Sumário

Neste estudo, seis a 2 phenylnaphthalenes com grupos hidroxilo foram sintetizados com rendimentos elevados por a desmetilação dos metoxi-2-phenylnaphthalenes correspondentes, e um 2-fenilnaftaleno com um grupo amino foi obtida pela hidrogenação. Todos os derivados de 2-fenilnaftaleno foram avaliados quanto à citotoxicidade, e a relação estrutura-actividade (SAR) contra (MCF-7), as células de cancro da mama humano foi também determinada. Os resultados revelaram que a SAR de citotoxicidade foi acentuadamente promovida por o grupo hidroxilo na posição C-7 do anel de naftaleno. A introdução de grupos hidroxilo na posição C-6 do anel de naftaleno e o C-4 ‘do anel de fenilo bastante melhorada citotoxicidade, mas a introdução de um grupo hidroxilo na posição C-3′ do anel de fenilo diminuiu ligeiramente citotoxicidade. No geral, o 6,7-di-hidroxi-2- naftaleno (4’-hidroxifenil) (PNAP-6H) exibiu a melhor citotoxicidade, com um IC

50 valor de 4,8 uM contra a linha de células MCF-7, e mostrou uma baixa toxicidade em relação às células epiteliais mamárias humanas normais (MCF-10A). PNAP-6H levou a prisão de células na fase S, muito provavelmente devido ao aumento dos níveis de p21 e p27 e diminuição dos níveis de ciclina D1, CDK4, ciclina E, CDK2 e. Além disso, PNAP-6H diminuiu CDK1 e expressão da ciclina B1, mais provavelmente levando a G

2 /H de detenção, e as alterações morfológicas induzidas, tais como encolhimento nuclear, fragmentação nuclear, e hypercondensation nuclear, como observado pela Hoechst 33342 coloração. PNAP-6H apoptose induzida, muito provavelmente através da promoção de expressão de Fas, um aumento da actividade de PARP, caspase-7, caspase-8, e caspase-9 expressão, o Bax /Bcl-2 rácio, e a fosforilação da p38 e diminuiu a fosforilação de ERK. Este estudo fornece a primeira demonstração da citotoxicidade de PNAPs contra células MCF-7 e elucida o mecanismo subjacente a citotoxicidade induzida pelo PNAP

Citation:. Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang TH (2015) estrutura- actividade Relação de síntese 2-Phenylnaphthalenes com grupos hidroxilo que inibem a proliferação e induzem a apoptose de células cancerosas MCF-7. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10.1371 /journal.pone.0141184

editor: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN

Recebido: 13 Julho, 2015; Aceito: 06 de outubro de 2015; Publicação: 22 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: os autores gostariam de agradecer ao Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 103-2320-B-039-027-; MAIS 103-2113-. M-039-003- ea maioria dos 103-2738-M-039-001-), China Medical University (CMU103-N-05), e, em parte, a concessão da Medicina chinesa Research Center, China Medical University (Ministério da Educação, o objectivo para o Plano Universidade Top) para apoio financeiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

de mama é a causa mais comum de morte por câncer em mulheres; Por conseguinte, a busca de um novo e eficaz agente anti-cancro é imperativo. derivados de naftaleno exibir potente anti-arritmia, anti-tumoral, e as actividades antioxidantes [1]. Farmacologicamente, 2-phenylnaphthalenes (PNAPs) têm requisitos espaciais e conformacionais semelhantes a genisteína (uma isoflavona) e apresentam um grande número de efeitos biológicos e biomédicas [2]. Quimicamente, um naftaleno-substituído, naftaleno-2 não substituído, é obtido pela substituição aromática electrofílica de naftaleno. Para o melhor de nosso conhecimento, estudos sobre a relação entre a estrutura e citotoxicidade de PNAPs de multi-substituídos são raros. Neste estudo, foram sintetizados não substituído PNAP-1, sete metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), seis correspondente hidroxi-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H), e uma amino-PNAP (PNAP-8H) e investigaram as suas relações anticancerígenos e mecanismos de acção na linha celular MCF-7 de estrutura-actividade.

