Abstract
Fundo
Embora o câncer de cólon metastático é uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo, os mecanismos moleculares que permitem que as células cancerígenas do cólon de metástase permanecem obscuros. Evidências sugerem que as células metastáticas desenvolver usurpando redes de transcrição a partir de células-tronco embrionárias (ES) para facilitar uma transição epitelial-mesenquimal (EMT), invasão e progressão metastática. Estudos anteriores identificaram HMGA1 como um fator de transcrição chave enriquecida em células ES, câncer de cólon e outros tumores agressivos, embora o seu papel nestas definições é mal compreendida.
Métodos /principais conclusões
Para determinar como as funções HMGA1 em câncer de cólon metastático, nós manipulados
HMGA1
expressão em camundongos transgênicos e células de cancro do cólon. Descobrimos que HMGA1 impulsiona mudanças proliferativas, formação de criptas aberrantes e polipose intestinal em camundongos transgênicos. Em linhas celulares de cancro do cólon de tumores pouco diferenciados, metastáticos, knock-down de blocos HMGA1 crescimento celular, migração, invasão, tumorigênese xenotransplante e colonosphere tridimensional formação independente de ancoragem. Inibindo
HMGA1
blocos de expressão Tumorigênese em diluições limitantes, de acordo com depleção de células do tumor-iniciador nas células knock-down. Knock-down de HMGA1 também inibe a progressão metastática para o fígado
in vivo
. Em células metastáticas do cancro do cólon, HMGA1 induz a expressão de
TWIST1
, um gene envolvido na embriogénese, EMT, e a progressão do tumor, enquanto que reprime HMGA1
E-caderina
, um gene que é regulado negativamente durante a EMT e progressão metastática. Além disso,
HMGA1
está entre os genes mais enriquecidos em câncer de cólon em relação a mucosa normal.
Conclusões
Nossos resultados demonstram pela primeira vez que HMGA1 impulsiona mudanças proliferativas e formação de pólipos no intestino dos ratos transgénicos e induz a progressão metastática e propriedades estaminais-como em células cancerígenas do cólon. Estes resultados indicam que HMGA1 é um regulador chave, tanto na progressão metastático e na manutenção de um estado de haste semelhante. Nossos resultados também sugerem que HMGA1 ou a jusante caminhos poderiam ser alvos terapêuticos racionais em metastático, câncer de cólon pouco diferenciado
Citation:. Belton A, Gabrovsky A, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio-Donahue C, Huso DL, et ai. (2012) HMGA1 Induz Intestinal polipose em ratinhos transgénicos e Drives Tumor Progression and Stem Cell Properties em células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10.1371 /journal.pone.0030034
editor: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 29 Julho, 2011; Aceito: 12 de dezembro de 2011; Publicação: 20 de janeiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Belton et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento veio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) RO1CA092339 e R21CA2149550 a L. Resar, NIH T32HL007525 para A. Belton, eo Maryland Stem Cell Research Fund para L. Resar e A. Belton. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apesar do recente progresso no rastreio do cancro colorectal e tratamento, o cancro colo-rectal metastático continua a ser uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo [1] – [2]. Os mecanismos moleculares que permitem que as células cancerosas para metastizar são pouco compreendidos, apesar de evidência emergente indica que as redes de transcrição necessários para as propriedades de células-tronco durante a embriogénese são co-optou durante a progressão metastático [3] – [4]. Estudos recentes identificaram HMGA1 como um factor de transcrição chave enriquecido em estaminais embrionárias humanas células (ES) [3], células estaminais hematopoiéticas [5] – [8], leucemia refractária [6] – [7], [9] e de alto grau /cânceres pouco diferenciados de mama, cérebro, bexiga e [3]. Além disso, os tumores com superexpressão
HMGA1
e outros oito genes fator de transcrição ES diminuiu sobrevivência, ressaltando a importância destes genes na progressão tumoral [3]. Mais recentemente, verificou-se que os níveis de proteína HMGA1 correlacionam com o estado de diferenciação pobre e diminuição da sobrevida no câncer de pâncreas, implicando ainda HMGA1 numa progressão indiferenciado, caule-como o estado e tumor [10]. O
HMGA1
gene codifica a cromatina remodelação proteínas HMGA1a e HMGA1b, que funcionam para modular a expressão do gene, alterando a estrutura da cromatina e montagem de complexos de fator de transcrição na promotores específicos [11] – [18]. Estudos anteriores demonstraram que as propriedades oncogénicas HMGA1 induz em células em cultura [19] – [27], e provoca tumores agressivos em ratinhos transgénicos [9], [28] – [32]. As vias moleculares precisos regulados por HMGA1 em transformação, no entanto, estão apenas começando a emergir e estudos para elucidar HMGA1 redes de transcrição são susceptíveis de descobrir caminhos fundamentais envolvidos na progressão e desenvolvimento do tumor.
