Sumário

Alterações de Ef tirosina-quinases receptoras são eventos frequentes em cancros humanos. As variações genéticas de EPHB6 ter sido descrito, mas o resultado funcional destas alterações é desconhecido. O presente estudo foi conduzido para o rastreio de ocorrência e para identificar consequências funcionais de mutações EPHB6 no cancro do pulmão de células não-pequenas. Aqui, nós sequenciado toda a região codificante de EPHB6 em 80 doentes com cancro do pulmão de células não-pequenas e 3 linhas de células tumorais. Três mutações potencialmente relevantes foram identificados em amostras de doentes com NSCLC primária de pacientes (3,8%). Duas mutações pontuais conduziram a proteínas instáveis. Um quadro em mutação de deleção (del915-917) mostrou a migração melhorada e acelerada cicatrização de feridas

in vitro

. Além disso, a mutação del915-917 aumentou a capacidade metastática de células NSCLC em um

in vivo

modelo do rato. Nossos resultados sugerem que as mutações EPHB6 promover metástases em um subgrupo de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas

Citation:. Massa E, Yu J, Hascher A, Koschmieder S, Wiewrodt R, Krug L, et al. (2012) Mutações do EPHB6 receptor da tirosina quinase induzir um Pro-metastático Fenótipo em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10.1371 /journal.pone.0044591

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 08 de maio de 2012; Aceito: 03 de agosto de 2012; Publicação: 04 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Granel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Investigação NSCLC em nosso laboratório é financiado pelo Deutsche Krebshilfe eo Wilhelm-Sander Stiftung. COMO. foi financiado pelo DFG Schw 407 /9-3. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada com cancro, com a maioria dos casos pertencem ao grupo de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [1], [2]. Desenvolvimento de metástases à distância é a principal causa de morte relacionada com NSCLC. As tirosina quinases receptoras (RTKs) desempenham papéis importantes no processo metastático [3], [4]. Uma das RTK melhor conhecida associada com um fenótipo de metástases, é o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), com a sua membros da família ERBB2 /Her2, ErbB3 e ErbB4. As RTKs, tais como a família de EGFR são, portanto, alvos atraentes para a melhoria das abordagens de terapia em cancros moleculares [3], [5]. Até à data, a subfamília do receptor (EF) é a Efrina maior subfamília de RTK compreendem de 16 membros nos vertebrados, a saber EPHA receptores 1-10 (EPHA1-A10) e EphB receptores 1-6 (EPHB1-B6) [6], [ ,,,0],7]. Os receptores EphB interagir com a família de ligandos Efrina. Após a interacção com os seus ligandos efrina, receptores Eph modular uma variedade de actividades biológicas, incluindo a interacção célula-célula e célula migração [8], [9]. Perda da EPHB6 cinase morta é associada com estágios avançados de tumor e progressão do cancro [10] – [16]. Várias publicações relatam sobre a expressão alta EPHB6 ser um marcador de prognóstico favorável no neuroblastoma [10] – [12]. Além disso, a expressão de ARNm de EPHB6 foi diminuída em pacientes com melanoma metastático e em linhas celulares de cancro da mama invasivo com potencial metastático [14] – [16]. Funcionalmente, EPHB6 suprime invasão, taxa de crescimento e eficiência de formação de colónias de células de câncer de mama em cultura [17] – [18]., Regula a adesão celular e afeta a migração [19]

Anteriormente, foram identificados vários RTKs humanos cujas nível de expressão correlacionada com o desenvolvimento de metástases em fase inicial NSCLC [20]. Considerando a alta expressão de mRNA de diversos RTKs foi associado com um aumento na frequência de metástase, os níveis das duas RTKs EPHB6 e DKFZ1 expressão alta mRNA indicaram uma redução do risco de metástase [20]. Recentemente, foi identificada como um supressor de EPHB6 metástase epigeneticamente silenciados em NSCLC, e a expressão de EPHB6 impediu a formação de metástases em um modelo de xenoenxerto de metástase [21].