Vários estudos têm demonstrado que a genisteína e compostos com a fenil-1-benzopiran-4-ona espinha dorsal inibir o crescimento de células cancerosas através de paragem do ciclo celular e a indução de apoptose [3-5]. quinase dependente (CDK) complexos de ciclina-ciclina são os principais reguladores do ciclo celular, o que é um processo muito complexo e rigorosamente regulado [6,7]. O G

transição de fase 1 /S é regulado por activação da ciclina D1-CDK4 /6 complexa ea ciclina E-CDK2 complexo de [8,9], ao passo que a L

2 /H de transição de fase é regulada pela activação da ciclina B1-CDK1 complexo [10,11]. A desregulação do ciclo celular provoca uma falta de diferenciação e crescimento aberrante.

A apoptose é um processo evolutivo que leva à morte programada das células [12]. O processo de apoptose alterações morfológicas inclui (por exemplo, encolhimento celular, formação de bolhas de membrana, condensação de cromatina e fragmentação nuclear) e alterações bioquímicas (por exemplo, quebra do ADN, clivagem da proteína, e proteína de ligação cruzada) [13,14]. Muitos agentes anticancerígenos induzir a morte celular por caspases de activação, que fazem parte de uma via apoptótica comum [15,16]. vias extrínsecas e intrínsecas que regulam a apoptose dependente da caspase foram identificados [17]. Na via extrínseca, FAS, um receptor de morte, leva à formação de um indutor de morte FADD-caspase-8 de sinalização complexo [18]. A via intrínseca é controlada pela família Bcl-2 de proteínas. Em primeiro lugar, a relação de Bax /Bcl-2 aumenta, e este aumento é seguido pela libertação de citocromo C, que conduz à activação de caspase-9 e caspase-3 [19]. A via da MAPK é bem conhecida pela sua regulação da sobrevivência celular e apoptose. A família de MAPK é composto de três principais: quinases ERK, p38, JNK e [20]. ERK é preferencialmente activada por factores de crescimento, conduzindo ao crescimento e sobrevivência celular. p38 e JNK são preferencialmente activada por estimulação de citocinas e estresse oxidativo, resultando na diferenciação celular e apoptose [21,22]. Não está claro se a via intrínseca /extrínseca ou da via MAPK é ativado em apoptose PNAP mediada. Neste estudo, avaliou-se a citotoxicidade de uma série de PNAPs contra células MCF-7 e elucidou o mecanismo subjacente a citotoxicidade induzida pelo PNAP.

Materiais e Métodos

Química

as abordagens utilizadas para sintetizar os derivados de PNAP quinze são mostradas na Fig 1. 2-fenilnaftaleno (PNAP-1) e sete metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) foram sintetizados a partir disponíveis comercialmente fenilacetonitrilos e benzaldeídos de acordo com métodos previamente relatados [23]. Seis correspondentes hidroxi-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H) foram obtidos por desmetilação do PNAP-2-PNAP-7 em excelentes rendimentos (91% a 100%). Um amino-PNAP (PNAP-8H) foi obtido por hidrogenação do PNAP-8 com um rendimento de 86%. O

1H e

13C espectros de PNAP-2h-PNAP-8h estão disponíveis nas Informações Coadjuvante (Figuras A-G no arquivo S1). Todos os PNAPs foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 50 mM para preparar soluções de reserva, as quais foram armazenadas a -20 ° C.

Os oito 2-phenylnaphthalenes (PNAP-1-PNAP-8) foram facilmente obtido a partir de fenilacetonitrilos e benzaldeídos através de seis passos. Subsequentemente, o hidroxi-PNAPs seis (PNAP-2H-PNAP-7H) foram obtidos por desmetilação do correspondente metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Infelizmente, as tentativas de a desmetilação de PNAP-8 sob as mesmas condições resultaram misturas complexas. Outra hidrofílica amino-PNAP (PNAP-8h) foi produzido pela redução do nitro-PNAP (PNAP-8).

Procedimento Geral para a Preparação de hidroxi-PNAPs.