Aqui, nós relatamos pela primeira vez que o impulsiona HMGA1 alterações proliferativas e formação de pólipos nos intestinos de ratos transgénicos e dirige vias moleculares importantes na progressão tumoral e haste propriedades da célula em células de cancro do cólon humanos. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que
HMGA1
promove a progressão do tumor no câncer de cólon através da reprogramação epitélio do cólon para um estado-tronco-like.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com um protocolo aprovado pelo Comité de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (protocolo nº MO08M263). Todos os ratos foram alojados em um ambiente estéril onde eles tiveram livre acesso a comida e água como descrito nas diretrizes institucionais.
análise inversa quantitativa de transcrição-PCR (qRT-PCR).
RNA foi preparado como descrito [9], [27]. Os primers para
HMGA1
[28],
Torção
,
Vimentin
,
E-caderina
,
FOXC2
,
Snail1
,
Slug
,
TCF-3
,
TWIST1
,
Twist2
,
SFH1B
) foram previamente relatado [4].
GAPDH
iniciadores estão disponíveis comercialmente (Applied Biosystems). reacções de qRT-PCR foram realizadas em triplicado e repetidas pelo menos uma vez
análise de Western
análises de Western foram realizados como se descreveu [9], [19] -.. [20], [33 ] utilizando um anticorpo HMGA1 comercial (Abcam, catálogo # AB4078) diluído 1:1000 e β-actina (Cell Signaling, catálogo # 4967) diluído 1:1000 como um controle endógeno.
As linhas celulares.
HCT116 (CCL-247; American Type Culture Collection) e SW480 (CCL-228; American Type Culture Collection) foram cultivadas como recomendado. As células transfectadas foram seleccionadas em puromicina (3 ug /ml)
curvas de crescimento
taxas de crescimento celular foram determinados como descrito anteriormente [19] -.. [20], [26] – [ ,,,0],29], [33]
Anchorage-independente do crescimento celular em ensaios de agar, migração e invasão moles
Estes ensaios foram realizados como descrito [19] -.. [20], [ ,,,0],26] – [28], excepto que o ensaio de migração foi feito com 60.000 células /poço e ensaios de invasão foram realizados com 20 ul de factor de crescimento em matrigel reduzida
ensaio Colonosphere
Colonosphere ensaios.. foram realizados como previamente descrito [34].
In vivo
ensaio de metástase.
Este ensaio foi realizado como anteriormente descrito [35] com células (10
5 ) injectada por ratinho (NOD /Shi-
scid
/IL-2Rγ
null;.. Jackson Laboratory)
Xenoenxerto tumorigenicidade
Estes estudos foram feitos in nude (nu – /-) ratos como descrito [19] -.. [20]
Vectors
O RNA curto hairpin (shRNA) plasmídeo interferência para
HMGA1
tem foi descrito [36]. O vector shRNA vazio foi utilizado como um controlo.
análise imuno-histoquímica.
