do gene, e a apoptose. Os estudos mais recentes têm sugerido que os mecanismos epigenética tais como a modificação de histonas e metilação do DNA estão associados com o silenciamento do gene e pode estar envolvido na regulação da radiossensibilidade de células cancerosas. Um número de estudos prévios relataram que vários inibidores de histona-desacetilase são citotóxicos e podem sensibilizar células tumorais para a radioterapia. No entanto, pouca informação disponível sobre os efeitos de inibidores DNMT sobre radiossensibilização [13], [23]. Além disso, 5-aza-dC foi demonstrada para ter pouca actividade em tumores sólidos como um único agente [24], [25], e pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares ou celulares subjacentes a radiossensibilidade induzida por inibidores epigenética. Combinando drogas epigenéticas com radioterapia é particularmente interessante, neste contexto, e tem demonstrado maior eficácia tanto

in vitro

e

in vivo

em vários tumores sólidos [13] – [15], [26 ]. No presente estudo, foram investigados os efeitos celulares do inibidor DNMT, 5-aza-dC, e IR, tanto sozinho e em combinação, sobre as células de cancro do cólon. Descobrimos que a 5-aza-dC demonstraram efeitos aditivos sobre a inibição do crescimento combinado com IR, sugerindo que 5-aza-dC pode ser um sensibilizador à radiação úteis no tratamento do cancro do cólon. Uma coisa que precisamos considerar adicional com base nos nossos resultados, células NSO, sistema modelo genético para a inibição da DNA metiltransferase, não parecem ter mais forte efeito de crescimento supressiva com IR do que usando o sistema de modelo farmacológico que nós tratamos 5-aza-dC com IR.

uma vez que os nossos resultados indicam que este efeito é mediado pela indução de apoptose, a apoptose tem sido anteriormente considerado como um mecanismo potencial para a radiossensibilização. Vários resultados diferentes têm sido relatadas em relação aos efeitos inibidores de radiosensíveis DNMT. Dote et ai. relatado anteriormente que a combinação de IR e Zebularina não aumentou significativamente a apoptose [13]. Em contraste, Qiu et al. demonstraram que a 5-aza-dC radiossensibilização induzida em certas linhas celulares de cancro gástrico e causou um aumento em apoptose, a qual foi acompanhada por expressão aumentada de

p53

,

RASSF1

, e

DAPK famílias de genes

[14]. No nosso estudo, 5-aza-dC aumentou o nível de apoptose em células HCT116 e SW480, uma constatação que foi consistente com os resultados de Qiu et al. Muito interessante, Qiu et al. também sugeriu que as linhas celulares de cancro gástrico expressando p53 de tipo selvagem são mais sensíveis à terapia de combinação com IR e 5-aza-dC em comparação com aquelas que expressam o mutante p53. A linha de células HCT116 utilizada neste estudo expressa p53 de tipo selvagem, e observou-se que o nível de p53 aumentam em resposta a 5-aza-dC tratamento ambos com e sem IR. Além disso, o nível de expressão de p53 aumentada em células tratadas com uma combinação de 5-aza-dC e IV do que nas células tratadas apenas com 5-aza-dC. No entanto, ao contrário de células HCT116, nenhum efeito foi mostrado no nível de p53 em células SW480, que expressa a p53 mutante tipo (Figura 5). p53 tem sido classicamente descrita como um mediador da citotoxicidade IR e actua promovendo quer a paragem do ciclo celular ou apoptose [27], [28]. Estudos anteriores relataram que o 5-aza-dC induz a expressão de p53, a qual está associada com a inibição da proliferação celular em células p53 do tipo selvagem, mas não em células p53 mutantes no cancro da próstata [29], [30]. No entanto, porque apenas algumas linhas de células e moléculas associadas a p53 foram examinados nestes estudos, mais investigação sobre a possível associação de 5-aza-dC com p53 é necessário. Outras investigações também é necessária para identificar alterações epigenéticas adicionais associados com a radiossensibilidade. Há estudos limitados sobre o papel da metilação do DNA na resistência a IR. Um estudo anterior indicou que o tratamento com 5-aza-dC provoca hipometilação global, que possui um efeito sensibilizador [23]. Portanto, estudos definitivos devem ser realizados para determinar se IR tem um efeito sobre a metilação do DNA site- ou específica do gene no câncer (manuscrito em preparação).

Neste estudo, análise do ciclo celular não foi significativamente alterada pela única