BBr

3 em CH

2Cl

2 a uma concentração de 1 M (5 mL, 5 mmol) foi adicionado lentamente a uma solução de metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) em CH

2Cl

2 (20 mL) a 0 ° C. A mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante 1 h. A solução resultante foi vertida em H

2O (50 mL). O

2O H camada foi extraída com EtOAc (3 × 50 ml), e os extractos combinados foram lavados com H

2O (3 x 50 mL), secou-se com MgSO anidro

4, e filtrou-se. O filtrado foi concentrado, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica e eluiu-se com EtOAc para se obter o hidroxi-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H). Os dados espectrais completos destes compostos são descritos como se segue

6-Hidroxi-2-fenilnaftaleno (PNAP-2H)

91% de rendimento..; sólido branco, pf 176-177 ° C (lit. [24], pf 169-170 ° C).

RMN de 1H (500 MHz, CDCl

3)

δ

5,12 (1H, s largo), 7,12 (1H, dd,

J

= 8,8, 2,4 Hz), 7,17 (1H, s), 7,36 (2H, t,

J

= 7,4 Hz), 7,47 (1H, t,

J

= 7,4 Hz), 7,69-7,71 (3H, m ), 7,75 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,80 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,97 (1H, s);

13C RMN (125 MHz, CDCl

3)

δ

109,3, 118,2, 125,7, 126,3, 126,9, 127,1, 127,2 (2 x C), 128,8 (2 x C), 129,2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5; IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 219 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O: 219,08044; encontrado:.. 219,08036 [M-H]

–

6,7-Di-hidroxi-2-fenilnaftaleno (PNAP-3h)

Rendimento de 98%; sólido branco, pf 205-207 ° C.

RMN de 1H (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

7,12 (1H, s), 7,20 (1H, s), 7,32 (1H, t,

J

= 7,5 Hz), 7,45 (2H, t,

J

= 7,5 Hz), 7,50 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,65 ( 1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,72 (2H, d,

J

= 7,5 Hz), 7,86 (1H, s), 9,57 (2H, s largo);

13 C RMN (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 × C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 x C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4; IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 235 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O

2: 235,0754; encontrado:.. 235.0755 [M-H]

–

2- (4′-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-4h)

100% de rendimento; sólido branco, pf 166-167 ° C (lit. [25], pf 167-169 ° C).

RMN de 1H (500 MHz, CDCl

3)

δ

4,89 (1H, s largo), 6,95 (2H, d,

J

= 8,6 Hz), 7.44- 7,50 (2H, m), 7,61 (2H, d,

J

= 8,6 Hz), 7,70 (1H, dd,

J

= 8,5, 1,7 Hz), 7,84-7,90 (3H , m), 7,97 (1H, s);

13C RMN (125 MHz, CDCl

3)

δ

115,7 (2 x C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 x C), 132,3, 133,7, 133,9, 138,1, 155,1; IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512, 1180 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 219 (41, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O: 219,08044; encontrado:.. 219,08043 [M-H]

–

6-hidroxi-2- (4′-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-5H)

93% de rendimento; sólido branco, pf 127-128 ° C (lit. [26], pf 258-262 ° C).

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,86 (2H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,01 ( 1H, dd,

J

= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1H, s), 7,56 (2H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,63 (1H, dd,

J

= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1H, d,

J

= 8,6 Hz), 7,78 (1H, d,

J

= 8,8 Hz), 7,94 (1H, s), 9,51 (1H, s largo), 9,70 (1H, s largo);

13 C RMN (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

108,6, 115,9 (2 × C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 x C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0; IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512, 1265, 1204 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 235 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O

2: 235,0754; encontrado:.. 235.0751 [M-H]

–

6,7-di-hidroxi-2- (4′-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-6H)

98% de rendimento; sólido branco, pf 280-282 ° C.