As secções de tecido (4 mm de espessura) a partir de intestinos delgado e grosso de ratos transgénicos e de controlo foram gerados e desparafinados em xileno e, em seguida hidratadas numa série graduada de álcool. recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada num autoclave durante 10 minutos em tampão de citrato de sódio (pH 6,0). A actividade da peroxidase endógena foi inactivada por incubação das secções de 4% H
2O
2 durante 5 minutos. Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato, as secções foram incubadas com anticorpo monoclonal de coelho anti-Ki-67 (clone 30-9, Ventana, Tucson, AZ, catálogo # 790-4286) durante 1 hora à temperatura ambiente. A coloração positiva foi visualizada com o kit de detecção de DAKO EnVision Plus-HRP (DAKO, Carpinteria, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Ki-67 células positivas foram contadas em 5 campos aleatoriamente selecionados de áreas comparáveis no intestino delgado e grosso de ratos transgénicos e de controlo a 20 × ampliação. Um total de 100 criptas para cada rato foram contadas a partir de cortes corados de ratinhos transgénicos e de controlo (2 ratos /grupo).
morfologia e tamanho das células determinações.
As células foram cultivadas e permitiu a crescer a 80% de confluência. As fotografias para medições de avaliação morfológica e diâmetro foram obtidos utilizando o Zeiss invertido M-scope com a Olympus DP72 Câmara e Software (JHMI confocal Facility). Pelo menos cinco campos aleatórios foram fotografados para cada linha de células com ou sem HMGA1 knock-down. O maior diâmetro (mm) foi medida para 700-1000 células de cada grupo. As maiores diâmetros foram representados como a média ± o desvio padrão; significância foi determinada utilizando t-teste do estudante.
Resultados
HMGA1a
transgênicos desenvolver pólipos e expansão no compartimento de células-tronco
Para definir o papel de HMGA1 na tumorigénese, nós engenharia ratinhos transgénicos com o murino
hmga1a
transgene dirigido pelo promotor de imunoglobulina H2K e mu potenciador [9], [27] – [29]. Como relatado anteriormente, todos os ratos sucumbir à malignidade linfóide agressiva [9] e as fêmeas desenvolver sarcomas uterinos [28] – [29]. Para determinar se HMGA1 promove a transformação neoplásica no epitélio intestinal, investigou-se os intestinos destes ratinhos. O transgene é expressa nos intestinos delgado e grosso de 4 a 7 vezes superior ao encontrado em controlos (Fig. S1). Na necropsia, os intestinos são hiperêmica com uma mucosa espessada e aumento de peso em comparação com os controlos (Fig. 1A-D). Histologicamente, tanto intestinos grosso e delgado exposição marcada alterações proliferativas, formação cripta ectópica, e formação de pólipos (Fig. 1C-D). Houve um aumento significativo na Ki-67 em ambos os intestinos delgado e grosso, um marcador de proliferação (Fig. 2A-B). O aumento no número cripta sugere que estes ratos poderia ter expansão do compartimento de células-tronco intestinal [37].
(A) O
HMGA1
intestinos transgênicas são hiperemia com o aumento de peso em relação aos controles ( n = 7 em cada grupo;. P = 0,000000138 pelo teste t de Student) (B) número de pólipos nos transgénicos e controlos (n = 7 em cada grupo; p = 0,000426 pelo teste t de Student). Os spreads intestinais (painéis da direita) são coradas com 1,5% de azul de metileno para acentuar pólipos para contar. (C) hematoxilina e eosina do intestino delgado e grosso mostra marcado alterações proliferativas nos transgênicos (bar = 50 mm). (D) Ampliação da zona proliferativa resultando em uma aparência difusamente hiperplásico da mucosa e criptas cystically dilatados nos transgênicos. O ponto de vista de energia mais elevada da mucosa do intestino delgado mostra formação de ectópica focos de criptas (setas).
(A) Ki-67 coloração dos intestinos delgado e grosso de
HMGA1
transgênicos ( painéis inferiores) e ratos de controle (painéis superiores) mostram um aumento significativo de Ki-67 imunorreatividade no
HMGA1
transgênicos (20 × ampliação). Ki-67 células positivas em (B)
HMGA1
ratinhos transgénicos e de controlo foram enumerados em criptas do intestino delgado e grosso a 20 × ampliação. A média ± o desvio padrão de Ki-67 células positivas por cripta para 100 criptas para cada par de ratos em cada local são mostradas. Altamente diferença significativa foi demonstrada entre transgênicos e controles em ambos os intestinos delgado e grosso (p 0,00001, teste t de Student) (C)
HMGA1
expressão foi avaliada pela qRT-PCR e aumento na primária, de alta grau de adenocarcinomas do cólon (3-4 grau) em comparação com o tecido do cólon adjacente, normalmente.
