Abstract

Enquanto a inibição farmacológica da Akt quinase tem sido considerada como um anti promissora estratégia de cancro, a maioria dos inibidores de Akt que têm sido desenvolvidos são inibidores enzimáticos que têm como alvo a quinase local activo da Akt. Um outro evento de regulação celular chave para a activação de Akt é a translocação da Akt quinase para a membrana celular a partir do citoplasma, que é realizado através do domínio de homologia plecstrina (PH) da Akt. No entanto, os compostos que especificamente interage com o domínio PH da Akt para inibir a activação de Akt estão actualmente limitadas. Aqui, identificado um composto, lancemaside A (LAN-A), que se liga especificamente ao domínio PH da Akt quinase. Primeiro, a nossa análise de espectros de massa de Akt quinase celular isolado a partir de células tratadas com a LAN-A revelou que a LAN-A se liga especificamente ao domínio PH da cinase Akt celular. Em segundo lugar, observamos que a LAN-A inibe a translocação de Akt quinase para a membrana e ativação, assim, Akt, quando analisada pela fosforilação de vários alvos a jusante de Akt como GSK3β, mTOR e BAD. Em terceiro lugar, em um modelo de células co-cultivadas com células humanas de cancro epitelial do pulmão (A549) e fibroblastos primários de pulmão humanos normais, LAN-A restringe especificamente o crescimento das células A549. LAN-A também exibido efeitos anti-proliferativos em diversas linhas de células de cancro humano. Finalmente, no modelo de transplante de rato A549-luciferase, LAN-se um crescimento de células A549 eficazmente inibida com pouca toxicidade evidente. Com efeito, o índice terapêutico de LAN-A neste modelo de ratinho era 250, apoiando-LAN que A é um composto de chumbo potencial para o domínio PH de segmentação como um inibidor Akt anticanceroso seguro

citação: Joh. EH, Hollenbaugh JA, Kim B, Kim DH (2012) plecstrina homologia do domínio da Akt quinase: a prova de princípio para altamente específico e eficaz não enzimática Anti-Cancer Target. PLoS ONE 7 (11): e50424. doi: 10.1371 /journal.pone.0050424

editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Julho, 2012; Aceito: 23 de outubro de 2012; Publicação: 26 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Joh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde A1077401 (BK), National Institutes of Health subvenção T32 DA07232 (JAH), e do Programa Universidade World Class através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia financiados pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia ( R33-2008-000-10018-0). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores gostariam de declarar que Baek Kim é um membro do Conselho Editorial PLOS ONE, no entanto, esta não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Um fenótipo célula de sobrevivência a longo prazo é estabelecido pela detecção de vários eventos celulares , e os mecanismos envolvidos no reconhecimento e entrega de sinais de stress são altamente conservados entre células de mamífero. A via PI3K /Akt é uma rede reguladora central que regula os acontecimentos celulares essencial para a transcrição, a sobrevivência celular [1], crescimento [2], a diferenciação [3], a migração [4], o metabolismo [5], e a angiogénese [6] . A desregulação da via PI3K /Akt é vulgarmente observado em muitos cancros humanos, permitindo a sobrevivência a longo prazo e excrescência [7], [8], [9]. Assim, os inibidores farmacológicos de segmentação esta via pró-sobrevivência foram extensivamente investigados como agentes anti-cancro potenciais [10]. Desde Akt é um regulador central que controla a actividade de vários alvos a jusante através da sua actividade de cinase, inibidores de Akt têm sido o foco de diversos estudos [10], [11], [12]. No entanto, a maioria dos inibidores da Akt que foram testados essencialmente como alvo a quinase sítio ativo ou sítio de ligação ATP da Akt [13], [14], [15], [16] e que apresentem potencial indesejadas efeitos fora do alvo para numerosos outros celulares quinases.

importante, para Akt quinase para tornar-se activado, a proteína tem de migrar a partir do citoplasma para a membrana celular em que o domínio NH

2-terminal de homologia plecstrina (PH) da Akt interage com PI3K. Uma vez que na membrana plasmática, cinase de 3-fosfoinositida-dependente constitutivamente activa 1 (PDK1), uma quinase a montante, activa Akt por fosforilação em Thr