Aqui, um controlo da variação EPHB6 por sequenciação de ADN, e caracteriza-se o consequências funcionais de mutações EPHB6

in vivo

e

in vitro

no que diz respeito ao seu papel potencial no NSCLC metástase.

a) domínios funcionais do gene EPHB6 são mostrados em relação aos seus exões e a mutações identificadas para EPHB6. A descrição das mutações correspondem à sua localização na sequência de proteína. O R52C mutações, Q498H, e DPG915-917del foram identificados em amostras de doentes com NSCLC em estudo. B) eletroferograma da sequência EPHB6-tipo selvagem e o mutante de eliminação para EPHB6. C) Os níveis de expressão de EPHB6-mutantes em células transfectadas. células transfectadas a granel foram GFP ordenados e expandiu-se em meio de selecção. Os níveis de expressão são apresentados para culturas a granel com 90% de expressão da GFP. Diferenças de análise de expressão entre os níveis de proteína e níveis de mRNA são mostrados. Para quantitativa PCR em tempo real a média eo desvio padrão de três experiências independentes são mostrados. O western blot mostra um exemplo representativo.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas de células NSCLC envolvidas no estudo foram previamente descritos [21]. Resumidamente, células de adenocarcinoma do pulmão A549 foram cultivadas a 37 ° C, humidade elevada e 5% de CO

2 em DMEM (Dulbecco meio de Eagle modificado, da Invitrogen, Carlsbad, CA). O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de estreptomicina e penicilina. HTB56 e HTB58 células de adenocarcinoma de pulmão foram cultivadas a 37 ° C, humidade elevada, e 5% de CO

2 em MEM (meio de Eagle modificado, da Invitrogen, Carlsbad. CA). O meio foi suplementado com 10% de FCS, 1% de estreptomicina e penicilina, 1% de glutamina, 1% de piruvato de sódio, e 1% de aminoácidos não essenciais acid.Cell identidade foi confirmada por linha STR-genotipagem.

paciente espécimes

espécimes tumor primário e tecidos pulmonares livres de tumor foram obtidos no momento da cirurgia inicial de 80 pacientes com NSCLC comprovada em histologia em um hospital universitário na Alemanha. As amostras foram imediatamente congeladas e armazenadas choque em azoto líquido. As amostras tumorais foram verificadas para a percentagem de células tumorais por histologia, e apenas biópsias tumorais com as células cancerosas de pelo menos 70% foram utilizados para análises subsequentes. Da mesma forma, amostras de controlo livre de câncer, também foram confirmados por exame histológico. Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Münster.

A) A expressão proteica de linhas de células A549 transfectadas estavelmente expressando tipo EPHB6 selvagem ou o mutante EPHB6 eliminação. As células foram co-transfectados utilizando um -pcDNA3.1 EGFP

+ vectores de identificação de clones seleccionados. Vários clones foram reunidas e ainda seleccionados como culturas a granel. B) Os ensaios de migração Transwell foram realizados com células de controlo de vector vazio, mutante EPHB6 e células EPHB6 tipo selvagem. Cinco experiências diferentes em triplicata foram analisados. *: Significativa (p 0,05) diferenças por (SEJA ANOVA ou t-test) O p-valor fornecido entre as três linhas celulares diferentes foram analisados ​​estatisticamente de todas as células migradas usando a ANOVA-teste OneWay. A análise dos resultados do teste t de pares, em um valor p significativo para as células de controlo versus células EPHB6-peso (p 0,015) e entre as células EPHB6-wt e as células EPHB6-mut (p 0,005) . C)

In vitro

ensaio de zero a cicatrização de feridas. As células foram arranhado por uma ponta de pipeta 10 ul. As áreas de raspadinhas foram registrados durante um periode de 17 horas. São mostrados os meios de três experiências diferentes, calculadas como percentagem de um ponto inicial para todas as três linhas de células. A ANOVA-teste (p 0,002) indicou diferenças estatisticamente significativas entre as três linhas celulares. D) Imagens representativas dos ensaios scratch no início e no final dos experimentos.

