Abstract

Fundo

Os derivados hidroxilados de colesterol, como as oxysterols, desempenham um papel importante no metabolismo dos lípidos. Em particular, 25-hidroxicolesterol (25HC) tem sido implicado numa variedade de eventos metabólicos, incluindo a homeostase do colesterol e a aterosclerose. 25HC é detectável no plasma humano após a ingestão de uma refeição rica em oxiester�is e na sequência de um desafio de colesterol dietético. Além disso, os níveis de oxysterols, incluindo 25HC, foram encontrados para ser elevados no soro hipercolesterolêmico.

Metodologia /principais conclusões

Aqui, demonstramos que o receptor de estrogênio (ER) medeia alfa mudanças de expressão gênica e respostas de crescimento induzidos pela 25HC na mama e células de cancro do ovário. Além disso, 25HC exibe a capacidade ERa-dependente como 17β-estradiol (E2) para inibir a sobre-regulação de HIF-1α e factor de crescimento do tecido conjuntivo por condições hipóxicas em cardiomiócitos e preparações de coração de rato e para evitar a apoptose induzida por hipoxia.

Conclusões /Significado

a acção do estrogénio exercida pela 25HC pode ser considerado como um fator adicional envolvido na progressão de tumores da mama e do ovário. Além disso, a atividade de estrogênio-like de 25HC provocou no sistema cardiovascular pode desempenhar um papel contra ambientes hipóxicos

Citation:. Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone T, Cerra MC, Picard D, et ai. (2011) o metabolito Colesterol 25 hidroxicolesterol Activa o receptor de estrogénio α-Mediated sinalização em células cancerosas e em cardiomiócitos. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10.1371 /journal.pone.0016631

editor: Vincent Laudet, Ecole Normale Supérieure de Lyon, França |

Recebido: 07 de setembro de 2010; Aceito: 27 de dezembro de 2010; Publicado: January 31, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Lappano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, projeto n 8925/2009.) (https://www.airc.it/) e Ministero dell’Università e Ricerca Scientifica e Tecnologica (MIUR) (http: //www.istruzione.it/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o receptor de estrogénio (ER) e α β pertencem à super família de receptores nucleares de factores de transcrição ligando-indutível [1]. A ligação de 17β-estradiol (E2) para ERs induz a homodimerização do receptor e interacção com elementos de resposta de estrogénio específicos (eres) situadas nas regiões reguladoras dos genes alvo [2]. Dois domínios de activação separado mediar a actividade de transcrição dependentes de ER: a função de activação (AF) -1 localizado no terminal amino e o hormono-dependente AF-2 localizado no domínio de ligação ao ligando (LBD) [3]. A ligação de ligandos ao RE induz a formação de uma bolsa hidrofóbica FA-2, que regula o recrutamento de cofactores e importante da farmacologia do receptor [4] – [5]

Os resultados anteriores obtidos tanto na cultura de células e modelos animais. indicaram que ERa desempenha um papel crucial na mediação dos efeitos do estrogénio em progressão desenvolvimento da glândula mamaria e do cancro da mama [6] – [7]. Além disso, o estrogénio tem demonstrado a prevenção da disfunção vascular e lesão de um modo dependente-ER [8] – [10], para reduzir cardiomiócitos hipertrofia [11] e para reduzir o tamanho do enfarte e a apoptose dos miócitos em modelos animais com oclusão coronária [12] . mecanismos diferentes estão envolvidos na acção protectora exercida por E2 em cardiomiócitos. O estresse oxidativo ea geração posterior de espécies reactivas de oxigénio (ROS) são pensados ​​para desencadear cardiomiócitos apoptose [13], enquanto a capacidade de ER E2-ativado para neutralizar esses intermediários redox é muito provável um fator-chave de protecção cardíaca geral. A resposta das células ao ambiente de oxigénio reduzido implica a hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), que regula a expressão de genes, como a proteína matricellular chamado conjuntivo Factor Tecidual Crescimento (CTGF) que pertence à família CCN de reguladores de crescimento (