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,84 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,08 ( 1H, s), 7,13 (1H, s), 7,42 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,53 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,58 ( 1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,73 (1H, s), 9,46 (3H, s largo);

13 C RMN (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 109,9, 115,8 (2 × C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 x C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8; IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 251 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O

3: 251,07027; encontrado:. 251,07032 [MH]

–

6,7-di-hidroxi-2- (3 ‘, 4’-di-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-7H)

100% de rendimento. ; sólido branco, p.f. 230 ° C (decomp.).

1H NMR (500 MHz, DMSO

d

6)

δ

6,80 (1H, d,

J

= 8,2 Hz), 6,98 ( 1H, dd,

J

= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1H, s), 7,09 (1H, d,

J

= 2,0 Hz), 7,13 (1H, s), 7,37 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,57 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,68 (1H, s), 8,94 (2H, s largo) , 9,46 (2H, s largo);

13 C RMN (125 MHz, DMSO

d

6)

δ

109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3; IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 267 (100, [M-H]

-); HRESIMS

m /z

calculado para C

16H

11O

4: 267,0652; encontrado:.. 267.0647 [MH]

–

2- (4′-aminofenil) -6,7-dimetoxinaftaleno (PNAP-8h)

PNAP-8 (77 mg, 0,25 mmol) foi submetido a hidrogenação (50 psi) utilizando 10% de Pd /C como catalisador em tetra-hidrofurano (THF, 10 mL) e EtOH (1 mL) à temperatura ambiente durante 12 h. A mistura de reacção foi filtrada, e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica e eluiu-se com EtOAc para se obter PNAP-8h. Rendimento de 86%; sólido amarelo pálido, p.f. 190-191 ° C.

RMN de 1H (500 MHz, CDCl

3)

δ

3,74 (2H, s largo), 4,01 (6H, s), 6,79 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,12 (1H, s), 7,15 (1H, s), 7,52 (2H, d,

J

= 8,1 Hz), 7,56 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,71 (1H, d,

J

= 8,4 Hz), 7,82 (1H, s);

13C RMN (125 MHz, CDCl

3)

δ

55,9 (2 x C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 x C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 x C), 129,6, 131,8, 137,0, 145,6, 149,2, 149,7; IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 cm

-1; ESI

m /z

(int rel) 280 (100, [M + H]

+); HRESIMS

m /z

calculado para C

18H

17NO

2: 251,07027; encontrado: 251,07032 [M + H]

+

cultura celular

células MCF-7 foram obtidos do laboratório do Dr. Yang-Chang Wu (Faculdade de Farmácia, China Medical. células University, Taiwan) e MCF-10A foram obtidos do laboratório do Dr. Wei-Chien Huang (Instituto Universitário de Biologia do Câncer, China Medical University, Taiwan). As células MCF-7 foram mantidas em meio DMEM /F12 contendo soro de bovino fetal a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina. As células MCF-10A foram mantidas em meio DMEM /F12 contendo CaCl 1,05 mM

2, 100 mg /ml de toxina da cólera, 5% de soro de cavalo, 10 ug /ml de insulina, 500 ng /ml de hidrocortisona e 1% de penicilina-estreptomicina. Estas células foram cultivadas em incubadora de cultura de células, que foram fixadas a temperaturas de 37 ° C e suplementados com 5% de CO

2.

A viabilidade celular ensaio

células MCF-7 foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços, incubadas durante a noite e, em seguida, tratadas com diferentes concentrações (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 uM) de quinze PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 e PNAP-2H-PNAP-8H). Além disso, as células MCF-10A foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços, incubadas durante a noite e, em seguida, tratadas com diferentes concentrações (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, e 100 ^ M) de três PNAPs (PNAP-3H, -6h, e 7H). Depois de 48 h de tratamento, 10 ul de solução de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço, e as células foram incubadas durante 4 h adicionais a 37 ° C. O meio foi em seguida completamente removido, e 50 ul de DMSO foram adicionados para solubilizar os cristais de formazano MTT. A absorvância a um comprimento de onda de 550 nm foi em seguida medida utilizando um leitor de microplacas MQX200R (BioTek, VT, EUA).

