Abstract

Tocopherylquinone (TQ), o produto de oxidação de alfa-tocoferol (AT), é uma molécula bioactiva com propriedades distintas de eM. Neste estudo, AT e TQ são investigados por seus efeitos comparativos sobre o crescimento e atividade androgênica em células de câncer de próstata. TQ potentemente inibiu o crescimento das linhas celulares de cancro da próstata responsivos aos andrógenos (células por exemplo, LAPC4 e LNCaP), enquanto que o crescimento de células de cancro de próstata independente de androgénios (por exemplo, células DU145) não foi afectada pela TQ. Devido aos efeitos inibidores do crescimento induzido pela TQ em células responsivos aos andrógenos, foram examinadas as propriedades anti-androgénicas de TQ. TQ inibiu a ativação induzida por andrógeno de um repórter andrógeno-sensível e inibiu a liberação de antígeno específico da próstata a partir de células LNCaP. TQ pré-tratamento também inibe a activação de AR, conforme medido usando o ensaio de rastreio multifuncional receptor andrógeno. Além disso, TQ diminuiu a expressão de genes responsivos aos andrógenos, incluindo TM4SF1, KLK2, e PSA ao longo de 5 vezes, enquanto que a não afectar a expressão de genes responsivos aos andrógenos. De importância, foram encontrados os efeitos antiandrogenic de TQ em células cancerosas da próstata resultar de proteína receptor de andrógeno infra-regulação produzido pela TQ que não foi observado com o tratamento AT. Além disso, nenhum dos endpoints androgênicos avaliados foram afetados pela AT. A diminuição da regulação da proteína do receptor de androgénio por TQ foi revogada através do co-tratamento com anti-oxidantes. Em geral, as acções biológicas de TQ foram encontrados para ser distinto da AT, onde TQ foi encontrado para ser um inibidor potente do crescimento celular e actividade androgénica em células de cancro da próstata responsivos aos andrógenos

citação:. Fajardo AM, MacKenzie dA, Olguin SL, Scariano JK, Rabinowitz I, Thompson TA (2016) Antioxidantes Abrogados Alpha-Tocopherylquinone-Mediated Down-Regulamento do receptor andrógeno em andrógeno-Responsive células cancerosas da próstata. PLoS ONE 11 (3): e0151525. doi: 10.1371 /journal.pone.0151525

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, United States |

Recebido: 21 de outubro de 2015; Aceito: 28 de fevereiro de 2016; Publicação: 17 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Fajardo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o apoio foi fornecido pelo National Institutes of Health subvenção, número do auxílio: 1 R03 CA133941 (TAT) e da Universidade do Novo México Cancer Center Focus-Interactive Group Award (TAT e IR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O papel da ação antioxidante no desenvolvimento e progressão do câncer não é clara. A vitamina E é uma família de factores de ocorrência natural alimentares (por exemplo, α-, β-, γ-, δ-tocoferóis e -tocotrienols) com uma importante forma biologicamente activa reconhecido como RRR-α-tocoferol (RRR-AT) [1, 2]. α-tocoferol (AT) actua principalmente como um antioxidante, reduzindo o dano oxidativo celular produzida por lípidos oxidados [1,2]. O produto de oxidação de NO é maior α-tocopherylquinone (TQ), que é formado pela oxidação de dois electrões do radical cromanol de AT (Figura 1). TQ tem propriedades químicas distintas, em comparação com EM com um espectro único de acções biomoleculares [3]. Por exemplo, TQ foi mostrado para inibir o crescimento de células cancerígenas do cólon, ao passo que AT não foi observada para alterar o crescimento destas células [4]. Embora TQ é estabelecido como uma quinona bioativo para alguns tipos de câncer, sua ação sobre o crescimento de células de câncer de próstata e de vias androgênicos em células de câncer de próstata são desconhecidas.