308 seguido por uma fosforilação adicional em Sor

473, o qual pode ocorrer por mTOR -rictor complexo de [17], a proteína quinase Cp [18], ligados a integrina de quinase [19] e por autofosforilação [20]. O domínio PH pode ser encontrada em várias proteínas de sinalização intracelular e é precisa para viajar para vários compartimentos da membrana celular [21]. Este domínio também facilita a formação de dímero permitindo a função de ligação de lípidos que reconhece especificamente fosfoinositidos fosforilados [22]. Durante PI3K /Akt activação, PIP2 é fosforilado para PIP3 por PI3K, e, em seguida, a concentração de membrana de PIP3 elevada inicia a activação de PDK1 seguido pela translocação da membrana de Akt e activação da actividade de Akt quinase [22].

Diversas modelos de células de cancro e células que expressam oncogenes, que exibem um fenótipo citoprotector através da activação da via PI3K /Akt, têm sido utilizadas como sistemas de rastreio de potenciais inibidores de Akt [23], [24], [25]. Recentemente, estabeleceu um sistema único, à base de células anti-PI3K /Akt rastreio inibidor de [26], que emprega a expressão do vírus da imunodeficiência humana não oncogénicos (HIV-1) Tat. Ao contrário de outros oncogenes virais, tais como E1A de papilomavírus humano [27], taxa de vírus humano T de leucemia de células [28] e NS5A do vírus da hepatite C [29], o HIV-1 Tat não activar directamente a via de Akt. Em vez disso, parece regular negativamente PTEN, que é uma fosfatase que controla negativamente PI3K, baixando a concentração PIP3 na membrana celular [30]. Devido à actividade de regulação negativa PTEN, expressão Tat em uma linha de células microgliais humana (CHME5) confere um fenótipo elevada proteção celular durante citotóxica tratamento LPS [31]. Este fenótipo citoprotector do sistema baseado CHME5-Tat foi recentemente usada para o rastreio e identificação de compostos anti-PI3K /Akt que aboliram o fenótipo citoprotector induzida por Tat [26]. Mais interessante, estes compostos alvo diferentes passos da via PI3K /Akt, Akt validar o inibidor da via de capacidade de PI3K /rastreio do sistema [26].

Aqui, caracterizado lancemaside A (LAN-A), que foi um dos vários compostos anteriormente identificados pelo sistema CHME5 expressando Tat a partir de bibliotecas que abrigam pré-seleccionados compostos não-tóxicos [26]. Neste estudo, LAN-A foi investigada pelo seu mecanismo de acção anti-Akt, efeito selectivo anti-cancro

In vitro

, e efeito anti-cancro num modelo de ratinho. Com efeito, LAN-A se liga exclusivamente ao domínio PH da cinase Akt celular, inibe a translocação da Akt quinase, que é essencial para a activação de Akt, e exibe anti-proliferação /efeitos anti-cancro num modelo de ratinho com um grande índice terapêutico quais resulta da natureza não-tóxicos deste composto

Materiais e Métodos

cultura linhagem celular de câncer e medição de citotoxicidade

o A549 (carcinoma de pulmão humano;. KCLB No. 10185), KATO III (carcinoma gástrico; KCLB No. 30103), MCF-7, (carcinoma da mama; KCLB No. 30022) foram adquiridos a partir da linha celular banco Coréia (Seul, Coreia) em 2010-11-25. A linha celular A549-Luc-C8 foi comprado de Caliper Lifescience (Hopkinton, MA, EUA) em 2011/04/20. Todas as linhas celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com soro inactivado pelo calor 10% de vitelo fetal, 2 mM de L-glutamina, e piruvato de sódio 1 mM, numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células por poço, 24 h antes da adição de compostos. Os compostos foram solubilizados em 100% de etanol e, em seguida, adicionado, nas concentrações indicadas. Após 24 h de incubação, as células mortas foram avaliadas utilizando citometria de FACS (fluxo Accuri C6 citómetro, Accuri). Todos os estudos foram realizados em triplicado.