Cyr61

, CTGF e

novembro

) [14]. Os níveis de CTGF são sobre-regulado durante a reparação de feridas [15], inflamação [16], doenças fibróticas [17], o crescimento do tumor [18] – [19] e a angiogénese [18], [20]. evidências acumuladas também sugeriu que o CTGF exerce um papel crucial em processos fibróticos cardíacas, indicando-a como um possível biomarcador e um candidato potencial para a intervenção terapêutica [21].

oxiester�is são derivados de colesterol, que desempenham funções importantes em hidroxilado metabolismo lipídico [22]. 25-hidroxicolesterol (25HC) que é sintetizada a partir do colesterol por uma hidroxilase específica [23], actua como um potente inibidor da biossíntese do colesterol em diferentes tipos de células [24]. 25HC foi detectada no plasma de rato após a ingestão de uma refeição rica em oxiester�is e na sequência de um desafio colesterol dietético [25]. Do mesmo modo, os níveis de oxiester�is, incluindo 25HC, foram mais elevados no soro hipercolesterolémicos em comparação com os encontrados no soro normocolesterolêmicos [26]. Em seguida, camundongos deficientes na enzima oxisterol-catabolizante oxisterol 7α-hidroxilase (CYP7B) apresentaram concentrações elevadas de ambos 25HC e 27HC, sugerindo um papel regulador provocada por CYP7B sobre esses derivados do colesterol hidroxilados [27].

No presente estudo, demonstramos que 25HC provoca efeitos estrogênicos ativando ERa mediada sinalização tanto em células de câncer de mama e de ovário ou em cardiomiócitos. Os resultados obtidos foram confirmados, pelo menos em parte, em corações isolados e perfundidos de ratos.

Materiais e Métodos

Reagentes

17β-estradiol (E2), 25-hidroxicolesterol (25HC), cloreto de cobalto (CoCl

2), PD98059 (PD), SB202190 (SB) e actinomicina D foram adquiridos a Sigma-Aldrich, Inc., Milão, Itália. As experiências realizadas utilizando 25HC a partir de Sigma-Aldrich, Inc., Milão (Itália) foram confirmadas com 25HC adquiridos a Research Plus Inc., Barnegat, NJ. ICI 182780 (ICI) foi obtido a partir de Tocris Chemicals. Todos os compostos foram solubilizados em sulfóxido de dimetilo (DMSO), excepto E2 e PD, que foram dissolvidos em etanol.

Cultura celular

O cancro da mama MCF7 e de células de rim embrionário humanas Hek293 foram mantidas em DMEM com vermelho de fenol suplementado com FBS a 10%. SKBR3 da mama e células de cancro do ovário BG-1 foram mantidas em RPMI 1640 e DMEM, respectivamente, sem vermelho de fenol suplementado com FBS a 10%. A linha de células de cardiomiócitos de murino HL-1 foi gentilmente cedido pelo Dr. William C. Claycomb (Louisiana State University Medical Center, em Nova Orleans, LA). HL-1 foram cultivadas de acordo com o protocolo publicado [28] em meio Claycomb (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Milão, Itália) suplementado com FBS a 10% (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Milão, Itália), 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina, 0,1 mM de norepinefrina (Sigma-Aldrich, Inc., Milão, Itália) e 2 mM de

l

-glutamina (Invitrogen, Milão, Itália). Todas as linhas celulares foram cultivadas em incubadora a 37 ° C com 5% de CO

2. No caso de células HL-1 de estimulação hipóxica foram tratados com CoCl

2 ou cultivadas na presença de baixa tensão de oxigénio (2% O

2) numa incubadora HeraCell (ThermoScientific-Heraeus, Milão, Itália). Todas as linhas de células a serem processados ​​para immunoblot e ensaios de RT-PCR foram mudadas para meio sem soro e vermelho de fenol 24 h antes dos tratamentos.