A) Número de metástases pulmonares em NOD avaliável /SCID quatro semanas após o transplante, cada um com 3 × 10

5 células A549 transfectadas estavelmente expressando EPHB6-wT células (n = 9), EPHB6-del915-917 (n = 9) ou de controlo do vector vazio (n = 2). Os pontos representam ratinhos individuais e linhas horizontais o valor médio de metástases. B) As imagens de pulmões inteiros representativos de camundongos NOD /SCID, transplantados com células A549 que expressam EPHB6-peso, EPHB6-del915-917, ou controle do vetor vazio. As metástases pulmonares são marcados por setas negras. C) Imagens de secções de pulmão de camundongos NOD /SCID, corados com hematoxilina. Metástases são marcadas por setas pretas. Três exemplos representativos são mostrados para cada ratos transplantados com células A549 expressar EPHB6-wt ou EPHB6-del915-917.

A) atividade proliferativa do controle do vetor vazio, tipo selvagem EPHB6 e células mutantes foram analisados ​​usando um ensaio de MTT colorimétrico após 72 horas. Os dados são apresentados como médias +/- desvio padrão de três experiências independentes. Diferenças estatisticamente não foram significativas (ANOVA). B) Tamanho da célula de células individuais (n = 20) que cresce em pratos de plástico foi analisado por microscopia de vídeo ao vivo e gravados. células mutantes EPHB6 mostrou um tamanho de célula significativamente reduzida em comparação com EPHB6 tipo selvagem e com células de controlo (p 0,05, teste t).

EPHB6 Sequenciação

O ADN genómico foi extraído usando DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os iniciadores foram concebidos com o software Primer3 (distribuidor) para amplificar em cadeia da polimerase (PCR) de fragmentos de tamanho entre 400 e 800 pb e que cobre a região de codificação completa do gene EPHB6 (detalhes da PCR são fornecidos em material suplementar). Todos Todos os fragmentos foram amplificados por PCR com Taq DNA polimerase (volume total de reacção 20 ul), suplementado com um intensificador de PCR caseira, como descrito [22]. Ambas as cadeias foram sequenciadas utilizando os iniciadores de PCR. iniciadores internos adicionais foram utilizados para produtos de PCR mais do que 600 pb, para garantir uma informação de sequência de cadeia dupla para a totalidade do fragmento de PCR. A sequenciação foi efectuada em sequenciadores de ADN automatizados ABI3730xl com o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.1 (Applied Biosystems). A região de codificação sequenciado de

EPHB6

foi comparada com a sequência de referência (GenBank No. NM_004445).

dirigida ao local Mutagênese

A região codificadora do cDNA EPHB6 humana (833-3853 base de Acesso NCBI NM_004445) foi clonado no pcDNA4 Para /myc /HisA vector de expressão (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As mutações na sequência de codificação de EPHB6 foram introduzidos com o kit de mutagénese dirigida ao local QuickChange XL (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) utilizando iniciadores com as sequências: para a frente (5′-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), reverso (5′-CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) e usando vector pcDNA4-EPHB6 como modelo. Posteriormente, a sequência correcta foi verificada por sequenciação. Primers para mais mutações será fornecido mediante solicitação.

construções de expressão e transfecção

células A549 humanas foram co-transfectadas utilizando o reagente de transfecção Nanofectin (PAA, Áustria), de acordo com o protocolo do fabricante. A co-transfecção foi levada a cabo quer com pcDNA4 (controlo de vector vazio), de tipo selvagem construção de expressão EPHB6 (pcDNA4-EPHB6-wt) ou mutante EPHB6 expressão constrói, cada um com uma construção de vector que expressa EGFP (pcDNA3.1-GFP, expressando verde melhorada EGFP proteína fluorescente) para a selecção e a identificação de células transfectadas. As células transfectadas foram seleccionadas com 700? g /ml de G418 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e 400 ug /ml de zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). culturas a granel foram separadas por FACS para GFP-expressão e expandida. Em adição a culturas a granel, que também reunidas GFP alta múltiplos clones que expressam a obter níveis de expressão suficientes. A expressão foi verificada por transferência de Western e em tempo real de RT-PCR.