β-actina
foi usado para controlar o carregamento e o tecido normal foi arbritrarily atribuído um valor de 1,0. (D) Análise de Western blot para HMGA1 e controlo da proteína (GAPDH) foi realizada em 3 tumores com amostra suficiente e mostrou aumentar com a diminuição da proteína HMGA1 diferenciação e aumentando a capacidade de invasão ou metástase Frank. A nota, estado de diferenciação, invasão e presença de doença metastática são indicados.
HMGA1
é enriquecido em carcinomas do cólon humano
Altos níveis de proteína HMGA1 ou mRNA foram relatados em linhas celulares de cancro do cólon ou tumores primários em um pequeno estudo-piloto [38]. Para determinar se
HMGA1
é abundante em estudos maiores de cancros do cólon primários, nós interrogado gene análise do perfil de expressão dos cancros do cólon primários a partir de seis estudos independentes através do banco de dados público Oncomine ™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Descobrimos que
HMGA1
é altamente enriquecido em adenocarcinoma de cólon em comparação com o tecido normal em 5/5 estudos anteriores. Em todos estes estudos, HMGA1 estava entre os top 10% dos genes enriquecido, e em 4 estudos, foi entre os top 1-3% dos genes enriquecidos. Em um piloto de 10 primário, de alto grau (grau III-IV) cancros do cólon (uma oferta generosa de Bert Vogelstein), verificou-se que a expressão HMGA1 foi aumentado na maioria das amostras de câncer de cólon (8/11) em comparação com o tecido normal adjacente de o mesmo paciente. Além disso, a expressão HMGA1 significativo de todos os tumores foi aumentado em 3 vezes em comparação com o tecido adjacente de controlo (Fig. 2C). Também avaliamos a expressão da proteína em um subconjunto de tumores de cólon primários com material suficiente e encontrou os mais altos níveis de proteína HMGA1 no alto grau, tumores metastáticos com níveis indetectáveis no tecido normal adjacente (Fig. 2D).
HMGA1 é necessária para o crescimento independente de ancoragem celular, migração, invasão e tumorigênese em células de cancro do cólon
para investigar o papel funcional da HMGA1 no câncer de cólon, que inibiu
expressão HMGA1
em dois cólon linhas celulares de cancro derivadas de pouco diferenciado (grau 4), cancros do cólon metastático (HCT116 e SW480), utilizando uma abordagem shRNA. A transfecção de células com um
HMGA1
shRNA vector resultou numa diminuição significativa, estável em proteínas HMGA1 (Fig. 3A), em que as células shRNA em comparação com células transfectadas com o vector de controlo. Descobrimos que knock-down de HMGA1 bloqueou o crescimento celular independente de ancoragem ou a formação de focos em agar mole, migração e invasão em ambas as HCT116 e células SW480 (Fig. 3B-C). Além disso, não há tumores formados em ratinhos nus após a injecção de células HCT116 com HMGA1 knock-down (10
5 ou 10
4 células), enquanto que os tumores formados a partir das células transfectadas com vectores de controlo (Fig. 3D). Não houve diferença significativa nas taxas de crescimento nas linhas de células com ou sem HMGA1 knock-down
in vitro
(Fig. S2), indicando que o
HMGA1
shRNA não era tóxico para o cólon células cancerosas. Estes resultados demonstram que impulsiona HMGA1 propriedades celulares necessários para a iniciação, tanto tumoral (crescimento celular independente de ancoragem, tumorigénese) e a progressão do tumor (a migração, invasão).