Transfec�es, ensaios de luciferase e experimentos silenciamento gênico

Os plasmídeos e luciferase Os ensaios foram previamente descrito [29] – [32]. Em particular, foram utilizados os vectores de expressão que codificam o comprimento total ERa e a ERp forma que codifica a proteína de 485 aa [29] – [32]. As células foram plaqueadas em placas de 10 cm, mantidas em meio isento de soro durante 24 h e, em seguida, transfectadas durante mais 24 h antes de tratamentos utilizando FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals, Milão, Itália) e vectores de controlo adequadas. Os plasmídeos SureSilencing ™ shRNA para rato HIF-1α e respectivos plasmídeos de controlo negativo (shRNA) foram adquiridos a Superarray Bioscience Corporation (Frederick, MD, EUA) e foram utilizados de acordo com as recomendações do fabricante (Cat. KM03799P). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 10 cm, e em seguida transfectadas em meio isento de soro durante 24 horas antes de tratamentos com uma mistura contendo 15 � /placa FuGENE6 Reagente e 5 ug /controlo de placa shRNA ou shRNA HIF-1α (shHIF-1α) plasmídeo. Para silenciamento HIF-1α, o fabricante proporciona 4 curto de ARN gancho de cabelo (shRNA) sequências pré-concebidas separadas para o mesmo gene, embalados em 4 espinhas dorsais de plasmídeos separados (como numerados 1-4). Em nossos experimentos, uma única sequência autónoma plasmídeo shRNA (n.3) foi suficiente para silenciar a expressão do gene HIF-1α. O controle shRNA é uma sequência artificial mexidos que não corresponde a nenhum gene humano, rato ou rato.

ERa ensaios de ligação

A capacidade de 25HC para competir com [3H] E2 para a ligação a ERa foi avaliado tanto em células MCF7 ou usando lisados ​​celulares Hek293 na presença ou ausência de dois picomoles de proteína de eRa humana recombinante purificada comprado de PanVera, Invitrogen Srl Milão, Itália. As células MCF7 foram despojados de qualquer estrogénio, mantendo-os em meio sem soro durante 2 dias, depois as células foram incubadas com 1 nM de [2,4,6,7-3H] E2 (89 Ci /mmol; GE Healthcare, Milão, Itália) e concentrações crescentes de E2 não marcado ou 25HC durante 2 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% ar /5% de CO2. Após remoção do meio, as células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo /0,1% de metilcelulose duas vezes, colhidas por raspagem e centrifugação, e lisadas com 100% de etanol, 500 ul por mm prato 60, durante 10 min a temperatura ambiente [33]. A radioactividade dos extractos foi medido por contagem de cintilação líquida. Ensaio de ligação também foi realizada utilizando lisados ​​de células inteiras Hek293. As células foram despojados de qualquer estrogénio, mantendo-os em meio sem soro durante 2 dias, e em seguida lisaram-se em 500 ul de tampão RIPA (Tris 20 mM-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; 0,5% de Nonidet P-40; 0,5 mM EDTA) na presença de uma mistura de inibidores de protease contendo 1,7 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml leupeptina, 200 mmol /litro de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 200 mmol /litro sodiumorthovanadate e 100 mmol /litro de fluoreto de sódio. A concentração de proteína foi determinada utilizando o reagente de Bradford de acordo com as recomendações do fabricante (Sigma-Aldrich, Inc., Milão, Itália). Quantidades iguais de extracto de todo-proteína foram incubadas na ausência ou na presença de dois picomoles de ERa recombinante e incubaram-se com 1 nM de [3H] E2 e concentrações crescentes de E2 não marcado ou 25HC durante 2 h a 4 ° C. Ligado e radioligandos livres foram separados em Sephadex G-25 PD-10 colunas. A quantidade de receptor ligado-[3H] E2 foi determinada por contagem de cintilação líquida.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e Re-chip ensaios

células MCF7 foram cultivadas em placas de 10 cm a 70 -80% de confluência, deslocou-se para meio isento de soro durante 24 h e, em seguida, tratado com veículo, 10 nM de E2 ou 1 uM durante 1 h 25HC. Em seguida, as células foram reticuladas com formaldeído a 1% e sonicada. Os sobrenadantes foram immunocleared com ADN de salmão sonicado /proteína A agarose (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) e imunoprecipitadas com anticorpo anti-ERa ou não específica de IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milão, Itália). Os sedimentos foram lavados, eluída com um tampão que consiste em 1% SDS e 0,1 mol /L NaHCO3, e digeridas com proteinase K. O DNA foi obtido por extracção com fenol /clorofórmio e precipitado com etanol. Um volume de 4 ul de cada amostra foi utilizado como molde para amplificar uma região contendo ERE localizado no promotor pS2 por PCR em tempo real (Applied Biosystems, Milão, Itália). Os iniciadores utilizados foram 5′-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 ‘(PS2 para a frente) e 5′-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3’ (PS2 reverso). Os dados foram normalizados para a entrada para a imunoprecipitação. Em experiências de Re-chip, os complexos foram eluídos por incubação durante 30 min em tampão de re-IP (ditiotreitol 0,5 mM, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA, 20 mM Tris-Cl pH 8,1, NaCl 150 mM) e submetidas a o procedimento de chip, utilizando anti-SRC-1, anticorpos SRC-3 e PFC (tudo comprado de Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milão, Itália).