A AR é um contribuinte necessário ao desenvolvimento do câncer de próstata e é reconhecido como um alvo significativo para a prevenção e tratamento do câncer de próstata [5]. Isto é suportado pela importância da AR na progressão do cancro da próstata [6-8] e a partir do resultado dos estudos que utilizam inibidores do metabolismo de testosterona para prevenir o desenvolvimento do cancro da próstata [8,9]. A AR é um membro da superfamília de receptores da hormona esteróide /nuclear [10], que actua como um factor de transcrição activados por ligandos para os genes envolvidos no crescimento, sobrevivência, diferenciação e da próstata [11]. Além disso, a actividade de AR contribui para o desenvolvimento, progressão e manutenção de cancro da próstata [7,12]. Clinicamente, a regulação negativa da activação de AR é conseguida através de uma série de meios que incluem a interferência directa da sua ligação ao AR como com antagonistas de AR, por diminuição da produção de di-hidrotestosterona com inibidores de 5-alfa-redutase de androgénio, ou através da diminuição da produção de testosterona por gonadotropin-releasing agonistas da hormona e inibidores CYP17A1 [7,12,13]. Estas estratégias não visam directamente a expressão da proteína AR e, portanto, nestas intervenções, o AR permanece funcional.

As informações sobre as acções biológicas de TQ está limitado em comparação com as mais extensas investigações sobre AT. Até o momento, não há estudos que examinaram o efeito da TQ no crescimento celular e atividade androgênica em células de câncer de próstata. No entanto, a modulação da actividade de AR por agentes relacionados com o NO tem sido relatada. O mecanismo de inibição androgênica por estes produtos químicos podem ser direta ou indireta. Por exemplo, já anteriormente demonstrado que a porção cromanol de blocos de uma actividade androgénica por inibição competitiva de androgénio ligação ao AR [14]. A inibição directa da AR foi observado com a AT succinato, um derivado de éster de água mais solúvel do NO, que foi mostrado para regular negativamente a proteína AR nas células cancerosas da próstata responsivos aos andrógenos [15]. Porque análogos e derivados AT mostraram acção biológica contra as células cancerosas da próstata, enquanto que as ações do produto da oxidação da AT no câncer de próstata são desconhecidas, que teve como objetivo determinar se TQ possuía ação biológica única em células cancerosas da próstata. Neste estudo, foram avaliados os efeitos de ambos AT e TQ sobre a proliferação de células de câncer de próstata, atividade anti-androgênica e potencial mecanismo de proteína AR infra-regulação. Em comparação com a AT, TQ verificou-se ter propriedades distintas em linhas celulares de cancro da próstata responsivos aos andrógenos com acções notáveis ​​na expressão de AR. Os antioxidantes foram encontrados para modificar os efeitos da CP sobre estas células. Este estudo começa a elucidar o mecanismo de TQ na inibição da expressão da proteína que AR pode ser através da sua actividade para alterar o estado redox em células de cancro da próstata.

Resultados

A inibição da proliferação celular em androgénios próstata linhas celulares de cancro sensíveis por TQ

estudos anteriores demonstraram que o éster conjugado, solúvel em água VE análogos (por exemplo, vitamina E succinato) pode inibir o crescimento de células de cancro da próstata em cultura [15,16]. Devido a preocupações em relação à produção das formas livres fisiologicamente activas de EM e de TQ as formas conjugadas, as formas não conjugadas, livres destes agentes foram investigados. Como as formas livres de NO e TQ têm baixa solubilidade em água, um método de entrega à base de transportador foi desenvolvido para administrar as formas livres destes agentes em cultura de células, tal como descrito no

Materiais e Métodos

. EM tratamento teve efeitos mínimos sobre o crescimento de LAPC4 sensível ao androgénio e células LNCaP, bem como células de cancro da próstata DU145 independente de androgénios, após tratamento com concentrações de até 40 uM (Fig 2A). Em contraste, o tratamento TQ produziu uma diminuição do crescimento dependente da dose de LAPC4 responsivos aos andrógenos e células de cancro da próstata LNCaP, enquanto que o crescimento de células DU145 não foi afectada pela TQ em doses até 40 uM (Fig 2B). Num estudo de dose-resposta mais resolvido com células LAPC4, a CE