Co-cultura de células primárias e tumorais

Para a cultura diferentes pares de tipos de células, o meio do tipo de célula primária, não a linha de células de tumor, foi usava. Para a co-cultura de fibroblastos de pulmão humano e do epitélio do pulmão de células de tumor A549 linha-Luc-C8, as células foram cultivadas em meio essencial mínimo (Invitrogen) contendo soro bovino fetal a 10%. As imagens foram tiradas às 0, 6, 12 e 24 h pós-tratamento utilizando um microscópio de fluorescência (Zeiss).

Immunoblot análise

Os extractos de sobrenadante de células preparados a partir de macrófagos foram separados por 10% SDS -Página e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com proteínas sem gordura de leite em pó 5% em PBST 0,05%, então sondado com anticorpos. Após lavagem com PBST, as proteínas foram detectados com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 50 min. As bandas foram visualizadas com o reagente de quimioluminescência aumentada (ECL).

Análise de Lancemaside A e Akt ligação usando MS /MS

células A549-Luc-C8 foram cultivadas em placas de 6 poços em meio RPMI 1640 meio com ou sem lancemaside Um durante 2 h. As células foram lisadas com 300 ul de tampão de lise por cada prato de cultura de 100 mm. Os lisados ​​(3 ml) foram suplementadas com 9 ml de tampão NET [Tris-HCl 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, e 0,05% de NP-40] e incubou-se durante a noite a 4 ° C com 10 ul de Akt ou anticorpo β-actina (200 ug /ml). Para precipitar os complexos imunes, os lisados ​​foram incubados com 50 ul de proteína A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz, L. A., E.U.A.) durante 1 h a 4 ° C. complexos de Bead-ligadas foram lavadas três vezes com tampão NET frio e desnaturados durante 5 minutos a 100 ° C, centrifugou-se e detectados utilizando o sistema de MS /MS como descrito anteriormente [32]. Ionização por electrospray espectrometria de massa (ESI-MS) e em tandem MS /MS foram realizadas num LCQ Deca XP MS (Thermo Finnigan, CA, EUA) equipado com uma fonte iónica de electrospray. Todos os parâmetros do analisador ion trap foram optimizadas de acordo com as instruções do fabricante. Em experimentos de massa, a tensão de pulverização foi de 4,5 kV em modo positivo e 4 kV no modo negativo sob N fluxo de gás

2 bainha em 50 unidades arbitrárias. A temperatura capilar foi mantida a 275 ° C. Dois microlitros de amostras foram injectadas na coluna. foram obtidos Total de cromatogramas de iões de

m /z

150 a 2000 em modo negativo ESI. Por espectrometria de massa em tandem, o tempo máximo de injecção de iões, o tempo de activação, e a largura de iões isolado foram definidas a 500 ms, 30 ms e 2,0 Th, respectivamente. A energia de colisão com hélio foi definido para 30% da frequência de rádio (5 V) aplicada ao analisador ion trap.

A actividade anti-tumor no modelo de xenotransplante tumoral ratinho nu

A549- luc-C8 células foram recolhidas, ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato, e injectados subcutaneamente na perna esquerda (10

6 células /pé) de ratinhos nus do sexo feminino de idade de 8 semanas, conforme relatado anteriormente [33]. Quando os tumores atingiram cerca de 50 mm

3, os animais foram randomizados e doseados oralmente com 5, 10 e 20 mg /kg /dia lancemaside A ou veículo (0,2 ml de 10% de Tween 80) 6 dias por semana. Cada grupo consistia em 9 ratos. Lancemaside A foi suspenso em 10% de Tween 80. Os tamanhos dos tumores foram medidos cada 3-4 dias depois de atingir 50 mm

3. Finalmente, intraperitonealmente injectado reagente luciferina (150 mg /kg, Caliper Lifescience) após a administração final de lancemaside A e os tamanhos do tumor medidos por

In vivo

imagiologia luminescência.