a transcrição reversa e PCR em tempo real

a expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real como descrito anteriormente [32]. Para PS2, PR, catepsina D, ciclina A, ciclina D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 e 18S proteína ribossómica, o qual foi utilizado como um gene de controlo para obter valores normalizados, os primers foram: 5 ‘-GCCCCCCGTGAAAGAC-3′ (pS2 para a frente) e 5’-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3 ‘(pS2 reversa); 5’-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 ‘(PR para a frente) e 5′-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3′ (inverso PR); 5’-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 ‘(Catepsina D para a frente) e 5′-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3′ (catepsina D reversa); 5’-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 ‘(Ciclina A para a frente) e 5′-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3′ (Ciclina A reverso); 5’-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 ‘(ciclina D1 para a frente) e 5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′ (Ciclina D1 reversa); 5’-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 ‘(HIF-1a para a frente) e 5′-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3′ (inverso HIF-1α); 5’-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 ‘(CTGF para a frente) e 5′-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3′ (inverso CTGF); 5’-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 ‘(FAS para a frente) e 5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′ (FAS reversa); 5’-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 ‘(SERPINF1 para a frente) e 5′-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3′ (SERPINF1 reversa); 5’-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 ‘(HSPA1L para a frente) e 5′-AGCAATCACACCTGCATCCTT-3′ (HSPA1L reversa); 5’-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 ‘(SELENBP1 para a frente) e 5′-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3′ (SELENBP1 reversa), e 5’-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 ‘(18S directo) e 5′-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3’ (18S reversa), respectivamente .

imunotransferência

Os lisados ​​celulares e os ensaios de imunotransferência foram realizadas como anteriormente descrito [32]. Os anticorpos contra ERa (M-10), ciclina D1 (M-20), o CTGF (G-20), fosforilado ERK1 /2 (P-4) e ERK2 (C-14), β-actina (C-2) e β-tubulina (H-235-2) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (DBA, Milão, Itália). RpE e HIF-1α foram adquiridos a partir de R D Systems, Inc. (Milão, Itália). A fosfo-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) e p38MAPK foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Milão, Itália). Os ensaios de

proliferação e TUNEL

ensaios de proliferação quantitativos foram realizados como previamente descrito [ ,,,0],32]. células HL-1 foram semeadas em duas cavidades lâminas de câmara Lab-Tek® II e tratou-se durante 18 h. Após a remoção meio, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% tamponado (pH 7,4) durante 30 min. As lâminas foram lavadas duas vezes em PBS, pH 7,4. Um

In situ

kit de detecção da morte celular (deadend ™, Fluorométrica Sistema de TUNEL, Promega Corp, Milão, Itália) foi posteriormente utilizado para executar ADN marcação terminal 3′-hidroxilo pelo método TUNEL (terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) – mediada Nick Rotulagem) ensaio Final dUTP-X, como previamente descrito [34]. Rotulagem de células mostrou-se correlacionada com critérios morfológicas típicas de apoptose. De DNA foi identificada em extremidades 3 ‘com fluoresceína-dUTP por incubação a 37 ° C com tampão de reacção contendo TdT numa câmara humidificada, durante 1 h. Os núcleos das células foram coradas com iodeto de propídio. Após três lavagens em PBS, a fragmentação de ADN apoptótico foi directamente detectado pela visualização do DNA marcado usando microscópio fluorescente. Para o controle negativo, as lâminas foram incubadas sem TdT; para obter o controlo positivo, os slides foram tratados com ADNase I 1 ug /ml durante 10 minutos à temperatura ambiente antes da exposição ao dUTP fluoresceína e TdT.