ciclo celular análise

células MCF-7 foram semeadas a uma densidade de 3 × 10

5 células por poço em placas de seis poços, incubadas durante a noite e, em seguida, tratados com PNAP-1, -3H, e -6h em três concentrações diferentes (5, 10, e 25 uM). Após 48 h de tratamento, as células foram tripsinizadas, lavadas uma vez com PBS e fixadas em etanol a 70% durante 1 h a -20 ° C. As células fixadas foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, suspensos em 0,5 ml de PBS contendo 0,2 mg /ml de RNase e 0,1% de Triton X-100 durante 30 min à temperatura ambiente, e coradas com /mL de iodeto de propídio 20 ug. As células coradas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, CA, EUA). A fluorescência emitida a partir do complexo de ADN-iodeto de propídio foi estimado a partir de um mínimo de 10000 células por amostra e analisados ​​utilizando o software de busca celular Alias ​​(BD Biosciences, EUA).

análise Western blot

As células MCF-7 foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

5 células por poço em placas de seis poços, incubadas durante a noite e, em seguida, tratados com PNAP-1, -3H, e -6h em três concentrações diferentes (5, 10 , e 25 uM) durante 48 h. As células foram lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA arrefecido em gelo durante 30 min. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado a 15000 rpm e 4 ° C durante 30 min. A concentração proteica foi medida através de um ensaio Bio-Rad, utilizando um leitor de microplacas MQX200R (BioTek, VT, EUA). Os lisados ​​celulares foram separados por 10% SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EUA). Após diversas lavagens, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em (solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20) TBST durante 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 ° C com diferentes anticorpos primários contra ciclina D1, CDK4, ciclina E, CDK2, p21, p27, ciclina B1, CDK1, caspase-7, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bid, Fas, p-p38, p38, p-JNK , JNK, ERK-p, ou de ERK (diluição 1: 1000). As membranas foram então lavadas três vezes com TBST, e sondaram-se com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário (1: 2000) durante 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens em TBST, o anticorpo ligado foi visualizado utilizando o ECL Western Blotting Reagente (PerkinElmer, Boston, MA, EUA), e a quimioluminescência foi detectada utilizando um filme de raios X Fuji médicos (Tóquio, Japão).

estudos de morfologia celular

As células foram plaqueadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células /poço, incubada durante a noite e, em seguida, tratada com 1-PNAP, -3H, e -6h em três concentrações diferentes (5, 10, e 25 uM) durante 48 h. As células foram lavadas uma vez com PBS, e um subconjunto de células foi corada com Hoechst 33342 (10 ug /ml durante 15 min). As alterações morfológicas foram em seguida observadas por microscopia de luz a 100 × microscopia de ampliação e a fluorescência a 200 × ampliação.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como a médias ± SEM de três experiências em replicado . As diferenças entre os grupos foram comparados por análise de variância (ANOVA) e teste de post-hoc de Tukey Diferença Honestamente Significativa (HSD), utilizando o software SPSS 12.0 para Windows (EUA). Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados e Discussão

Efeito da PNAPs em MCF-7 viabilidade linha celular e estudo da sua relação estrutura-actividade

Para investigar os efeitos de 2-phenylnaphthalenes PNAP-1-PNAP-8, seus derivados desmetilação-PNAP-2H PNAP-7h, e amino-PNAP (PNAP-8H) sobre a sobrevivência de células, células MCF-7 foram tratados com diferentes doses de cada composto (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 uM) durante 48 h. As taxas de viabilidade foram determinados através do ensaio de MTT, e os resultados são mostrados na Tabela 1. Em primeiro lugar, PNAP-1 não mostrou qualquer actividade significativa em células MCF-7, e PNAP-2-PNAP-8, que contêm grupos metoxi, causada precipitação no meio das células em concentrações superiores a 5 uM (Tabela 1). Portanto, os derivados mais hidrófilo PNAP PNAP-2H-PNAP-8h foram concebidos e sintetizados. Com efeito, não se observou qualquer precipitação para PNAP-2H-PNAP-8H, muito provavelmente devido à formação de ligações de hidrogénio intermoleculares entre a água e o hidroxilo (ou grupos amino) nos 2-phenylnaphthalenes. Três dos derivados (PNAP-3H, -6h, e 7H) exibiu toxicidade dependente da dose significativa contra células MCF-7, com IC

50 valores de 17,9, 4,8 e 31,8 ^ M, respectivamente (Tabela 1), Considerando que as

50 valores IC obtidos contra as células MCF-10A foram 71,0, 50,9, e 55,1 mM, respectivamente. Os resultados indicam que PNAP-3H e -6h possuem aumentada e citotoxicidade selectiva contra células MCF-7 e mostram baixa toxicidade para as células MCF-10A.