In vivo

luminescência de imagens foi realizada utilizando Maestro In Vivo Imaging System Multispectral (Woburn, MA, EUA). Os dados foram quantificados com o software Maestro (versão 2.10.0, CRI Inc.) usando contagens de fótons absolutos.

células A549 humanas transfectadas com vetores GFP PH-GFP ou

O A549-luc- C8 células foram transfectadas com GFP-PH ou vector GFP e foram cultivadas em placas de 6 poços em meio RPMI 1640 com ou sem lancemaside a (1 | iM) durante 100 min. As células foram lisadas com 300 ul de tampão de lise por poço. Os lisados ​​foram suplementadas com 5 ml de tampão NET [Tris-HCl 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, e 0,05% de NP-40] e incubou-se durante a noite a 4 ° C com 10 ul de anticorpo GFP (200 ug /ml). Para precipitar os complexos imunes, os lisados ​​foram incubados com 50 ul de proteína A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz, L. A., E.U.A.) durante 1 h a 4 ° C. complexos de Bead-ligadas foram lavadas três vezes com tampão NET desnaturado frio e durante 10 minutos a 100 ° C antes de ser centrifugado para remover os detritos. Os sobrenadantes foram evaporados à secura e ressuspensa em 50 ul de MeOH.

Resultados

que anteriormente tinha identificado LAN-A, tal como uma via anti-PI3K /Akt inibidor usando uma linha de células expressando Tat de HIV CHME5 [26]. Nós, em primeiro lugar, examinada a capacidade de LAN-A para inibir esta via em várias células de tumor diferentes. Como mostrado na Figura 1A, o aumento das concentrações de LAN-A sobrevivência celular reduzida em A549 (células epiteliais adenocarcinoma), KATO III (de células de carcinoma gástrico) e as células de uma forma dependente da dose MCF-7 (células de carcinoma da mama), o que leva às diferenças significativas em comparação com células de controlo (não tratadas) com tão pouco quanto 2 ^ M de fármaco. A 20 uM de LAN-A, a mais elevada concentração utilizada, foi detectada uma redução superior a 60% na viabilidade para todas as três linhas de células. Além disso, a análise de Western blot confirmou a redução nos níveis de pAKT para as três linhas de células (Figura S1). As células A549-C8-luc também foram utilizados para este estudo e confirmou-se que o tratamento de LAN-A também causou uma redução comparável em viabilidade celular (Figura 1B). As células A549 têm uma morfologia redonda tal como mostrado na Figura 1B painéis de fundo, que é uma importante consideração quando se examina as experiências de co-cultura (abaixo).

A549, Kato III e (A) células MCF-7 foram tratados durante 24 h na ausência ou na presença de diferentes concentrações de LAN-a. Após o tratamento, as células foram recolhidas e as células vivas foram determinados por análise de FACS. (B) As células A549-Luc-C8 foram tratadas com 5 e 10 uM de LAN-A durante 24 h. Imagens mostram menos monocamada confluente de células com LAN-Um tratamento. A viabilidade celular foi determinada e representada graficamente valores relativos em comparação com a das células de controlo (100%). análise de variância foi realizada em conjuntos de dados, e as diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo de controle são indicados com asteriscos (* =

p Art 0,05).

Para validar ainda mais LAN-A como um /inibidor da via do Akt PI3K em células A549, análise de western blot foi realizada para o estado de fosforilação de vários alvos a jusante: PDK1, Akt, PTEN, GSK3β, IKK-a, mTOR e proteínas ruim. Como mostrado na Figura 2A-E (e Figura S2), a fosforilação de Akt e alvos a jusante de Akt quinase: p-GSK3β, p-mTOR, p-BAD e-p-IKK α foram significativamente reduzidos de uma forma dependente da dose com a LAN -A tratamento. No entanto, LAN-A terapêutica não levar à redução dos níveis celulares de PTEN (Figura 2F), p-PDK1 (Figura 2G) ou PI3K (Figura 2H). Além disso, LAN-A reduzida actividade de PI3K em células A549 (Figura S3) e o tráfico de Akt inibe para a membrana plasmática (Figura S4). Estes resultados são consistentes com os resultados publicados [26] que a LAN-A é um /Akt inibidor da via PI3K.