preparações de coração isolado e per fundidos

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão do Uso de Animais do Departamento de fármaco-Biologia da Universidade da Calábria (ID aprovação 110 /2000A). Os procedimentos seguidos no estudo estavam em conformidade com as normas da Comunidade Europeia sobre o cuidado e uso de animais de laboratório e com a

Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório

publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação No. 85-23, revista em 1996). ratos machos adultos (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Itália) foram anestesiados por injecção i.p. injecção de carbamato de etilo (2 g /kg de peso corporal). Os corações foram, em seguida, dissecado para fora e ligado a um aparelho de Langendorff por perfusão com uma solução de Krebs-Henseleit (SKH) composta por (em mM) NaCl 113, KCl 4,7, NaHCO3 25, MgSO4 1,2, CaCl2 1,8, KH2PO4 1,2, glucose 11, manitol 1,1, Na-piruvato 5 e gaseificada com 95% de O

2-5% de CO

2 (pH 7,4, 37 ° C). KHS foi libertado a uma taxa de fluxo constante de 12 mL /min. Para medir a actividade cardíaca, um balão de látex cheio de água, conectado a um medidor de BLPR (WRI, Inc. EUA), foi inserido através da válvula mitral para o ventrículo esquerdo para permitir contrações isovolumétrica e para gravar continuamente parâmetros mecânicos. O balão foi progressivamente cheio com água para se obter uma pressão final diastólica ventricular esquerda inicial de 5 a 8 mmHg [35]. Todos os corações foram perfundidos durante um período de equilíbrio de 15 min. Após o período de equilíbrio, os corações (n = 3) foram distribuídos aleatoriamente a um dos seguintes grupos: Grupo 1 (controlo): KH gaseificada com 95% de O

2-5% de CO

2; Grupo 2: KH gaseificada com 95% de O

2-5% de CO

2 mais 1 nM E2; Grupo 3: KH gaseificada com 95% O

2-5% de CO

2 mais 100 nM 25HC; Grupo 4: KH gaseificada com 50% O

2-45% N

2-5% de CO

2; Grupo 5: KH gaseificada com 50% O

2-45% N

2-5% de CO

2 mais 1 nM E2; Grupo 6: KH gaseificada com 50% O

2-45% N

2-5% de CO

2 mais 100 nM 25HC

Todos os corações foram perfundidos por 60 minutos para investigar o efeito. de cada composto e dos diferentes níveis de oxigénio sobre as alterações de expressão de ARNm de CTGF e HIF-1α. Solução contendo tratamentos foi preparado na hora antes dos experimentos. pressão ventricular esquerda, ritmo cardíaco e fluxo coronário foram monitorados durante todo o protocolo de perfusão. No final das perfusões, ventrículos foram excisados ​​e imediatamente processada para extracção de ARN.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls ‘para determinar as diferenças entre as médias. P 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

25HC ativa ERa em células cancerosas

Começamos avaliando se 25HC é capaz de transativar um gene repórter ER transitoriamente transfectadas in. células de cancro da mama (MCF7), que expressam RctE e RpE não como avaliado por RT-PCR (dados não mostrados). Curiosamente, 25HC activado ERa de uma forma dependente da dose, embora com uma menor eficácia em comparação com E2 (Fig. 1A). A seguir avaliou se 25HC poderia antagonizar a activação transcricional induzida por E2. As células MCF7 foram, em seguida, tratada em simultâneo com o aumento das concentrações de ambos 25HC e E2, no entanto, as respostas transcripcionais foram semelhantes aos obtidos usado sozinho E2 (Fig. 1A). Pelo contrário, a actividade de luciferase induzida por 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC foram revogada utilizando doses crescentes de antagonista da ICI ER (Fig. 1B), sugerindo que ERa medeia a activação da transcrição por exposição a cada composto. Para fornecer mais dados sobre a capacidade de 25HC para activar ERa e para avaliar se o RpE pode também responder a 25HC, que transientemente transfectadas células Hek293 ER-negativo com o gene repórter de ER, juntamente com o vector de expressão codificando ERa ou RpE. De nota, apenas a expressão permitiu ERa 1 uM 25HC para induzir a actividade de luciferase, que foi abolido por ICI 10 uM (Fig. 1C-D). Para fornecer mais evidências sobre a capacidade de 25HC para ativar ERa mas não ERP, nós nos voltamos para um sistema completamente heteróloga. Em células HEK293 1 uM 25HC activada uma proteína quimérica constituída pelo domínio de ligação de DNA (DBD) do factor de transcrição de levedura Gal4 e o LBD de ERa mas não RpE (Fig. 1E-F). Mais uma vez, a transactivação de ERa foi abolida pela ICI 10 uM (Fig. 1E-F). Para confirmar os resultados acima mencionados, que poderia verificar-se se 25HC induzir a expressão dos genes alvo RpE SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, que foram relatados para responder ao tratamento E2 [36]. Usando HEK293 células transientemente transf ectadas com um plasmídeo de expressão RpE, a transcrição destes genes foi estimulada por E2, mas não por 25HC (Fig. S1). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que 25HC activa ERa de uma maneira selectiva e mostram que ERa-LBD é suficiente para a resposta transcricional.