Isolamento de ARN e transcrição reversa

O ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A quantidade total de 1 ug de ARN de cada amostra foi transcritos de modo inverso, utilizando iniciadores aleatórios e transcriptase inversa de MMLV de acordo com o protocolo do fabricante (Promega, Madison, Wisconsin, EUA).

A análise do gene de expressão por Quantitative real- tempo de RT-PCR

Para quantitativo em tempo real de RT-PCR, o ADNc foi amplificado num 7700 detector de sequências ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). EPHB6 foi detectada com os seguintes iniciadores e sonda: para a frente (5′-TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), reverso (5′-GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) e sonda (5′-lias CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT-TAMRA). As quantidades relativas de expressão do gene foram calculados usando a expressão de GAPDH como um padrão interno

Western Blot Análise

As proteínas foram detectadas utilizando os seguintes anticorpos:. EPHB6 anti-humana (1 mg /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Taiwan ou ABGENT, San Diego, CA, EUA) e β-actina (40 ng /ml, Sigma, EUA) como anticorpo primário, de cabra anti-ratinho e de cabra anti-coelho (ambos a partir de Dianova, Hamburgo, Alemanha) como anticorpos secundários. A análise por Western blot foi realizada tal como descrito [23]. O

Veja Azul Plus2

marcador de proteína (Invitrogen) foi usado como um indicador de tamanho.

Boyden Câmara Ensaio

Um total de 5 × 10

5 células A549 ( em 100 ul de DMEM com FCS a 5%) foram semeadas na parte superior de uma câmara de TRANSWELL® (Transwell inserções de filtro em 6,5 mm de diâmetro com um tamanho de poro de 5 um, Corning Inc., Corning, NY, EUA), que foi pré-revestido de 30 min com 50 ug de fibronectina. Na parte inferior da câmara 600 ul de meio DMEM com FCS a 20% (um gradiente de soro foi utilizada como quimioatractor) foi adicionado e o ensaio foi realizado durante 16 horas a 37 ° C e 5% de CO

2 antes que as células migradas foram analisadas por citometria de fluxo. Todos os ensaios foram repetidos quatro vezes e de forma independente realizada em triplicado

in vitro a cicatrização de feridas -. Arranhões Ensaio

As células A549 foram semeadas num frasco de cultura de tecidos de 25 ml a uma densidade de 350.000 células por balão e foram cultivadas durante um período de três dias. monocamadas de células confluentes foram então riscado usando uma ponta de 10 L-pipeta. O meio foi trocado ea cicatrização de feridas foi registada por microscopia de vídeo ao vivo. As imagens foram capturadas em 10 × intervalos mínimo durante 17 h utilizando um microscópio Zeiss (luz) Axiovert 40C, ligado a uma câmera de vídeo CCD (Hamamatsu). aquisição de imagem era controlada por Hipic 32 (High Performance Image Control System) ou WASABI (Hamamatsu Software Imaging). A análise da cicatrização de feridas foi realizada utilizando o ImageJ programa de processamento de imagem baseado em Java. Os ensaios foram realizados de forma independente por três vezes.

Análise do

células A549 que expressam tipo EPHB6-selvagem, o EPHB6-mutante ou baixa EPHB6 (controle /vector vazio transduzidas) Tamanho da célula

foram semeadas em frascos de cultura de células que foram pré-revestidas com uma matriz de colagénio. As células foram deixadas a aderir durante cinco horas e, em seguida, monitorizada utilizando um microscópio Zeiss (luz) Axiovert 40 ° C, ligado a uma câmara de vídeo CCD (Hamamatsu). aquisição de imagem era controlada por Hipic 32 (High Performance Image Control System) ou WASABI (Hamamatsu Software Imaging). A análise do tamanho de célula de células isoladas foi realizada como descrito anteriormente [24], usando o software de visualização Amira e o programa de processamento de imagem baseado em Java ImageJ. O software analisa os parâmetros de funções celulares a partir de células individuais, incluindo a determinação da área de célula (em mm

2).