50 de TQ para inibir o crescimento de células verificou-se ser 8,2 uM (Fig 2C). Do mesmo modo, numa análise formando foco de crescimento celular de LNCaP, TQ foi encontrado para inibir a formação de focos, enquanto que a não afectar a formação de focos (Figura 2D). Para determinar se a inibição do crescimento celular por TQ foi, em parte devido aos efeitos sobre a viabilidade celular, a viabilidade celular DU145, LNCaP e LAPC4 foi medida por hemocitometria e de exclusão de azul de tripano. A viabilidade das células tratadas com 5, 10, e 25 uM TQ não diferem das células tratadas com veículo (Fig 2E). Além disso, uma análise de exclusão com iodeto de propidio baseada em citometria de fluxo de células LNCaP mostraram 92,4% de viabilidade (± 1,4%) em controlos tratados com veículo e 93,2% (± 1,2%) para células de LNCaP tratadas com TQ 25 uM. Para as células DU145, 94,7% (± 1,0%) viabilidade foi observado em controlos tratados com veículo e de 94,4% (± 1,3%) para 25 um células tratadas com TQ por exclusão de iodeto de propidio, apoiando ainda mais que TQ não afecta profundamente a viabilidade celular em doses até 25 um. células LNCaP tratados com 10 ou 25 TQ pM mostrou um aumento do número de células em fase G1, com uma redução concomitante de células em fase S (Figura 2F). Estes dados apoiam TQ que inibe a proliferação de células de cancro da próstata sensível ao androgénio através de uma paragem em G1 em doses que não diminuem a viabilidade destas células.

A-F. inibição da proliferação de células, mas não viabilidade TQ-mediada, em linhas celulares de cancro da próstata. (A) a análise do crescimento em células LAPC4 e LNCaP sensíveis-andrógenos e células de cancro da próstata DU145 independente de androgénios. (B) Dose-resposta de crescimento de células DU145, LAPC4 e LNCaP em células tratadas com TQ durante 4 d. (C) TQ CE

50 determinação para o crescimento celular LAPC4. (D) Determinação de focos de crescimento de LNCaP após o tratamento com 10 uM AT ou TQ 10 uM durante 5 d. (E) Análise de Viabilidade de células DU145, LNCaP e LAPC4 aos 5, 10, 25 e TQ ^ M durante 48 h com nenhuma diminuição na viabilidade celular. (F) análise do ciclo celular (isto é, teor de ADN) em células LNCaP tratadas com 10 e 25 uM TQ mostrando uma paragem em G1. *

P

. 0,05

TQ, não AT, o tratamento diminui a atividade Ar e Ar regulado mRNA níveis de transcrição

Estudos para determinar se TQ ou AT modulada atividade AR foram iniciados usando um sistema repórter luciferase sensível ao andrógeno. Para este estudo, a actividade repórter sensível ao androgénio foi estimulada usando o androgénio sintético R1881 e foi avaliado após tratamento com 30 uM ou CP AT (Figura 3A). tratamento TQ sozinho não modular a atividade repórter. Em contraste, foi encontrado TQ para inibir de forma significativa a activação induzida por R1881 repórter após dois d em comparação com células de controlo estimuladas com R1881. Surpreendentemente, 30 mM AT tratamento aumento da atividade repórter sensível ao androgênio (Fig 3A). Estes dados apoiam um papel para TQ inibidora sobre a actividade de AR em contraste com a AT, que não exibem actividade anti-androgénica.

A-D. A inibição de respostas androgénicos em células LNCaP de tratamento CP. (A) andrógeno-induzida [isto é, R1881 (R)] a expressão de luciferase a partir de um promotor sensível ao androgénio medido após TQ ou AT tratamento durante 48 h. Bicalutamida foi usado como um antagonista do receptor de androgénio. release (B) PSA foi estimulada por 50 a exposição pM R1881 em células LNCaP e mediu 4 d após TQ ou AT tratamento. células (C) PC3 co-transfectadas com um vector de expressão do receptor de androgénio e um repórter GFP-andrógeno responsivo estimuladas com R1881. As células tratadas com veículo (painel da esquerda) e 25 uM TQ (painel da direita), mostrando R1881-estimulada, as células expressando GFP (setas) (ver ensaio MARS em Materiais e Métodos). (D) A quantificação de células positivas para GFP por poço comparada com o controlo, tratados com veículo em amostras de uma dose-resposta de TQ de 5 a 50 uM. *