células MCF7 (A) foram transfectadas com um gene repórter de luciferase de ER juntamente com a interna controlo da transfecção de luciferase Renilla e foi tratada com concentrações crescentes (escala logarítmica) de E2 e 25HC. Além disso, as células foram tratadas simultaneamente com doses semelhantes de cada composto. Os valores da actividade da luciferase normalizados de células tratadas com veículo (-) foram definidos como a indução 1 vezes, sobre a qual foi calculada a actividade induzida por tratamentos. células (B) MCF7 transfectadas com o gene repórter ER foram tratadas com 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC sozinho e em combinação com o aumento da concentração do antagonista ER ICI, conforme indicado. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências realizadas em triplicado. células (C-F) Hek293 foram transfectadas com o gene repórter ER luciferase (EREluc) e ERa (C) ou RpE (D) os plasmídeos de expressão, com Gal4 GK1 gene repórter e as proteínas de fusão Gal4 que codificam o ligando de ligação de domínio (LBD) de ERa (GalERα) (e) ou RpE (GalERβ) (F) e tratou-se com 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC sozinho e em combinação com o antagonista de ER 10 uM ICI, conforme indicado. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências realizadas em triplicado.

Com base nos resultados obtidos em experiências de transfecção, foi perguntado se 25HC pode comportar-se como um ligando de competir com e E2 para o ligação a ERa. Num ensaio de ligação de células inteiras com células MCF7 25HC deslocado a radiomarcado E2 de uma maneira dose-dependente (Fig. 2A). Da mesma forma, quando ERa recombinante foi adicionado a um lisado de células HEK293 que por si só não se liga E2, 25HC competiu eficientemente contra o marcador de E2 (Fig. 2B-C). Os resultados destes ensaios de ligação são compatíveis com a ideia de que 25HC liga ERa diretamente, mas mais experimentos serão necessários para estabelecer o modo de ação de forma inequívoca.

Os gráficos mostram a ligação residual do marcador radioativo na presença de concentrações crescentes de E2 não marcado e 25HC em células MCF-7 (a), em lisados ​​celulares Hek293 na presença (B) ou a ausência de proteína recombinante ERa (C). Cada ponto de dados representa a média ± desvio padrão de amostras em triplicado de três experiências separadas. Note-se que a quantidade de traçador ligado na ausência de competidor foi arbitrariamente definida como 100% e que os valores absolutos subjacentes diferiu entre os três painéis.

25HC induz o recrutamento de ERa para a sequência do promotor pS2 em células MCF7

com base as conclusões acima mencionadas, nós avaliamos se 25HC poderia induzir o recrutamento de ERa a região de ADN alvo contendo ERE dentro da sequência do promotor de pS2. Efectuar um ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células MCF7, tratamento de 1 h com 1 | iM 25HC induziu o recrutamento de ERa ao promotor pS2 como observado utilizando 10 nM de E2 (Fig. 3A). Além disso, para verificar se 25HC pode recrutar co-activadores para o promotor PS2, foi realizado ensaio Re-ChIP utilizando anticorpos contra o SRC-1 e SRC-3, que pertencem ao co-activador de receptor de esteróides (SRC) famílias e contra CBP ( proteína de ligação a CREB) [37]. Todos os co-activadores foram recrutados de forma eficiente com o promotor de pS2 expondo as células MCF7 de 10 nM de E2, no entanto 1 uM 25HC mostrou uma ligeira eficácia (Fig. 3A). Assim, E2 e 25HC exibir uma capacidade diferente no recrutamento de co-activadores, os quais contribuem para a potência agonista de ligandos.