Experimentos metástase em vivo

Para todas as experiências com ratos, foi utilizado 8 a 10 semanas de idade NOD.CB17-Prkdc SCID /J (/SCID NOD) ratos obtidos de Charles River. Para analisar o desenvolvimento de metástases após injecção intravenosa de células de tumor, os ratinhos NOD /SCID 22 foram irradiados com uma dose única de 3,5 Gy a partir de uma unidade de um dia de cobalto-60 antes do transplante. Um total de 3 × 10

5 células transfectadas de forma estável (dissolvido em 200 ul de PBS) foram injectadas por via intravenosa na veia da cauda. Quatro semanas após o transplante, os ratinhos foram sacrificados e foi analisado o desenvolvimento de metástases do pulmão. Em dois casos, os ratos morreram dentro de uma semana após o transplante: um ratinho transplantado com EPHB6-wt expressando células A549 e um rato transplantados com células A549 EPHB6-mutante expressam. desenvolvimento das metástases foi avaliada através da contagem de nódulos metastáticos individuais. Para as análises histológicas, os pulmões foram fixados em paraformaldeído a 4%. Em todas as experiências, os grupos de tratamento foram randomizados para evitar efeitos gaiola.

Análise estatística

Todos os dados experimentais estão apresentados como média mais o desvio padrão, se não indicado de outro modo. Os valores médios de três grupos foram comparados por ANOVA OneWay de dados em bruto ou no caso de dois grupos pelo teste t de Student. A p frente e verso. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

EPHB6 Variantes em NSCLC

Todos os exons de toda a região codificante de EPHB6 foram sequenciados por sequenciamento Sanger com base em uma coorte de pacientes com NSCLC. Entre os 80 pacientes com NSCLC, três (3,8%) dos casos foram encontrados a ter mutações não sinónimas de EPHB6 (R52C, n = 1; Q498H, n = 1; e DPG915-917del, n = 1). Nenhuma mutação EPHB6 foram identificados em linhas de células A549, HTB56 ou HTB58. Uma análise bioinformática pelo SIFT e Polyphen indicou a R52C mutações pontuais e Q498H como provavelmente danificar (Tabela 1). Uma busca de banco de dados recentes esforços de sequenciação em grande escala revelou mutações adicionais que até agora não foram ainda mais investigados (Fig. 1A).

EPHB6 mutações foram identificadas em vários exões e domínios funcionais do gene. Curiosamente, o del915-917 eliminação (Fig. 1B) foi localizado ao lado duas mutações (D915G e G914V) recentemente identificadas em pacientes com câncer colorretal [25], [26]. O conjunto de mutações nesta região entre o domínio catalítico da tirosina-quinase (Tyrkc) e motivo alfa estéril (SAM) sugere ainda relevância funcional. Esta mutação foi identificada num paciente com adenocarcinoma de pulmão. A mutação era heterozigótica e também foi detectado em tecido pulmonar normal, indicando uma mutação de linha germinal correspondente. As outras mutações foram apenas detectadas no tumor e não no tecido saudável combinado inficating uma mutação somática.

Para os ensaios funcionais, EPHB6-tipo selvagem e vários mutantes (R52C, Q498H, del915-917 ea mutação P728S descrito anteriormente em cancro do ovário [l]) foram estavelmente cotransfectadas com um plasmídeos que expressam EGFP para a linha de células A549 NSCLC que expressa níveis muito baixos de EPHB6. Os clones positivos foram escolhidos para EGFP e análise da expressão foi realizada por Western blotting usando o anticorpo EPHB6 em clones individuais e em culturas a granel (Fig. 2a). Apesar de transfecção bem sucedida com o aumento dos níveis de ARNm, expressão de proteínas de a maior parte dos mutantes EPHB6 não aumentou para além dos níveis observados em células transfectadas vector vazio (Fig. 1C). Apenas para a mutação del915-917, a expressão da proteína em níveis semelhantes aos de tipo selvagem foi obtido EPHB6 (Fig. 2A). Devido à insuficiência de expressão da proteína adequada dos R52C e G498H mutantes eo mutante P728S descrito anteriormente, nós funcionalmente centrada na mutação del915-917 em NSCLC em experiências posteriores.