Os resultados acima descritos revelaram que PNAP-5H, que tem grupos de hidroxilo na posição C-6 do anel de naftaleno e na posição C-4 ‘do anel de fenilo, exibiram melhor citotoxicidade do que PNAP-1, -2H, e -4h nos nossos testes. Este fenómeno mostra que a introdução de grupos hidroxilo na posição C-6 do anel de naftaleno e a posição C-4 ‘do anel de fenilo aumenta a citotoxicidade. Curiosamente, os dois 2-phenylnaphthalenes PNAP-3H e 6H, que contêm um grupo hidroxilo na posição C-7 do anel de naftaleno, exibem melhores actividades citotóxicas contra a linha celular MCF-7 (comparar PNAP-3H e a -2H comparar PNAP-6h às -5h). Estes resultados sugerem que a citotoxicidade é acentuadamente promovida pela presença de um grupo hidroxilo na posição C-7 do anel de naftaleno. Além disso, deve notar-se que PNAP-6H exibiram a melhor actividade contra a linha celular MCF-7 (IC

50 = 4,8 uM). Este resultado também indica que a introdução de um grupo hidroxilo na posição C-4 ‘do anel de fenilo iria aumentar as actividades contra a linhagem de células MCF-7. Em contraste, a presença de um grupo hidroxilo na posição C-3 ‘do anel de fenilo em PNAP-7H podem diminuir marcadamente a citotoxicidade (comparar PNAP-6H e 7H). Além disso, a comparação das actividades citotóxicas de PNAP-6H e PNAP-8H sugere que a presença de um grupo hidroxilo, o qual serve como um doador da ligação-H, no anel de naftaleno, produz melhores actividades do que a presença de um grupo metoxi, que serve como um aceitador de ligação-H. Com base na viabilidade celular e os resultados SAR, investigou ainda mais os possíveis razões para a diminuição na viabilidade celular induzida por PNAP-3H e -6h e elucidou o mecanismo subjacente.

Efeito do PNAPs sobre as características morfológicas de células MCF -7 células

em primeiro lugar, observou-se o efeito do PNAP-1, -3h e -6h na morfologia celular por microscopia de contraste de fase. Células MCF-7 tratadas tanto com um veículo de controlo (0,05% de DMSO) ou de 5 a 25 uM PNAP-1 mostraram populações de células densas sob um microscópio de contraste de fase (figura 2A-2D). As células MCF-7 foram regulares em forma e tamanho, com núcleos excêntricos e uma quantidade relativamente pequena de citoplasma. A densidade celular e estrutura de células tratadas durante 48 h com 5 a 25 uM PNAP-3H e -6h mostrou mudanças óbvias (Fig 2E-2J). As células tornou-se arredondado e encolhido e perdeu contato com as células adjacentes. Além disso, as células apoptóticas não adere ao substrato, fazendo com que se destacar a partir das placas de cultura e flutuar no meio de cultura. Assim, PNAP-3H e -6h levou a uma diminuição nos números de células MCF-7 viáveis ​​de um modo dependente da concentração, como se mostra na Tabela 1.

células MCF-7 foram tratadas com PNAP-1, -3h, e -6h em três concentrações (5, 10, e 25 uM) durante 48 h e, em seguida, (a-J), a morfologia foi observada por microscopia de luz (100 ×). As células foram coradas com Hoechst 33342, e, em seguida, (K-T), a morfologia foi observada por microscopia de fluorescência (200 ×). (/K A) controle; (B /G) 5 uM PNAP-1; (C /M) 10 uM PNAP-1; (D /N) 25 uM PNAP-1; (E /S) 5 uM PNAP-3H; (F /P) 10 uM PNAP-3H; (G /Q) 25 uM PNAP-3H; (H /R) 5? M PNAP-6h; (E /S) 10 uM PNAP-6H; e (J /t) de 25 uM PNAP-6h.