células A549 (A) foram deixados sem tratamento ou tratada com 5, 10 ou 20 uM de LAN-A durante 24 h. análise de Western blot foi realizada em lisados ​​celulares (Suplementar Figura 2) e indicou uma redução na fosforilada Akt (Ser

473). (B-E) Análise da Akt alvos a jusante é mostrado. Os níveis de fosforilação para GSK3β, IKK-α, mTOR e BAD foram examinados e são reduzidos nos grupos tratados LAN-A. (F) Cellular PTEN permaneceu constante com LAN Um tratamento. nível (G) Phospho-PDK1 permaneceu inalterada com LAN-Um tratamento. (H) PI3K nível manteve-se inalterado com a LAN-Um tratamento. conjuntos de dados foram feitas em duplicado. análise de variância foi realizada nos conjuntos de dados com * =

p Art 0,05, ** =

p Art 0,01 e *** =

p Art 0,001 .

em seguida, testamos se o-a LAN efeito citotóxico foi específico para células tumorais. Para este teste, foram co-cultivadas 1) MRC-5, um fibroblasto fetal primário humano do pulmão [34], e 2) A549-Luc-C8, células basais alveolares de adenocarcinoma humano epiteliais transduzidas para expressar luciferase [35], sob diferentes concentrações de LAN-a por 12 h (Figura 3A, em cima). células MRC-5 permaneceram viáveis ​​ao longo do intervalo de dose de LAN Um tratamento (Figura 3A; gráfico inferior), enquanto que as células A549-Luc-C8 mostrado morte significativa a 10 e 20 uM. Uma análise cinética utilizando 10 uM LAN Um tratamento a 0, 6, 12 e 24 h também foi realizado (Figura 3B, em cima). Mais uma vez, as células A549-Luc-C8 foram significativamente mais susceptíveis à morte celular, em comparação com células MRC-5 (Figura 3B, gráfico inferior). Mesmo depois de 24 h de tratamento LAN-A, as células MRC-5 permaneceram viáveis ​​enquanto que a viabilidade das células A549-Luc-C8 continuou a diminuir. Colectivamente, estes dados sugerem que a LAN-A mostra um efeito anti-câncer específica no modelo de co-cultura normal e células do cancro do pulmão humano.

(A) Imagens representativas para os diferentes grupos de tratamento foram capturados 12 h pós tratamento. (B) Imagens de três experiências independentes foram contadas manualmente para as células vivas /mortas para os diferentes grupos de tratamento. Os dados foram representados graficamente e mostra a percentagem de células vivas. teste t de Student foi realizado em conjuntos de dados para determinar diferenças significativas (* =

P

0,05). (C-D), as células co-cultivadas foram expostas a 10? M de LAN-A e, em seguida, monitorizadas para a morte celular em diferentes momentos após o tratamento. A morte celular foi determinada tal como descrito acima. Os dados são de três experiências independentes.

Em seguida, investigamos o mecanismo de LAN-A empregando uma série de tecnologias de espectro de massa ação. Para isso, as células A549 foram pré-incubadas com a LAN-A antes da lise e imunoprecipitação (IP) de Akt. Pull-downs foram analisados ​​utilizando análise espectral de massa. A Figura 4A mostra a análise por EM-IEP da LAN-A (padrão). A estrutura do composto é descrita e um perfil de rastreio com a LAN-A a MW 1190 é fornecida. Uma amostra IP Akt para células A549 LAN-A tratada foi analisada (Figura 4C), e mostrou um pico de LAN-A. Importante, as amostras de controlo, sem LAN Um tratamento de células A549 (Figura 4B) e IP β-actina com a LAN-Um tratamento (Figura 4D), não apresentaram picos para LAN-A interacção. Em seguida, para validar adicionalmente que a LAN-A interagiu com Akt, em tandem análise por MS /MS foi realizada. Nós anteriormente desenvolvido uma análise sensível de HPLC-MS /MS para a LAN-A (MW 1190) e seus derivados metabólicos, lancemaside X (MW 648) e ácido echinocystic (MW 472) [32]. O perfil de rastreio padrão de LAN-A é representado apenas na figura 4E, enquanto que a amostra IP Akt mostrado claramente os dois fragmentos de 648 e – MW MW 472 (Figura 4F). Estes dados mostram claramente que a LAN-A interage fisicamente com Akt no interior da célula.