P

. 0,05

A liberação do antígeno específico da próstata (PSA; KLK3) a partir de células LNCaP é reconhecido como um indicador sensível da resposta androgênica em células LNCaP [17] . Para examinar melhor os efeitos da TQ em vias androgénicos, determinou-se a libertação estimulada-androgénio de PSA a partir de células LNCaP. células LNCaP tratadas com TQ mostraram uma redução dependente da dose na libertação de PSA-R1881 induzida em comparação com células de controlo não tratadas (Fig 3B). Em contraste, o tratamento com 10 a 40 ^ M NA não afectou PSA libertação induzida de androgénios a partir de células LNCaP (figura 3B). A expressão forçada do receptor de androgénio em células da próstata humano PC3 para avaliar a activação de um repórter fluorescência verde-andrógeno responsivo foi utilizado para medir a capacidade de TQ para inibir a activação do receptor de androgénio. De controlo, as células tratadas com o veículo mostraram grande activação do receptor de androgénio, após a estimulação com o androgénio sintético R1881 (Figura 3C [painel esquerdo] e Figura 3D), enquanto que as células tratadas com 5, 10, 25, ou 50 pM TQ mostraram uma redução significativa na androgénio a ativação do receptor por R1881 (Fig 3C [painel direito] e Fig 3D).

a redução na liberação de PSA pode ser devido em parte à diminuição da regulação da

PSA

expressão do gene produzido pela TQ ( Tabela 1). Além de

PSA

níveis de mRNA, outros genes responsivos aos andrógenos foram medidos após o tratamento TQ. Como mostrado na Tabela 1, os níveis de mRNA para os genes AR-responsive

calicreína 2

,

prostein

,

próstata fosfatase ácida

,

NKX3

.

1 | e

antígeno de membrana específico da próstata

foram reduzidas em células LNCaP 4 d após o tratamento com TQ. Em contraste com TQ, AT tratamento não alterou significativamente a expressão de mRNAs andrógeno-sensíveis (Tabela 1).

A regulação dos níveis de proteína AR em células de câncer de próstata andrógeno-sensível por TQ

para determinar os efeitos da AT e TQ em proteína AR em células responsivos aos andrógenos, foi realizada análise de immunoblot para a proteína AR. células LNCaP e LAPC4 foram tratados com controlo de veículo, TQ 25 pM, ou 25 pM AT durante 4 d (Fig 4A e 4B). Para ambas as linhas, as células tratadas com TQ mostraram uma redução substancial na proteína AR em comparação com os controlos tratados com veículo, enquanto que a não apresentaram diferença na detecção de AR, em comparação com os controlos (Fig 4A e 4B). Para entender melhor a dinâmica da AR down-regulação por TQ em células de câncer de próstata, foi determinada a localização celular AR, dose e tempo necessário para a TQ efeitos em células LAPC4 e LNCaP. Uma dose-resposta dos níveis de proteína AR 4, 12,5, 25 ou TQ uM em células LNCaP mostraram uma redução com 25 uM após 4 d (Figura 4C). Semelhante a células LNCaP, TQ níveis de proteína AR significativamente inibida em células tratadas com 25 LAPC4 TQ uM para 24, 48, 72, e 96 h (Fig 4D). coloração imunocitoquímica de AR nas células LNCaP mostraram localização nuclear significativa da AR (Figura 4E), enquanto que as células tratadas com 25 pM para TQ 4 d mostrou células intactas com uma redução significativa nos níveis de coloração da proteína AR (Figura 4F). Tomados em conjunto, estes resultados mostram que TQ, mas não AT, tem efeitos antiandrogenic potentes sobre linhas de células de câncer de próstata andrógeno-responsivo.

A-F. localização celular, dose-resposta, e tempo de curso de induzida TQ proteína AR infra-regulação em células de cancro da próstata expressando AR. Os níveis de proteína AR determinados por imunotransferência em LNCaP (A) e LAPC4 (B), as células tratadas com 25 pM ou 25 TQ ^ M AT de 4 d. (C) TQ redução dependente da dose nos níveis de proteína AR nas células LNCaP tratadas com 4, 12,5, 25 ou TQ ^ M durante 4 d. (D) de imunotransferência de alterações dependentes do tempo nos níveis de proteína AR a partir de células tratadas com 25 LAPC4 TQ uM para 24, 48, 72, e 96 h. Os níveis de proteína quantificada AR são apresentados abaixo de cada immunoblot (*

P Art 0,05). (EF), as células LNCaP foram tratados com veículo de controlo (E) ou 25 TQ? M (F) de 4 d e expressão da proteína AR foi detectada por imunocitoquímica.