Observou-se também a morfologia nuclear de MCF-7 As células submetidas a Hoechst 33342 coloração fluorescente após o tratamento durante 48 horas com três concentrações (5, 10 , e 25 uM) de PNAP-1, -3H, e -6h (Figura 2L-2T). Os núcleos das células de controlo do veículo exibido uma forma oval intacta e foram exibiu uma fraca fluorescência azul (Fig 2K). No entanto, as células tratadas com PNAP-3H (25 uM) e PNAP-6H (5, 10, e 25 uM) exibiram características apoptóticas típicas, tais como encolhimento nuclear, fragmentação nuclear, e hypercondensation nuclear (Fig 2T-2T). Com base nestas observações microscópicas, propomos que a citotoxicidade observada pode ser parcialmente mediada por apoptose PNAP-3H- e induziu -6h-.

Efeito da PNAPs em MCF-7 do ciclo celular distribuição de fases

uma vez que a proliferação celular é regulada pelo ciclo celular, o efeito de PNAP-1, e -3H -6h na progressão do ciclo celular na linha de células MCF-7 foi examinado por citometria de fluxo e análise de western blot. Os resultados da análise de citometria de fluxo indicou que o tratamento com PNAP-6H durante 48 h aumentou o sub-L

1 população (Figura 3A). O sub-L

1 pico, que consistia de células com teor de DNA reduzida, representada a presença de células apoptóticas [27,28]. Além disso, a captura celular induzida por PNAP-6H no G

fase 2 /m obtida em concentrações mais baixas (5 e 10 uM) foi acompanhada por uma diminuição na percentagem de células encontradas na fase Go /G1. PNAP-5h e -6h causada prisão fase S a uma concentração mais elevada (25 mM), levou a um menor número de células replicando e suprimiu a proliferação celular. No entanto, as células tratadas com PNAP-1 não mostrou nenhuma mudança significativa na distribuição de ciclo celular em comparação com as células de controlo do veículo.

células MCF-7 foram tratadas com PNAP-1, -3H, e -6h em três concentrações (5, 10, e 25 uM) durante 48 h, e, em seguida, (a), as células foram fixadas e coradas com iodeto de propídio para analisar o teor de ADN por citometria de fluxo. (B, C), proteínas do ciclo celular-associados (ciclina D1, CDK4, ciclina E, CDK2, p21, p27, ciclina B1, e CDK1) foram detectados e analisados ​​por Western blot. A expressão foi quantificada com o sistema de análise de imagem Gel-Pro Analyzer computadorizado. Os dados são expressos como a média ± SEM de três ensaios independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 são significativamente diferentes do controlo

Com base nestas observações da distribuição do ciclo celular de células MCF-7, foram analisadas as mudanças na abundância de células. proteínas reguladoras do ciclo. complexos de ciclina-CDK são os principais reguladores da progressão do ciclo celular [7], e a actividade de ciclina /CDK complexos são regulados negativamente pela inibidores de CDK, tais como p21 e p27 [29]. PNAP-3h (a 25 pM) e PNAP-6H levou a prisão de células na fase S, muito provavelmente devido ao aumento dos níveis de p21 e p27 e níveis reduzidos de ciclina D1, CDK4, ciclina E, e CDK2, como determinado através do A análise por western blot (Fig 3B e 3C). Além disso, PNAP-6H induziu uma inibição da actividade da cinase CDK1 e uma diminuição na expressão da ciclina B1, mais provavelmente levando a G

2 /H prisão. Portanto, propomos que a inibição da viabilidade celular por PNAP-3H e -6h pode ser parcialmente mediado através da paragem do ciclo celular e apoptose.