(A) e E2 25HC induzir o recrutamento de ERa ao site do ERE localizado no promotor pS2 sequência em células MCF7. As células foram tratadas durante 1 h com o veículo, E2 (10 nM) ou 25HC (1 uM) e submetido ao procedimento cromatina imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-IgG não específicas de anti-ERa ou. Para os ensaios de Re-chip, anti-SRC-1, SRC-3 e anticorpos do PFC foram utilizados. As sequências amplificadas foram avaliados por PCR em tempo real. (B-C) Avaliação da expressão de ARNm de PS2, Progesterone Receptor (PR), catepsina D, ciclina A e ciclina D1 por PCR em tempo real em células MCF7 e de células BG-1. As células foram tratadas durante 24 h com 10 nM de E2 e 1 uM 25HC. Os resultados obtidos a partir de experiências realizadas em triplicado foram normalizadas para expressão de 18S e mostrada como mudança de dobragem de expressão de ARN em comparação com as células tratadas com veículo. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências realizadas em triplicado. (•), (°), (▪), (□) (♦) indicam

p

. 0,05 para células receptoras veículo (-) versus tratamentos

regula 25HC a expressão de genes alvo em ERa e MCF7 células BG-1 |

seguinte avaliou o potencial de 25HC para regular a expressão de genes alvo ERa bem conhecidos, tais como PS2, PR, catepsina D, ciclina a e ciclina D1 na mama MCF7 e BG-1 células de cancro do ovário. Como determinado pelo tempo real de RT-PCR, um 24 h de exposição a 1 | iM 25HC-regulado a expressão de ARNm de todos os genes analisados, semelhante ao tratamento com 10 nM de E2 (Fig. 3B-C). Para corroborar ainda mais estes resultados, foi investigada a capacidade de 25HC para modular a expressão dos níveis de proteína ERa e de ciclina D1 em células MCF7 e de células tumorais BG-1. Até à data, a sub-regulação de ERa por estrogénio tem sido considerada uma característica da activação do receptor [38], enquanto que a sobre-regulação da ciclina D1 por E2 tem sido extensivamente relatados [39]. Os níveis de proteína ERa Notavelmente, um 24 h de exposição a 1 | iM 25HC regulada para baixo (Fig. 4A-B). Pelo contrário, um tratamento de 24 h com 1 | iM 25HC-regulada a expressão da proteína ciclina D1, que foi anulada pela ICI 10 uM (Fig. 4C-D). No seu conjunto, estes resultados sugerem que 25HC é capaz de regular a expressão de genes alvo ERa como E2.

Imunotransferência de ERa (A, B) e ciclina D1 (C, D) a partir de células MCF7 e de células BG-1. As células foram tratadas durante 24 h com veículo (-), 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC e na presença de 10 uM de ER-antagonista ICI, conforme indicado. β-actina serve como controlo de carga. 25HC induz efeitos proliferativos em células MCF7 e de células BG-1 (E-H). As células foram tratadas durante 5 dias com concentrações cada vez maiores (escala logarítmica) de E2 e 25HC e contadas no dia 6 (E, G). As células foram tratadas com 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC e em combinação com 10 uM ER-antagonista ICI e contadas no dia 6 (F, H). A proliferação de células que receberam veículo foi definido como 100% sobre o qual foi calculado o crescimento celular induzido por tratamentos. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (•), (°) indicam

p

. 0,05 para células receptoras veículo (-) versus tratamentos

25HC induz efeitos proliferativos em MCF7 e as células BG-1

em seguida, buscou-se avaliar a contrapartida biológica dos efeitos acima mencionados exercidas pela 25HC. ensaios de crescimento realizados em células MCF7 e de células cancerosas BG-1 demonstraram que 25HC é capaz de induzir efeitos proliferativos em uma maneira dependente da dose (Fig. 4E e 4G). Em seguida, as respostas de crescimento a 10 nM e 1 uM 25HC E2 foram abolidas por ICI 10 uM (Fig. 4F e 4H), sugerindo que ERa medeia a proliferação de células induzida por exposição a ambos os compostos.