Determinação da

AR

mRNA down-regulação por TQ e AT

Nós ainda avaliada TQ down-regulação da

AR

mRNA e demonstrar essa ação era distinta da AT.

AR

expressão de ARNm após o tratamento TQ para 24, foi determinada 48, 72, e 96 h em células LNCaP que mostra uma diminuição significativa na

AR

ARNm às 96 h (Fig 5A). Assim, os níveis de expressão de

AR

ARNm em células LAPC4 e mRNAs adicionais foram medidos após o tratamento com 25 uM ou CP AT durante 4 d.

AR

níveis de mRNA foram diminuiu 1,7 vezes após o tratamento com TQ 25 uM em células LAPC4 (Fig 5B). Note-se que as reduções nos níveis de proteína AR (Fig 4D) foram observadas para ocorrer antes da redução observada na

AR

ARNm. Além disso, apesar de uma significativa redução de

AR

ARNm foi observada em 4 d após tratamento TQ em ambas as células LNCaP e LAPC4, por comparação com a regulação negativa relativa de

AR

ARNm em 4 d , proteína AR foi mais significativamente inibida em amostras emparelhadas (dados não mostrados), sugerindo que TQ regulação negativa da expressão da proteína AR pode ser, pelo menos em parte, independente da inibição da transcrição de

AR

ARNm de expressão. TQ também diminuiu significativamente

FOXA1

níveis de expressão de mRNA (Fig 5C). É digno de nota que a AT não afetou

AR

ou

níveis FOXA1

níveis de mRNA após 4 d (Fig 5A, 5B e 5C). No entanto, o mRNA para baixo-regulação não foi uma ação ostensiva da TQ como

retinóide receptor X

,

alpha

(

RXRa

) níveis de mRNA não foram alteradas pela TQ em células LNCaP (Figura 5D). Embora AT tratamento não afetou os níveis de mRNA dos genes responsivos aos andrógenos avaliados, AT produziu uma redução de 20% nos níveis de

RXRa

mRNA (Fig 5D), proporcionando mais apoio para efeitos diferenciais da AT e TQ na próstata células cancerosas.

anúncio. Expressão de ARNm do factor de transcrição em células LNCaP e LAPC4-tratados TQ. análise de percurso (A) Tempo de níveis de mRNA AR em TQ trataram células LNCaP em comparação com os níveis de mRNA AR no controle, tratados com veículo células LNCaP. níveis (B) mRNA em células LAPC4 tratados durante 4 d TQ com 25 pM ou 25 pM EM em comparação com o controlo, as células tratadas com o veículo. Níveis de

FOXA

1 mRNA (C) e

RXR

α mRNA (D) em células LNCaP tratados durante 4 d com TQ 25 mM ou 25 mM AT relação aos controles. *

P

. 0,05

proteína AR down-regulação por TQ foi revogada por antioxidantes

Foram utilizados os antioxidantes N-acetilcisteína (NAC) e AT para determinar se um potencial mecanismo de regulação negativa da expressão da proteína de AR TQ é afectado pelo tratamento antioxidante. As células LNCaP foram pré-tratados com 5 mM de NAC ou 25 uM AT durante 24 h e, subsequentemente, tratado com 25 uM TQ com ou sem pelo (Figura 6A) e NAC (figura 6B), durante 48 h. A TQ mediada por regulação negativa da proteína AR foi encontrado para ser significativamente atenuada pela presença de antioxidantes, de suporte que TQ pode regular negativamente a proteína AR através de vias que são sensíveis à acção destes antioxidantes.

AB . A inibição da proteína AR sub-regulação de TQ-mediada pelos antioxidantes AT e NAC em células LNCaP. (A) Análise de imunotransferência da expressão da proteína AR em células pré-tratadas durante 24 h com 25 ^ M NA e depois tratou-se com 25 TQ uM na presença ou na ausência de 25 uM AT por um adicional de 48 h. (B) A análise de imunotransferência dos níveis de proteína AR nas células pré-tratadas durante 24 h com NAC 5 mM e, em seguida, tratada com 25 TQ uM na presença ou na ausência de NAC 5 mM durante 48 h. (*

P Art 0,05 comparado ao grupo controle; #

P Art 0,05 em comparação com os níveis de proteína AR tratados com TQ)

Discussão

.