(A) transfecção com um vector de knockdown shRNA para
HMGA1
em células altamente agressivos, pouco diferenciados humanos com cancro do cólon (HCT116 e SW480) resulta em uma diminuição significativa na proteína HMGA1. (B) Migração e invasão foram avaliadas em controle (barras escuras) e HMGA1 knock-down (barras abertas) células cancerígenas do cólon (HCT116 e SW480). O gráfico apresenta a média ± o desvio padrão de 2 experiências efectuadas em triplicado. (P-valores determinados pelo teste t de estudante são mostrados). -Anchorage independente do crescimento (C) celular em agar mole no controle (barras escuras) e HMGA1 knock-down (barras abertas) células cancerígenas do cólon (HCT116 e SW480). Todos os focos de 50 mm foram contados. O gráfico de barras mostra a média ± o desvio padrão a partir de dois experimentos realizados em triplicado. (P-valores determinados pelo teste t de estudante são mostrados). (D) O quadro mostra que knock-down de formação de blocos HMGA1 tumor em diluições limitantes. A fotografia mostra ratinhos nus representante 4 semanas após a injecção de controlo ou HMGA1 knock-down em células HCT116 (10
5 /injecção). Nenhum tumor formado nas HMGA1 células knock-down.
propriedades de células-tronco dependente de HMGA1 em células cancerígenas do cólon
Porque
HMGA1
é enriquecida com células-tronco [ ,,,0],5] – [8] e causa mudanças no intestino do rato que pode ser consistente com a expansão no compartimento de células-tronco do intestinal, procurou-se determinar se
HMGA1
está envolvido em propriedades de células-tronco em células de câncer de cólon. Para este fim, avaliamos a formação colonosphere tridimensional nas linhas celulares de cancro do cólon com ou sem knock-down de HMGA1. Descobrimos uma diminuição significativa no número de células em colonospheres tanto a HCT116 e SW460 com HMGA1 knock-down comparação com os controlos (Fig. 4A). Estas descobertas indicam que é necessário para HMGA1 este fenótipo de células estaminais (crescimento tridimensional) em células cancerígenas do cólon. Ao limitar as experiências de tumorigenicidade de diluição, knock-down de HMGA1 bloqueou a formação de tumores, quando 104 ou 105 células foram injetadas, enquanto que os tumores formados nas células de controle. Os tumores formados em ambos os grupos de knock-down controle e se 106 células foram injetadas (Fig.3D). Estes resultados indicam que knock-down de HMGA1 esgota as células de tumor-iniciador.
(A) formação tridimensional colonosphere de controlo (barras escuras) e HMGA1 knock-down (barras abertas) de células cancerígenas do cólon (HCT116 e SW480). As esferas foram contadas após 10 dias. O gráfico apresenta a média ± o desvio padrão de 3 experiências feitas em triplicado. (P-valores determinados pelo teste t de estudante são mostrados). (B) focos metastáticos no fígado foram contadas 5 semanas após a injecção de controlo (barras escuras) ou células HCT116 HMGA1 knock-down (barras abertas) (1 × 10
5) nos baços de ratinhos nus. O gráfico de barras que ilustra a média ± o desvio padrão de focos metastáticos de duas experiências realizadas em triplicado. Os ratinhos injectados com células de controlo (barra preta) foram comparados com os ratos injectados com células HMGA1 knock-down (barras abertas; p-valores determinados pelo teste t de estudante são mostrados). (C) bruta de fotografias de focos metastáticos no fígado a seguir à injecção de células HCT116 em baços de ratinhos Jude. O fígado esquerdo é retirado de um rato representativo injectados com células de controlo; o fígado direito é retirado de um rato representativo injectados com células HMGA1 knock-down. Fotografias retratam fígados representativos de ratos que receberam células
HMGA1
knock-down controle ou. (D) O exame histológico dos fígados confirmou que os focos metastáticos são significativamente aumentada a partir dos baços injetados com células de controlo em comparação com HMGA1 células knock-down (Bar = 100 mm).
HMGA1 é necessário para progressão metastática no câncer de cólon
para determinar se HMGA1 é necessário para a progressão do tumor, foi utilizado um modelo pré-clínico para a progressão metastática no câncer de cólon [35]. células cancerígenas do cólon HCT116 foram injectadas directamente nos baços de ratinhos imunodeficientes e metástases no fígado foram avaliados após 5 semanas. Surpreendentemente, descobrimos uma diminuição acentuada na focos metastáticos no fígado de camundongos injetados com HMGA1 knock-down células (Fig. 4B-C). Estes resultados sublinham o papel crítico da HMGA1 na progressão metastática neste modelo.