Efeitos de EPHB6 Mutações sobre migração e metástase de células NSCLC

Conforme relatado, EPHB6 wildtype inibiu a migração de células A549 transfectadas de forma estável numa câmara de Transwell (câmara de Boyden) ensaio. Em contraste, as células transfectadas com o mutante EPHB6 del915-917 migrou significativamente mais rápido neste ensaio (Fig. 2B). Além disso, foram realizados ensaios de risco com microscopia de vídeo repetida a seguir ao encerramento do zero ao longo do tempo. Tipo selvagem EPHB6 inibida

In vitro

cicatrização de feridas em comparação com o vector vazio, ao passo que as células mutantes EPHB6 fechado a abertura muito mais rapidamente que o tipo selvagem (três experiências independentes, p 0,002, ANOVA, p 0,0004, teste t ) (Fig. 2C e D). Verificou-se que o mutante EPHB6 não apenas inibir a actividade de tipo selvagem EPHB6, mas acelerou o fechamento da ferida em comparação com o vector vazio e de tipo selvagem. Após oito horas de adesão, a área aberta das células mutantes EPHB6 começa a diminuir duas vezes (3%) mais rapidamente, uma vez que poderia ser reconhecido por células de tipo selvagem EPHB6 (1,6%). Mesmo as células de controle apresentaram menor aceleração do fechamento da ferida (2%), neste ponto do tempo.

Para analisar o

in vivo

efeitos das mutações EPHB6 sobre a capacidade metastática de células NSCLC, realizamos

in vivo

ensaios de metástase. ratinhos NOD /SCID foram injectados por via intravenosa com células EPHB6-WT (n = 10), células EPHB6-del915-917 (n = 10) e células de controlo de vector vazio (n = 2). Quatro semanas após a transplantação ratinhos foram sacrificados e analisados. Um ratinho de cada grupo de ratinhos transplantados com células que expressam EPHB6-wt e EPHB6-mut morreu no prazo de uma semana após o transplante. Os ratinhos injectados com células que sobre-expressam EPHB6 tipo selvagem mostrou menor número de metástases nos pulmões, em comparação com ratinhos injectados com células de controlo de vector vazio ou células EPHB6-mutante (Fig. 3): um murganho foi encontrado sem metástases, 2 ratinhos com cada uma ou três metástase e um rato com cada 4, 5 ou 8 metástases. Um ratinho transplantado com células de tipo selvagem EPHB6 foi encontrada com um elevado número de metástases pulmonares. Curiosamente, em todos os ratinhos injectados com células de metástases do pulmão EPHB6 mutantes eram detectáveis ​​(figura 3;. P = 0,011, teste t de dados a partir de ratinhos transplantados com EPHB6-peso em relação a células EPHB6-mut). Um

In vitro

ensaio de proliferação após 72 horas (Fig. 4a) mostrou que as células mutantes EPHB6 não diferiu do de tipo selvagem EPHB6 expressando células em termos de actividade proliferativa. Foram obtidos resultados semelhantes em ensaios de proliferação analisadas após 48 horas (dados não mostrados). As experiências em vez sugerido que o aumento da actividade metastática

In vivo

foi associada com a alteração das propriedades intrínsecas migratórias. a expressão do receptor EPHB6 tipo selvagem não alterou significativamente a forma das células (embora a variação do tamanho da forma aumentada), enquanto que o tamanho das células EPHB6 mutantes que cresceram em placas de plástico regulares foi significativamente diminuída (Fig 4B;. p 0,05, teste t de dados de 20 células de células que expressam EPHB6-wt e EPHB6-mut). De acordo com estas descobertas, a quimiotaxia das células em placas de plástico EPHB6 pareceu ser reduzida, muito provavelmente devido às reduzidas propriedades de adesão. Mas as diferenças estatisticamente não foram significativas (dados não mostrados)

Discussão

Ephrin -. Interações receptor Eph são frequentemente desregulamentado no cancro (Referência). No presente estudo foram identificadas mutações de EPHB6 como uma característica pró-metastático em câncer de pulmão não-pequenas células. Uma mutação, del915-917, também esteve presente no tecido normal correspondente, sugerindo fortemente uma alteração da linha germinativa. alterações da linha germinativa foram previamente descritos para EPHB6 no cancro colorectal familial Até à data, as consequências funcionais destas alterações genéticas em um nível celular são desconhecidas [25].