As ações biológicas do AT têm sido investigados extensivamente. Em contraste, muito menos se sabe sobre produto da oxidação da AT, TQ. Aqui, a infra-regulação da actividade androgénica por TQ foi investigada com a descoberta de que esta actividade era dependente da actividade de TQ como um pro-oxidante. AT não afectar significativamente quer o crescimento de células de cancro da próstata ou vias conhecidas para ser crítica na progressão do cancro da próstata em comparação com TQ. Este estudo começa a identificar a actividade anti-androgénica romance de TQ e demonstra a actividade diferencial de TA e TQ em células de cancro da próstata humanos. TQ inibiu significativamente a proliferação de andrógeno responsivo cancro da próstata células, atividade AR, e expressão da proteína AR. TQ foi encontrado para regular negativamente a expressão da proteína de AR em ambos tempo e de um modo dependente da dose por meio de um mecanismo que envolve alterações na redox celular. Demonstramos ainda que TQ down-regulação da proteína AR foi atenuada pelos antioxidantes NAC e AT. A capacidade desses antioxidantes distintas de revogar as ações de TQ em proteína AR em células de câncer de próstata é o foco de estudos futuros. Em geral, uma acção inovador para TQ foi encontrada na regulação negativa da actividade androgénica em células de cancro da próstata humanos.

Neste estudo, nem o crescimento de células de cancro de próstata nem as vias conhecidas para ser crítica no cancro da próstata progressão que foram comparados foram afectados por EM, ao passo que TQ potentemente inibiu o crescimento de células de cancro da próstata sensível a-andrógenos. A diminuição no crescimento celular produzida por tratamento TQ pode ser AR-dependentes como o tratamento TQ não têm um efeito pronunciado sobre o crescimento da linha celular de cancro da próstata humano DU145 independente de androgénios. Importante, TQ, mas não foi encontrada para reduzir tanto

AR

níveis de proteína de mRNA e AR em células de câncer de próstata com uma concomitante redução nas vias androgênicos. Vários estudos têm demonstrado que a regulação negativa dos resultados AR na proliferação celular diminuiu em células de cancro da próstata sensível a-andrógenos. Por exemplo, a diminuição da expressão de AR foi conseguida em células de cancro da próstata humano LNCaP utilizando siRNA resultando em uma diminuição no crescimento de LNCaP [18,19]. Assim, a diminuição do crescimento celular produzido pela TQ em linhas celulares de cancro da próstata sensível de androgénios pode ser devido, pelo menos em parte, à acção de TQ para regular negativamente a expressão do AR.

A AR é um tecido-específicos , factor de transcrição activado por ligando que é conhecido por regular a expressão de genes tais como

transmembrana 4 L de seis membro da família 1 |,

PSA

,

calicreína 2

,

prostein

,

próstata fosfatase ácida

,

NKX3

.

1 | e

específico da próstata antígeno de membrana

em células da próstata [20-24 ]. Porque o AR desempenha um papel fundamental na manutenção da expressão destes genes, a sua expressão seria reduzido em intervenções que regular negativamente a AR. De facto, a expressão de vários destes genes foi reduzido após o tratamento de células LNCaP com TQ. Além disso, a expressão de um repórter sensível ao andrógeno foi inibida por andrógeno concorrente e tratamento TQ. Em contraste, no teve efeitos mínimos sobre a modulação de genes responsivos aos andrógenos ou produtos de genes. A redução da expressão de genes AR-responsivos induzidas pelo tratamento TQ apoia fortemente que a AR é um dos principais alvos da TQ em células de câncer de próstata.