25HC imita os efeitos da E2 contra apoptose induzida por hipoxia em cardiomiócitos

para melhor avaliar as propriedades estrogênicas de 25HC, nós nos voltamos para um sistema modelo completamente diferente como os cardiomiócitos HL-1 [28], que expressam ERa e níveis muito baixos RpE como julgado por RT-PCR (dados não mostrados). Tem sido relatado que células de E2 protege agressão hipóxica em contextos celulares diferentes [40] – [42]. Assim, avaliou-se a E2 e 25HC poderia proteger HL-1 cardiomiócitos de apoptose induzidos pela hipóxia-agente mimético bem conhecido CoCl

2 [43] – [44]. Determinação da degradação do ADN por ensaio de TUNEL, aproximadamente 70% das células HL-1 resultou positivo para a coloração TUNEL após exposição a CoCl

2 (Fig. 5 e Fig. S2). É de notar que a percentagem de células apoptóticas foi significativamente reduzida na presença de 10 nM de E2, quer ou 1 uM 25HC (Fig. 5 e Fig. S2). Os efeitos protector exercido por ambos os compostos foram revogada usando 10 uM ICI, que por si só não induz a apoptose (Fig. 5 e Fig. S2). Tomados em conjunto, os resultados apresentados indicam que a E2 e 25HC pode proteger cardiomiócitos de apoptose induzida por hipoxia em uma maneira dependente da ER.

alterações apoptóticas foram detectadas utilizando TUNEL (a verde) e os núcleos foram coradas por iodeto de propidio ( PI, em vermelho), como indicado. Fotografias representativas que após o tratamento 18 horas com veículo e 100 uM de CoCl2, 10 nM de E2, 1 uM 25HC sozinho, ou uma combinação de 100 uM de CoCl2 com 10 nM de E2 na presença ou ausência de 10 uM ICI, 100 uM de CoCl2 com 1 uM 25HC na presença ou na ausência de 10 uM ICI.

E2 e 25HC prevenir a expressão induzida por hipoxia de HIF-1α e CTGF em cardiomiócitos

foi relatado anteriormente que o HIF-1α medeia a expressão de CTGF estimulada por hipoxia em células diferentes contextos [ ,,,0],45] – [47]. Enquanto a regulação potencial de HIF-1α por E2 tem sido sugerido, em certos modelos de [48] – [49], a capacidade de estrogénio para influenciar a expressão induzida por hipoxia de CTGF no sistema cardiovascular continua a ser investigado. Com base nestas observações, se verificou que o HIF-1α e CTGF está regulado para cima em ambos os níveis de mRNA e proteína de uma forma dependente do tempo por 100 uM CoCl

2 em células HL-1 (Fig. 6A, C) . respostas semelhantes foram observados incubação de células HL-1 na presença de baixa tensão de oxigénio (2% O

2) (Fig. 6B, D). Em seguida, a expressão induzida por hipoxia de HIF-1α e CTGF foi abolida usando o inibidor da síntese de ARN iniciados com ADN de actinomicina D (Fig. S3), o que sugere que os mecanismos de transcrição são responsáveis ​​pela regulação positiva de ambos os HIF-1α e CTGF . Em seguida, determinou-se que o silenciamento de HIF-1α anula a indução de CTGF observadas quer após exposição a CoCl

2 ou condições hipóxicas (2% O

2) (Fig. 6E-F), indicando que medeia HIF-1α a sobre-regulação de CTGF por hipoxia em células HL-1. Depois disso, foi perguntado se E2 e 25HC pode influenciar HIF-1α e expressão CTGF. Curiosamente, verificou-se que, quer 10 nM de E2 ou 1 uM 25HC evitar a sobre-regulação de HIF-1α e CTGF, quer por CoCl

2 ou baixa tensão de oxigénio (2% O

2) em ambos os ARNm (Fig. S4) e os níveis de proteína (Fig. 7A-B).