HMGA1 induz a expressão dos genes EMT
TWIST1
e
Vimentin
Devido estudos recentes ligar EMT de epiteliais tronco propriedades das células [3] – [4], procurou-se determinar se HMGA1 regula genes EMT no câncer de cólon. Para este fim, foram avaliados os níveis de expressão de 11 genes previamente mostrados a desempenhar um papel importante em células EMT e iniciador cancro [4]. Nas células HCT116, descobrimos que ambos
TWIST1
e
Vimentin
foram significativamente reprimido em células com HMGA1 knock-down (Fig. 5A), indicando que HMGA1 induz a sua expressão. Em células SW480,
E-caderina
é sobre-regulada nas células batida para baixo, sugerindo que HMGA1 normalmente reprime sua expressão (Fig. 5B).
TWIST1
também foi reprimida significativamente nas células knock-down SW480, embora menos do que o observado nas células HCT116. Tomados em conjunto, os nossos estudos sugerem que HMGA1 promove a progressão do tumor através de redes de transcrição que facilitam a progressão metastática e um estado-tronco-like, pelo menos em parte, ao induzir o
TWIST1
e
Vimentin
, enquanto reprimindo
E-caderina
. É de notar que não houve alterações na morfologia celular ou tamanho nas células batida de deslocamento (Fig. S3), sugerindo que a sub-regulação de HMGA1 nestas células não é suficiente para induzir as alterações morfológicas consistentes com uma reversão para um estado mais epitelial quando cultivada como uma monocamada. Como observado anteriormente, houve alterações significativas nas características de crescimento quando cultivadas de uma forma independente de ancoragem ou após a implantação em ratinhos. A variação nos genes modulados por EMT HMGA1 nestas duas linhas celulares diferentes provavelmente reflecte o meio diferindo e potencial reprogramação nas células cancerosas com base nas alterações genéticas e epigenética subjacentes.
(A) em células HCT116,
TWIST1
, e
Vimentin
expressão de mRNA foram reprimidos por qRT-PCR nas células HMGA1 knock-down em comparação com células de controlo.
E-caderina
e outros genes EMT não foram afetados nessas células. (P-valores determinados por testes t do aluno são exibidas). (B) em células SW480,
Vimentin
é reprimida e
E-caderina
é induzida nas células com HMGA1 knock-down. (P-valores determinados por testes t do aluno são exibidas).
Discussão
câncer de cólon metastático é altamente letal e a incidência está a aumentar, particularmente em indivíduos mais jovens [1] – [2]. As terapias actuais são limitados pelo aparecimento de células de cancro metastáticas que são resistentes ao tratamento. Evidências recentes sugerem que estas células refratários desenvolver porque cooptar as redes celulares envolvidos no desenvolvimento embrionário e tornar-se capaz de metástase e fugir terapia [3] – [4]. O
HMGA1
oncogene foi recentemente identificada como um fator de transcrição chave enriquecida em células ES e tumores de alto grau com resultados pobres [3], embora a sua função nessas configurações permaneceu uma incógnita. Este gene é um membro da
HMGA
família de genes, que também inclui
HMGA1
[11] – [18] e
HMGA2
[31], [39] – [40]. Todas as proteínas são HMGA baixo peso molecular (grupo de proteínas assim alta mobilidade) pequenas, com um domínio de ligação de DNA AT-gancho que medeia a ligação a regiões ricas em AT no sulco menor de cromatina. HMGA1 e outras proteínas AT-gancho são pensados para funcionar por meio de modular a estrutura da cromatina e a expressão de genes [15] – [18], [41] – [42]. Aqui, mostramos pela primeira vez que
HMGA1
induz alterações proliferativas e formação de pólipos no intestino dos camundongos transgênicos. Além disso,
HMGA1
é necessário para limitar tumorigênese diluição
in vivo
juntamente com a formação colonosphere 3-dimensional
in vitro
, sendo que ambos são fenótipos característicos de células-tronco epiteliais. Além disso, inibindo
HMGA1
blocos de expressão não só propriedades de transformação envolvidas na iniciação do tumor (crescimento celular independente de ancoragem, a tumorigenicidade), mas também características celulares que promovem a progressão metastática (invasão e migração). Nós também descobrimos que
HMGA1
é necessário para progressão metastática para o fígado
in vivo
. Notavelmente, vários estudos recentes também mostraram que
HMGA1
é enriquecida em células estaminais normais, incluindo células estaminais embrionárias hematopoiéticas e [3] – [8], para além de cancros como tronco-pobremente diferenciadas, ou refractários [ ,,,0],8] – [32], sugerindo que HMGA1 ajuda a conduzir um estado-tronco-like, tanto no desenvolvimento normal e câncer.
