Abstract

belinostat é um inibidor HDAC de classe hidroxamato que tem demonstrado atividade no linfoma de células T periférico e está em fase de ensaios clínicos para doenças malignas não hematológicas. Estudamos a farmacocinética de belinostat em doentes com carcinoma hepatocelular para determinar a principal via de metabolização da belinostat. A farmacocinética do belinostat em pacientes com cancro do fígado foram caracterizados por uma rápida depuração no plasma de belinostat com o metabolismo extenso com mais do que 4 vezes maior exposição sistémica relativa do metabolito principal, glucuronido belinostat do que a de belinostat. Houve significativa variabilidade interindividual da glucuronidação belinostat. A principal via de metabolismo envolve glucuronidação mediada pela UGT1A1 e uma boa correlação foi identificada entre a formação belinostat glucuronido e glucuronidação de substratos UGT1A1 conhecidos. Além disso, microssomas de fígado abrigar UGT1A1 * 28 alelos têm menor atividade glucuronidação para belinostat comparação com aqueles com UGT1A1 tipo selvagem. A principal via metabólica da belinostat é através de glucuronidação mediada principalmente por UGT1A1, uma enzima altamente polimórficos. O significado clínico deste achado ainda a ser determinado

Registro de Estudos

ClinicalTrials.gov NCT00321594

Citation:. Wang LZ, Ramírez J, Yeo W, Chan M-YM , Thuya WL, Lau J-YA, et al. (2013) glucuronidação por UGT1A1 é o dominante Caminho do Metabolic Disposição de belinostat no fígado pacientes com câncer. PLoS ONE 8 (1): e54522. doi: 10.1371 /journal.pone.0054522

editor: John Lucas, Johnson Johnson Medical, China

Recebido: 02 de agosto de 2012; Aceito: 12 de dezembro de 2012; Publicação: 30 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi patrocinado pela Fundação Nacional de Pesquisa de Singapura (Experimental Therapeutics Program) e do Conselho Nacional de Pesquisa médica de Singapura (NMRC /CSA /021/2010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Por favor note que belinostat é um produto TopoTarget. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

inibidores da deacetilase

histonas (HDACIs) têm sido demonstrado que têm atividade anticancerígena em células malignas através acetilação de histonas e proteínas tanto não-histonas. A acetilação de histonas medeia modulação epigenética de genes que podem induzir apoptose, inibem o crescimento celular e reduzem a neoangiogénese [1] – [7]. Vários HDACis ter sido aprovado para o tratamento de linfoma de célula T cutâneo periférica ou [8] – [10]

belinostat é um inibidor da desacetilase de histona pan-base de ácido hidroxâmico em desenvolvimento clínico como uma terapia anti-cancro no. uma gama de doenças malignas hematológicas e sólidos, tanto como agente único, assim como terapias de combinação [11] – [18]. Atualmente belinostat foi concedida via rápida e designação de medicamento órfão por os EUA Food and Drug Administration para o tratamento de linfoma de célula T periférica recidiva ou refractário. Embora clinicamente a droga tem sido relativamente bem tolerada, os eventos adversos comuns incluíram fadiga, náuseas e vômitos e letargia, alcançando o grau 3 na dose máxima tolerável de 1200 mg /m

2 dadas em 30 minutos (min) infusões para 5 dias consecutivos cada 3 semanas. Belinostat está disponível em ambas as formulações orais e intravenosas, e que a droga deverá ser administrada numa base crónica, as toxicidades cumulativas são possíveis. Por isso, seria importante para determinar o metabolismo de belinostat, para compreender a sua

in vivo

disposição. Até agora, muito pouco se sabe sobre as vias metabólicas de belinostat

Outros membros dos inibidores HDAC de classe do ácido hidroxâmico como vorinostat e panobinostat sofrem metabolismo primário por glucuronidação [19] – [21].. Por outro lado, Romidepsin, um inibidor de HDAC de classe tetrapéptido cíclico, sofre um metabolismo de CYP3A4 principalmente por [22]. Portanto, a hipótese de que a glucuronidação seria a principal via para o metabolismo de belinostat. Além disso, muitas isoformas glucuronosil-transferase são altamente polimórfico e função de impacto, por exemplo, deleção homozigótica de alelos UGT2B17 (UGT2B17 * 2) resulta em metabolismo deficiente de vorinostat [23]. Por conseguinte, seria importante para identificar a principal isoforma metabolizadoras de medicamentos de belinostat, para compreender melhor a influência de farmacogenética na variabilidade interindividual da farmacodinâmica belinostat. Isso também fornece orientação para estudos de interacção medicamentosa.