PNAPs activar a via da caspase e aumentar a expressão de proteínas apoptóticas relativos

com base nos resultados acima, verificou-se que PNAPs pode evitar a proliferação, induzir apoptose, e diminuir a viabilidade celular na linha celular MCF-7. É sabido que numerosos fármacos anticancerígenos mediar a apoptose através da activação de caspases [16]. Para demonstrar que a apoptose induzida por PNAP em células MCF-7 ocorre por meio de activação de caspase, foi investigada a expressão de proteínas reguladoras chave associados com as vias caspases em células MCF-7 após exposição a 5 a 25? M PNAP-1, -3H, e -6h. Apesar da ausência de caspase-3 em células MCF-7, caspase-7, um verdugo apoptose, pode funcionar como um substituto [30]. Caspase-7 é capaz de clivar substratos de tetrapéptido específicas (por exemplo, PARP), e a clivagem de PARP é uma importante característica da apoptose [31]. A exposição das células MCF-7 a três concentrações (5, 10, e 25 uM) de PNAP-3H e -6h durante 48 h aumentou significativamente os níveis de caspase-7 e PARP clivada e aumentou a actividade da caspase-7 e clivado PARP de um modo dependente da dose (Fig 4A). Além disso, a apoptose pode ser estimulada através da vias intrínseca e extrínseca. A caspase-8 é geralmente considerado um activador de apoptose na via extrínseca, e caspase-9 desempenha um papel importante na via intrínseca [32]. Estes dados mostram que a expressão da caspase-8 e caspase clivada-9 em células MCF-7 aumentaram após o tratamento com PNAP-3H e -6h de uma forma dependente da dose. Além disso, clivada da caspase-8 e caspase-9 foi parcialmente inibida pelo específica da caspase-8-inibidor de Z-IETD-FMK e o 9-específico inibidor da caspase-Z-LEHD-FMK. Além disso, os dois inibidores também parcialmente inibida a clivagem de caspase-7 em PNAP apoptose induzida por derivado (Fig 5A e 5B) e parcialmente revertida a diminuição induzida PNAP-6 na viabilidade celular, tal como observado por microscopia e o ensaio de MTT (Fig 5C) . Estes resultados sugerem que as vias de caspase-7-, caspase-8, caspase-9 e mediadas pode ser parcialmente envolvido na regulação de apoptose induzida por PNAP.

(A) células MCF-7 foram tratados com PNAP-1, -3H, e -6h em três concentrações (5, 10, e 25 uM) durante 48 h, e a expressão da caspase-7 clivado, -8, -9 e PARP foi determinada por western blotting. (C) As células MCF-7 foram tratadas com 25? M PNAP-1, -3H, e -6h em três concentrações (5, 10, e 25 uM) durante 48 h, e a Bcl-2, Bcl-XL, Bax, níveis de Bax /Bcl-2, lance e Fas foram então detectadas por western blot. (B, D) A expressão foi quantificado usando um sistema de análise de imagem Gel-Pro Analyzer computadorizado. Os dados são expressos como a média ± SEM de três ensaios independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 são significativamente diferentes do controlo

células MCF-7 foram incubadas na presença ou na ausência de (A) o inibidor de caspase-8 Z-IETD-. FMK ou (B) o inibidor de caspase-9-Z LEHD-FMK durante 1,5 h antes da adição de PNAP-6h. As análises de Western blot foram realizadas com os anticorpos para a caspase-7, -8, -9 e, e actina. (C) células MCF-7 foram tratadas com PNAP-6h na presença ou ausência de inibidor de caspase-8, caspase-9 ou inibidor, e a morfologia foi então observada por microscopia de luz.

A a activação de caspase-8 é o primeiro passo na cascata de eventos apoptóticos induzidos pela estimulação de Fas [33], e a activação de caspase-9 é regulada por Bcl-2 membros da família [34-36]. No entanto, o tratamento de células MCF-7 com 25 mM derivados PNAP exerceu um efeito modesto sobre a expressão de Bcl-xl, proteínas Bax, e lance em três momentos (12, 24 e 48 h) (Fig 4C e 4D) .