(A), ionização por electrospray espectrometria de massa (ESI-MS) da LAN Um padrão mostrado. Uma LAN-molecular é mostrada a residir no MW 1190. análise ESI-MS de amostras de IP a partir de Akt não tratado (B) LAN-A células tratadas com (C) A549 são mostrados. (D) Análise de ESI-MS de IP β-actina a partir de células tratadas LAN-A é mostrado. (E) Análise de Tandem MS /MS de LAN-A mostra os dois fragmentos previamente identificados Lancemaside X (MW 648) e ácido echinocystic (MW 472) para a rede-A [32]. (F) Análise Tandem MS /MS para a amostra IP de Akt a partir de células tratadas LAN-A.

Temos anteriormente descrito que a LAN-A inibe a translocação de Akt a partir do citosol para a membrana plasmática ([26 ]; Figura S4). Portanto, postulamos que a LAN-A interage directamente com o domínio PH de Akt. Para testar isto, os vectores de fusão de GFP e de domínio PH-GFP foram usados ​​para transfectar células A549, seguida por IP de GFP. As amostras foram então processadas e analisadas por HPLC utilizando-MS /MS [32]. A amostra IP GFP (Figura 5A) produziu muitos picos, mas nenhuma foi específico para LAN-A (Figura 5B; padrão apenas). No entanto, a análise MS /MS da amostra PH-GFP IP produzidos os picos metabolitos derivados correta (MW 648 e MW 472) para LAN-A (ver também Figura 4E e F). Por conseguinte, estes dados de espectro de massa suportam um modelo no qual a LAN-A interage directamente com o domínio PH da Akt, que limita a migração de Akt e, subsequentemente, inibe a activação de Akt.

GFP e pH vectores domínio-GFP foram usados ​​para transfectar A549- e células Luc-C8 foram tratadas com 100 uM de LAN-a durante 1 h. IP contra GFP foi feito e as amostras foram analisadas por ESI-MS. amostra (A) IP GFP mostraram nenhum pico proeminente para LAN-A, (B), enquanto que amostra domínio PH-GFP PI teve o pico específico para LAN-A. (C) Para confirmar ainda mais este foi LAN-A, a análise em tandem MS /MS da amostra domínio de GFP PH IP mostrou dois fragmentos de LAN-A (ver também Figura 4E e F).

finalmente, testou-se o efeito de LAN-a no crescimento A549-Luc-C8 em um modelo do ratinho nu. Para este teste, células A549-Luc-C8 foram injectadas no pé esquerdo de ratinhos nus para estabelecer os tumores. Uma vez que o tumor atingiu 50 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente e tratados oralmente com 10 e 20 mg /kg /dia lancemaside A ou veículo (10% de Tween 80) 6 dias por semana. LAN-A tem um ED

50 = 4,09 mg /kg e LD

50 = 1 g /kg. Assim, o índice terapêutico é 250 (dados não apresentados). Os tumores foram medidos a partir de 10 dias a 45. Uma LAN-reduziu a taxa de crescimento do tumor de tratamento como descrito por volumes dos tumores reduzidas em comparação com o grupo controlo (Figura 6A). No dia 45, os ratos foram injectados IP com o reagente luciferina para

in vivo

imagiologia (Figura 6B).

In vivo

luminescência é maior para o grupo de controlo, em comparação com ambos os grupos de 10 ou 20 mg /kg de LAN-A. As intensidades relativas são mostradas de luminescência (

N

= 5). Os ratinhos foram sacrificados e os tumores removidos. volumes relativos foram determinadas e foram plotados (

n

= 9) para a massa do tumor (Figura 6C). Os tumores foram então coradas com anticorpos anti-pAkt e DAPI (Figura S5) e exibida uma LAN-se uma redução dependente da concentração de pAkt dentro do tecido de tumor. No geral, podemos concluir que LAN-A tem um efeito anti-tumoral

in vivo

.