Neste estudo, nós estudamos a farmacocinética de belinostat e identificados os seus metabolitos com base no espectro de massa e de absorção de UV máxima. Identificou-se a metabolito dominante de belinostat como glucuronido belinostat, e ainda mais estudada a glucuronidação do belinostat utilizando um painel de isoenzimas UGT e microssomas de fígado humano, para determinar a isoforma principal responsável pelo seu metabolismo. Finalmente, o potencial de influência farmacogenética na farmacodinâmica da belinostat foi explorada

Materiais e Métodos

O protocolo para este ensaio está disponível como informação de apoio.; veja Protocolo S1.

Reagentes

belinostat (PXD101) foi um presente do National Cancer Institute (Bethesda, MD, EUA). Belinostat glucuronido (belinostat-G) foi cromatograficamente separados por HPLC-UV e isolada a partir de plasma humano, utilizando um colector de fracções. A sua estrutura química e pureza foi verificada por meio de LC-MS /MS (API 4000 triplo quadrupolo-espectrómetro de massa; AB Sciex, Concord, Canadá) e análise por HPLC-UV. Vorinostat glucuronido (vorinostat-G), o padrão interno, foi um presente da Merck Sharp Dohme (IA) Corp. O acetonitrilo (grau HPLC), metanol (grau HPLC), etanol (grau analítico), ácido fórmico (grau analítico), di-hidrato de hidrogeno-fosfato de di-sódio (Na

2HPO

4,2H

2O) e ácido ortofosfórico (85%) foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Direct-QTM água (Millipore Milford, MA, EUA) foi utilizado para a preparação da fase móvel. supersomas UGT Humanos e UGT REACÇÃO soluções A e B foram adquiridos a BD Gentest (San José, CA, EUA). Estes são cDNA expresso UGTs e um painel de 12 (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17) foi utilizado.

Preparação do fígado Microssoma Human

fígados humanos de 37 doadores caucasianos normais foram processados ​​no laboratório do Dr. Mary Relling no Hospital St. Jude Children Research (Memphis, TN, EUA) e foram fornecidos pelo Sistema de recolha de tecidos do fígado e Distribuição (financiado pela # N01- DK-9-2310) e pelo Cooperative Tissue Network humano. Os 37 microssomas de fígado humano (HLM) foram isoladas a partir de diferentes amostras de fígado com nenhuma correlação entre si. Microssomas foram preparados por centrifugação diferencial.

estudos de coorte

Este ensaio clínico de fase I multicêntrico de belinostat foi feito em Hong Kong e Singapura. Todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito de acordo com as orientações de boas práticas clínicas, e o protocolo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais de Prince of Wales Hospital, Hong Kong e Hospital da Universidade Nacional, Cingapura. Dezassete pacientes foram tratados com belinostat em doses crescentes de 600 (n = 3), 900 (n = 3), 1200 (n = 6), 1400 (n = 5) mg /m

2 por dia, por administração intravenosa (iv) perfusão durante 30 minutos durante 5 dias a cada 21 dias.

farmacocinéticas Avaliação

As amostras de sangue foram coletadas em pontos de tempo de amostragem predeterminados no dia 1 na pré-dose, 15 min, 30 min, 45 min, 1 hora (h), 1,5 h, 2 h, 3 h, 5 h e 24 h postinfusion e dia 5 em pré-dose, 30 min, 1 h, 1,5 h, 3 h, 5 h postinfusion e dia 22 após o início da 30 min iv perfusão num ensaio clínico de fase I de belinostat. Amostras de sangue venoso foram coletadas em tubos heparinizados. As amostras de sangue recolhidas foram centrifugadas a 3000 g durante 10-15 minutos e o plasma (sobrenadante) foi separada a partir da pelete de células e armazenadas em tubos limpos à temperatura de -80 ° C até análise. As concentrações de belinostat e belinostat glucoronido foram quantificados por um método modificado de alto desempenho cromatografia líquida /espectrometria de massa [24]. Resumidamente, vorinostat-L foi usado como o padrão interno para belinostat-L. O espectrómetro de massa foi operado em modo de ião positivo com as transições de massa óptimas de belinostat-L:

m /z

495 93 e vorinostat-L:

m /z

441 232, respectivamente . O método analítico foi validado bem com boa linearidade (coeficiente de determinação, r

2≥0.999) na gama de 1-100 uM para belinostat-L.