Alterações de receptores Eph ocorrem frequentemente no cancro do pulmão. Um estudo em grande escala seqüenciamento encontraram mutações em 10 dos 13 genes de receptores Eph em adenocarcinoma pulmonar [27]. Devido à multiplicidade de receptores associados eventos de sinalização Ef ea ligação em rede complexa de receptores, o resultado funcional de aberrações receptor Eph permanecem obscuras [28]. Para a maioria das alterações de receptor Eph identificados até à data, as consequências funcionais não têm sido estudados.

várias mutações somáticas do gene EPHB6 tenham sido previamente identificadas no cancro do pulmão [27], cancro colorrectal [25], [26 ], câncer de ovário [29] e glioma [26].

neste estudo, o rastreio de 80 amostras de pacientes com NSCLC e 3 linhas de células NSCLC identificados 3 mutações anteriormente desconhecidas para o gene EPHB6. Um deste mutações, del915-917, reside no domínio entre a cinase de tirosina e o domínio estéril motivo alfa (SAM), onde 2 mutações somáticas foram recentemente identificadas no cancro colorrectal [25], [26]. é sugerida a função deste domínio a ser relacionada ao câncer, e os nossos achados neste trabalho suportam esta sugestão. O

in vivo

experiências mostram claramente que a expressão do EPHB6 reforçada metástase mutado. Além disso EPHB6-mutante células expressando mostrou uma tripla reforçada Transwell migração para um gradiente de soro (quimiotaxia). Estes resultados são consistentes com os nossos

in vivo

resultados. Os ratos transplantados com células EPHB6-mut desenvolvidos de forma significativa (p = 0,011) mais metástases pulmonares como ratos transplantados com células EPHB6-peso. Em adição às funções alteradas do EPHB6 del (915-917) mutante, alguns aspectos pode também sugerem um ganho de função. Por exemplo, os padrões de cicatrização de feridas diferiram entre wildytpe EPHB6 e mutante. É possível que existam diferenças de sinalização entre o tipo selvagem e o receptor mutante. Por outro lado, também pode ser interessante especular que o receptor mutante pode agir dominante negativo em relação a outros receptores Eph inibitórios. Esta actividade dominante negativa pode levar à observação de ganho potencial de potência função. Claramente, estudos futuros podem revelar as diferenças subjacentes na sinalização e a influência de outro membro da EPH e redes de receptores EPH. Estudos futuros podem também revelar os efeitos funcionais das mutações não del915-917. É provável que estes também inativar EPHB6 mas isso precisa ser confirmado no futuro.

Recentemente, pudemos demonstrar que EPHB6 é frequentemente silenciada por mecanismos epigenéticos no câncer de pulmão [21], e outros poderiam mostrar a mesma mecanismo de inativação no cancro da mama [14]. Os nossos estudos também indicaram que a perda de EPHB6 induz um fenótipo altamente metastático. Em consonância, EPHB6 é o receptor tirosina cinase para o qual baixa expressão foi mais estreitamente relacionados com mau prognóstico no câncer de pulmão de células fase inicial de não-pequenas [20]. EPHB6 pode desempenhar um papel importante nas metástases do cancro do pulmão, uma vez que é frequentemente silenciada epigeneticamente e /ou mutado numa fracção significativa de pacientes. Isto faz com que seja possível que EPHB6 é um modificador relevante da capacidade metastática do cancro do pulmão.

Tomadas em conjunto, as mutações em EPHB6 que ocorrem no cancro do pulmão de células não-pequenas pode conduzir a um fenótipo pró-metastática. Perda da função EPHB6 pela diminuição da expressão ou inativação mutacional pode, portanto, contribuir para a metástase do câncer de pulmão.

Reconhecimentos

Estamos gratos ao Dr. Jianping Wu (Universidade de Montreal, Quebec, Canadá) para fornecer cDNA EPHB6.