HMGA1
também é altamente expressa durante a embriogênese, com expressão baixa ou indetectável em tecidos adultos mais diferenciadas [43].
Para determinar como HMGA1 orquestra progressão do tumor e haste fenótipos celulares, investigamos a expressão de genes que foram mostrados anteriormente ser importante na EMT, desenvolvimento, e as células de tumor do iniciador [4]. Em células HCT116, descobrimos que HMGA1 up-regula a expressão de ambos
TWIST1
e
Vimentin
. Em células SW480, HMGA1 também up-regula
TWIST1
, enquanto reprime
E-caderina
.
E-caderina
não se alterou nas células cancerígenas do cólon HCT116 com knock-down de
HMGA1
, o que poderia refletir silenciamento estável de
E-caderina
nestes mesenquimais, altamente linhas celulares de cancro do cólon metastático. As redes de transcrição regulados por HMGA1 provavelmente depende do meio celular e características genéticas e epigenéticas subjacentes.
Em resumo, os nossos estudos fornecem a primeira evidência ligando HMGA1 para propriedades celulares e redes de transcrição importantes em células-tronco, EMT, e progressão metastática no câncer de cólon. Embora seja necessário mais trabalho, estes resultados sublinham o papel de HMGA1 como um regulador chave na progressão tumoral e um estado-tronco, como em câncer de cólon e sugerem que a segmentação percursos HMGA1 poderia ser benéfico na terapia para o câncer de cólon. Porque
HMGA1
é enriquecida em células estaminais embrionárias, células estaminais de tecidos específicos, e praticamente todos os tumores agressivos estudados até à data, os nossos resultados são provavelmente relevante não apenas para diversos cancros humanos, mas também para o desenvolvimento normal.
Informações de Apoio
Figura S1.
HMGA1
expressão do transgene ao longo dos intestinos delgado e grosso na transgênicos (Tg) em ratinhos comparada com o tipo selvagem (WT) controles. qRT-PCR para
HMGA1
e o gene de controlo,
GAPDH, foi realizada a partir de tecido obtidas em todo o intestino delgado (duodeno, jejuno, íleo e) e no intestino grosso (cólon ascendente, um designado cólon, e do cólon descendente, cólon designado D) a partir dos ratinhos Tg e WT.
expressão HMGA1
no intestino TG é um aumento de 4 a 8 vezes superior ao observado nos ratinhos WT, que foi atribuído arbitrariamente um valor de 1. Todos reacções de qRT-PCR foram realizadas em triplicado e repetidas pelo menos uma vez
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s001
(TIF)
Figura S2. taxas
proliferação nas células HCT116 ou cancro do cólon SW480 com HMGA1 knock-down ou vetor de controle. taxas (A) crescimento das células HCT116 transfectadas com o HMGA1
HMGA1
shRNA vector de knock-down (quadrados vermelhos) ou vector de controlo (círculos azuis) mostram uma taxa de proliferação similar. Os desvios padrão são ≤10% e, portanto, não é visível. taxas (B) crescimento das células SW480 transfectadas com o vector de controlo (círculos azuis) ou
HMGA1
shRNA vector (quadrados vermelhos) apresentam uma taxa de proliferação semelhantes. Os desvios padrão são ≤10% e, portanto, não visível
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s002
(TIF)
Figura S3.
resultados HMGA1 knock-down em alterações nos genes de EMT, sem alterações na morfologia celular. (A) knock-down de HMGA1 em células HCT116 não resulta em alterações na morfologia celular ou diâmetro, em comparação com os controlos. (B) knock-down de HMGA1 em células SW480 não resulta em alterações na morfologia celular ou diâmetro, em comparação com os controlos. As fotografias foram tiradas de células vivas usando uma objetiva 10 ×; barra de escala, 100 mm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s003
(PPTX)