A AR é reconhecido como um dos principais contribuintes para todos os estágios do câncer de próstata carcinogênese a doença resistente à castração [7,12,25,26]. Até à data, a maioria das intervenções contra o cancro da próstata reduzir a activação de AR através da inibição da produção de ligandos de androgénicos, tais como testosterona ou di-hidrotestosterona. Estas estratégias não afectar a própria AR. Para modular a actividade de AR, é necessário identificar as intervenções que se destinam a infra-regulação da expressão de AR. Aqui, mostra-se que a sub-regulação de ARNm de proteína de AR e pode ser conseguida utilizando TQ com um impacto pronunciado na actividade androgénica em células de cancro da próstata. É digno de nota que a AT não inibiu qualquer expressão AR ou atividade em células de câncer de próstata. Isto é importante já que esta é a forma de pelo que se espera que seja fisiologicamente activa em contraste com éster formas conjugadas, tais como a vitamina E succinato, que são supostamente convertidos para o a-tocoferol pela acção de esterases em células e no corpo.

Embora AT não apresentam propriedades anti-androgénicas dentro do nosso sistema, vitamina E (VE) análogos têm sido relatados para afectar a expressão da proteína AR nas células cancerosas da próstata. Por exemplo, Zhang et al. [16] relatou que o analógico VE, VE succinato, reduz a atividade de AR em células cancerosas humanas da próstata andrógeno-sensíveis. Semelhante a TQ, VE tratamento succinato foi encontrada para diminuir tanto de ARNm de AR e os níveis de proteína em células LNCaP [16]. De importância, Zhang et al. [16] verificaram que pelo menos parte da acção de succinato VE é devido a uma diminuição na tradução AR. O nosso laboratório tem relatado anteriormente na actividade anti-androgénica de outro VE analógico, 2,2,5,7,8-pentametil-6-chromonol (PMCol) [14]. Esta porção antioxidante de AT, PMCol, consiste em a estrutura do anel chromonal da AT mas carece da cadeia fitilo. Nós demonstramos que PMCol inibiu a proliferação de células de cancro da próstata sensível a-andrógeno que age como um inibidor competitivo da ligação do ligando de AR e que PMCol inibe a activação de AR [14]. No entanto, PMCol não inibiu a expressão do AR. Portanto, as limitações de VE análogos podem incluir a falta de conversão metabólica para AT e, consequentemente, TQ, ou a ausência de proteína AR sub-regulação.

Identificar o mecanismo de actividade anti-androgênica do TQ e inibição selectiva de AR a expressão da proteína pode fornecer informações sobre novos mecanismos de regulação AR. Porque TQ havia pronunciado efeito inibitório sobre marcadores de atividade AR, foi analisada a AR em linhas de células de câncer de próstata andrógeno-sensíveis. Tanto a proteína AR e ARNm foram encontrados para ser reduzida por tratamento TQ tanto em LAPC4 e células de cancro da próstata humano LNCaP. No entanto, houve uma redução significativa da expressão da proteína AR que precedeu a inibição da expressão de ARNm de AR, o que demonstra que as acções da TQ em Ar sub-regulação não pode ser inteiramente devido à inibição da expressão de ARNm de AR. Curiosamente,

FOXA1

mRNA também foi reduzida por tratamento TQ. FOXA1 é reconhecido como um membro potente de actividade androgénica para os genes da próstata [27]. No entanto, a regulação negativa da expressão de ARNm não era evidente uma acção de actividade TQ. Por exemplo,

RXRa

expressão de mRNA não foi encontrado para ser afetado pelo tratamento TQ.