Os volumes tumorais (A) foram medidos a partir dias 10-45 em ratinhos nus tratados com controlo (con) e 10 ou 20 mg /kg /dia de LAN-A (9 ratos /grupo). (B) No dia 45, os ratinhos foram injectados com o reagente luciferina para geração de imagens ao vivo luminescência. Intensidades Relativas de 5 ratinhos /grupo são mostrados, e a intensidade relativa indicadas foi comparada com a do controlo (controlo = 1). (C) Os ratinhos foram sacrificados e os tumores removidos. Os tumores foram medidos por Maestro

In Vivo Imaging System

Multispectral e volume relativo plotados. análise de variância foi realizada em conjuntos de dados, e diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo de controle são indicados com asteriscos (* =

p Art 0,05)

Discussão

Anteriormente, nós analisamos agentes anti-cancro potenciais, que apresentaram citotoxicidade mínima e alta abundância natural, utilizando a forte fenótipo citoprotector induzida pela expressão da proteína tat de HIV-1 [26], a qual foi observada em ambos os macrófagos humanos primários e um linha celular humana microglia [30], [31]. Entre os compostos rastreados, o tratamento com a LAN-A aboliu o fenótipo citoprotector induzida por Tat de células após tratamento com LPS CHME5 /CHX, enquanto LAN-A sozinho não induziu qualquer morte celular nas células de controlo não CHME5 expressando Tat [26]. Uma LAN-pertence à família química chamada saponinas, as quais são conhecidas por apresentarem propriedades anti-inflamatórias e anti-tumorais [33], [36], [37], [38]. LAN-A tem sido mostrado para inibir potentemente colite através de TLR-ligado a activação de NF-kB em ratinhos sem citotoxicidade detectável [39], [40].

Neste estudo caracterizar ainda mais o efeito anti-cancro de Uma LAN. experiências de co-cultura utilizando A549 e as células MRC-5 mostram que a LAN-A inibe especificamente a linha de células de tumor e não as células primárias. Este foi um resultado muito emocionante e sugeriu que LAN-A teve um efeito específico da célula cancerosa. Nós mostramos que o tratamento de células com LAN-A leva a uma redução na fosforilação da Akt, ainda p-PDK1, que é necessário para Thr

308 fosforilação, e os níveis totais de PDK1 não foram influenciados pela LAN-Um tratamento. Além disso, os alvos a jusante, incluindo p-GSK3β, p-mTOR, p-BAD e p-IKK-α foram reduzidas, enquanto que os níveis de PTEN e PI3K permaneceu inalterada (Figura 2). Colectivamente estes dados suportam as nossas descobertas anteriores de que a LAN-A inibe a activação de Akt [26].

Vários mecanismos diferentes para a inibição de Akt foram relatados. Primeiro, as drogas como a wortmanina, LY294002, PWT-458 [41] e PX-866 [42], [43], SF-1126 [44], IC87114 e TGX-115 [45] como alvo o efector de PI3K a montante, inibindo a geração de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, que ativa PDK1 levando a fosforilação de Akt e ativação. Outras drogas têm duplo direcionamento de PI3K e mTORC2, incluindo NVP-BEZ235 [46]. Vários medicamentos têm sido desenvolvidos que a atividade alvo PDK1. Ao contrário de PI3K, que tem várias isoformas, PDK1 tem apenas um único isoforma em seres humanos, tornando-o um alvo atractivo para a inibição. UCN-01 é uma tal droga em desenvolvimento [47]. A segunda fosforilação de Akt em Ser

473 é catalisada por mTORC2 [48] e pode ser inibida por rapamicina, temsirolímus, everolimus e deforolimus [49].