As acções da AT como uma medida para aliviar o câncer de próstata são controversos. Devido a discrepâncias entre os estudos epidemiológicos sobre AT atividade para câncer de próstata, explicações alternativas para os resultados destes estudos devem ser exploradas. Por exemplo, o tabagismo foi uma grande discrepância entre os participantes do estudo alfa-tocoferol, Beta-caroteno Cancer Prevention (ATBC) [28], que envolveu fumantes pesados, ea Prevenção do Câncer de teste de selênio e vitamina E (SELECIONAR) [29] , que envolveu principalmente não-fumantes. Este é intrigante quando se considera as acções de prevenção de câncer de próstata de suplementar na quando tomado por homens que fumam como visto entre os dois estudos. Por exemplo, no estudo ATBC, foi observada uma redução de 32% na incidência de câncer de próstata e redução de 41% na mortalidade entre os fumantes a tomar suplemento de AT em comparação com grupos de controlo [30]. No estudo Profissionais Harvard Saúde, nenhum efeito da suplementação AT só foi encontrado na incidência de câncer de próstata; no entanto, foi relatado que, “entre os fumantes e ex-fumantes recentes, aqueles que consumiram pelo menos 100 UI de complementar AT por dia tinham um risco relativo de 0,44 para metastático ou câncer de próstata fatal” [31]. Estudos adicionais não encontraram nenhum efeito da suplementação AT quando tomados sozinhos, mas fez relatório uma redução no desenvolvimento de cancros da próstata entre os fumantes que tomam suplementos de VE [28,32,33]. Em contraste com estes relatórios, um estudo recente constatou que a AT em si pode ter actividade contra o desenvolvimento de cancro da próstata avançado [34]. Estes encontrando conflito com os resultados do SELECT, que não conseguiu encontrar câncer de próstata ações preventivas de suplementar em [29,35]. Assim, vários estudos até à data sugerem que a AT em si pode não ser uma intervenção eficaz contra o câncer de próstata. Apoio destes resultados, os resultados do estudo atual não encontrou efeitos significativos sobre as células cancerosas da próstata por AT. No entanto, verificou-se que TQ, o principal produto de oxidação de NO, é altamente eficaz em reduzir tanto o crescimento e actividade androgénica em linhas celulares de cancro da próstata. É intrigante a considerar que TQ pode ser o derivado activo da AT envolvidos na prevenção do câncer de próstata entre os fumantes pesados ​​a tomar suplemento de VE, que em possuir um estresse oxidativo fisiológico pode efetivamente transformar a AT para TQ. Os resultados do estudo apoiam fortemente novas investigações para determinar a eficácia da TQ como uma modalidade para a prevenção do câncer de próstata.

A detecção elevada de níveis TQ após a suplementação AT e aumento do estresse oxidativo tem sido demonstrado em modelos animais. Por exemplo, Wurzel, H et al. [36] realizaram um

in vivo

estudo que expuseram ratos à fumaça de cigarro crônico e AT durante 65 semanas. No grupo experimental, eles encontraram níveis elevados de TQ no lavado broncoalveolar demonstram que os animais expostos à fumaça gerada uma quantidade maior de produtos oxidativos [36]. A detecção de TQ em seres humanos tem sido relatada em um estudo comparativo de pacientes adultos rotineiramente pulmonares recebem oxigenoterapia [37]. A conversão de AT em TQ sob agressão oxidativa poderia ser uma possível explicação para a discrepância observada entre os estudos de prevenção mencionadas anteriormente.

Os relatórios sobre os efeitos biológicos da TQ são limitadas. Isto pode ser devido em parte à TQ ser considerado simplesmente como o produto de oxidação a com actividade biológica inerente limitado. No entanto, TQ é quimicamente distinto do NO e, portanto, podem ter acções biológicas únicas em comparação com a AT. As ações biológicas distintas de TQ e AT são fortemente apoiados pelos resultados na AR selectivo down-regulação por TQ observada no estudo atual. Uma acção fisiológica associada com TQ é actividade anticoagulante [38]. Isto não é surpreendente na medida em que a estrutura da cadeia de quinona e fitilo de TQ é reminiscente à da vitamina K, uma vitamina essencial envolvida na coagulação do sangue. De um modo geral, produtos químicos que possuem estruturas de quinona são considerados tóxicos. Isto é principalmente devido à presença de centros electrofílicos de carbono presentes na estrutura de quinona que pode ser actuado por nucleófilos presentes na constituintes celulares [3]. No estudo actual, TQ não foi encontrado para ser altamente citotóxico. Curiosamente, todos os sítios electrofílicos em TQ são bloqueados por substituições de metilo e, portanto, seria esperado TQ a ser menos reactivos do que os produtos químicos com estruturas de quinona desbloqueados. Além disso, TQ foi encontrado para ser um substrato potente para a enzima NQO1 biotransformação [39]. foi encontrada a redução de TQ à hidroquinona por NQO1 ser tão eficiente, foi sugerido que TQ pode ser um dos substratos principais para a actividade biológica de NQO1 [39]. Os resultados do estudo atual e outros apoiam fortemente que TQ tem ações biológicas potentes que são distintas da AT. É importante ressaltar que a expressão da proteína AR infra-regulação da TQ em células cancerosas humanas da próstata é mediada por alterações no estresse oxidativo celular que podem ser revogados por antioxidantes.

Materiais e Métodos

Chemicals, cultura de células, e