Akt tem três isoformas diferentes e vários grupos diferentes de Akt inibidores têm sido desenvolvidos. Um grupo de inibidores de: GDC-0068 (Genentech; [50]) e Akt Inhibitor IV (Millipore) como alvo o local activo da Akt ATP [51]. Um segundo grupo de inibidores de segmentar o domínio PH, conduzindo à ruptura da membrana de segmentação [52], [53]. Akt-I-1/2 são inibidor alostérico reversível sintético, que têm como alvo o domínio PH retê-lo num estado inactivo [54]. Perifosine é outra droga domínio PH de segmentação e inibe Akt, mTORC1 mTORC2 e [55].

Para determinar a especificidade da LAN-A, que desenvolveu anteriormente uma análise por HPLC-MS /MS específico para LAN-A [32 ]. Utilizando esta tecnologia, determinou-se que a LAN-A interage directamente com Akt através do domínio PH (Figura 5). Anteriormente foram examinados a administração oral de ratinhos com LAN-A e descobriram que a flora intestinal converte LAN-A em lancemaside X e, em seguida, em ácido echinocystic, que pode ser absorvida para a corrente sanguínea [32]. Nós podemos postular dos seus dados que o ácido echinocystic pode ser a estrutura metabólito mínimo de LAN-A necessária para a ligação do domínio PH da cinase Akt e inibição. Ambos lancemaside X e ácido echinocystic serão examinadas quanto à sua eficácia terapêutica no futuro. Além disso, a

In vivo

dados do rato são consistentes com os resultados de Jo

et ai.

[53], que mostra que a segmentação do domínio PH da Akt quinase é muito eficaz em retardar o crescimento tumoral.

tem havido extensa investigação para descobrir inibidores da via PI3K /Akt /mTORC2 [56], [57]. Muitos novos medicamentos têm de lidar com a toxicidade, proporcionando eficácia terapêutica. LAN-A proporciona uma baixa toxicidade e inibição do crescimento do tumor in vivo. Colectivamente, o nosso estudo valida por análise de espectro de massa que a LAN-A tem como alvo o domínio PH da Akt e fornece uma abordagem válida para a pesquisa continuada sobre esta droga anti-câncer.

Informações de Apoio

Figura S1.

análise Western blot de A549, KATO III e células MCF-7. (A) Apresentam-se Western blots representativos de sondagem para pAkt e Akt total, com e sem 10 jiM de LAN-A. (B) Os dados de dois experimentos independentes foi representada graficamente. análise de variância foi utilizada para determinar diferenças significativas e são indicados com asteriscos (*** =

p Art 0,001)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s001

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Figura S2.

análise de Western blot. Este é um compósito de um ou dois tipos de análise Western blots utilizado para gerar os dados para a Figura 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0050424.s002

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Figura S3.

ensaio PIP3. As células A549 foram pré-tratadas com o lancemaside A (Lan, 20 uM) ou wortmanina (W, 0,1 ^ M) durante 20 min. Em seguida, as células foram tratadas com LPS durante um adicionalmente 60 min. Os lisados ​​foram preparados utilizando um kit de extracção de proteína compartimental (Millipore, Bedford, MA, EUA) a partir de um número igual de células tratadas. Os lisados ​​de extracto de membrana foram analisadas por análise dot blot Western (Echelon, San Jose, CA, EUA) e visualizadas com anticorpo anti-PIP3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s003

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Figura S4.

Ensaio de translocação de membrana Akt. Nós expressa uma proteína GFP fundida com o domínio PH-da Akt, que é conhecido para a migração da membrana, em células A549-Luc-C8. Quando as células foram transfectadas com um plasmídeo que expressa a proteína PH-Akt-GFP, foi observada esta proteína de fusão por todas as células, mas principalmente localizada na membrana plasmática. Um tratamento LAN mostra o sinal de GFP foi movido para longe da membrana plasmática. Campo brilhante (BF) imagens estão na coluna da esquerda. Akt a localização da membrana de plasma foi visualizado pelo movimento da Akt-PH-EGFP utilizando um microscópio de fluorescência (Zeiss)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s004

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figura S5. A imuno-histoquímica de pAKT

dentro do tumor. A imunolocalização de pAkt foi analisado utilizando um procedimento de coloração de duas fases consistindo de incubação sequencial com anticorpos primários e secundários e com DAPI. As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência (Zeiss)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0050424.s005

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