Identificação de Metabolitos belinostat e isolamento de Belinostat- G

triagem metabolito em amostras de doentes foi processado com HPLC-UV a 268 nm, o comprimento de onda máximo de absorção de belinostat. separação da linha de base de todos os analitos foi alcançado no

18 (× 2,1 mm, de 150 mm 5 mm) coluna Alltima C. Fase móvel o solvente A foi 20 mM de Na

2HPO

4 (pH 4,2, ajustado por ácido ortofosfórico), enquanto a fase móvel do solvente B composta por 70% de acetonitrilo e 30% de metanol (v /v). Um programa de gradiente de fase móvel foi usado – percentagem inicial de solvente A foi 75% (v /v) e o de solventes B era de 25% (v /v); percentagem de solvente B foi aumentada para 95% (v /v) durante 13 min e imediatamente comutada de volta para 25% (v /v) durante 7 minutos antes da injecção da amostra seguinte. tempo total de execução de cada amostra foi de 25 min. A taxa de fluxo foi mantida a 0,5 mL /min.

possíveis metabolitos belinostat foram adicionalmente verificadas com um espectrómetro de massa em tandem em exames Q1, produtos e precursoras. O isolamento e purificação do principal metabolito da belinostat foi realizada em um Nova-Pak 3,9 × 300 mm coluna C18 (Waters, Irlanda), utilizando tampão de 20 mM de acetato de amónio (pH 5,0) e 100% de metanol em uma composição da fase móvel inicial de 60% :40% (v /v) com um caudal de 0,6 mL /min. O metanol foi aumentada para 95% ao longo de 10 min e imediatamente comutada de volta para 40% durante 6 minutos antes da injecção seguinte. P-glucuronidase hidrólise e espectrometria de massa (tanto no modo positivo e negativo) para averiguar a pureza ea identidade do metabolito principal.

Acidic Teste de Estabilidade para belinostat-G

1 mg /mL de belinostat -G e vorinostat-G foi preparado em vários veículos com diferentes valores de pH. Estes veículos incluiu 10 mM de acetato de amónio (pH = 6,5), formato de amónio 10 mM (pH = 6,0), ácido acético a 0,1% (pH = 3,2) e 0,1% de ácido fórmico (pH = 2,6). Todas estas amostras de teste foram incubadas a 37 ° C durante 24 h. Água Milli Q (pH = 5,5) foi utilizado como solução de controlo que foi armazenado em -20 ° C. Todas as amostras foram analisadas por LC-MS /MS para obter os valores de área de pico para belinostat-G e G-vorinostat. A estabilidade ácida de ambos os compostos conjugados foi avaliada através da comparação da proporção de amostras de teste versus controlo de pico área.

In Vitro

Potência Avaliação em belinostat e belinostat-G

Para determinar a presença ou ausência de actividade dependente da dose de belinostat e belinostat-L contra as células de cancro hepatocelular, carcinoma de células humanas do fígado hepatocelular (HepG2) foram semeadas em duas placas de 24 poços a 10.000 células por poço. Para uma placa, foram adicionados 5 concentrações diferentes de belinostat obter 2 replicados por concentração (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 uM). Para a outra placa, iguais concentrações molares de belinostat-G foram adicionados de forma semelhante. Após 72 h, as células foram coradas com violeta de genciana tinta (0,5% w /v; B.P.) e avaliadas quanto a viabilidade. Além disso, as sensibilidades de HepG2 para belinostat e belinostat-G foram quantitativamente medida utilizando o ensaio MTS. Em resumo, as células HepG2 semeadas em placas de 96 poços a 3000 células /poço foram tratados com doses diferentes de sete belinostat ou belinostat-G e, em seguida, avaliados para a inibição do crescimento com a Promega CellTiter 96® AQ

ueous Ensaio de Proliferação de Células não radioactivo . Após incubação de 24 h, solução de fármaco 100 pL ou médio-em branco foi adicionado em cada poço de placas de 96 poços. 72 h mais tarde, 20 ul de MTS /PES foram adicionados em cada cavidade para uma incubação durante 3 h. Os valores de DO são medidos no comprimento de onda de 490 nm. inibição do crescimento celular foi calculado com base nas unidades luminescentes com subtração de leitura de fundo para poços único meio que contém. A inibição do crescimento foi definida como a percentagem das unidades luminescentes médios de poços tratados com droga ao longo do que a partir de poços de controlo sem tratamento. A experiência foi realizada em triplicado. IC

50 valores foram calculados utilizando o software GraphPad PRISM (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA).

Western Blotting

Para a análise de Western Blot, as células HepG2 tratadas com belinostat foram colhidas e lisadas em tampão de lise celular contendo Tris HCl 50 mM, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) e cocktail de inibidor de protease (Roche). As concentrações de proteína foram quantificados usando o ensaio de Bradford (Invitrogen). As proteínas foram separadas num gel de SDS-PAGE a 12% e transferida para membrana de nitrocelulose. A ligação de proteína não específica foi bloqueada por incubação com 5% de leite não gordo (BioRad Laboratories) em 0,1% PBS-Tween (PBST) à temperatura ambiente durante 1 h e incubou-se com anticorpos específicos, histona H3 e Ac-H3 [K9 /K14] (Cell Signaling), a 4 ° C durante a noite. Foram então adicionados adequados específicos para determinadas espécies peroxidises rábano conjugada com anticorpos secundários e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h, seguida por detecção utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare).

Rastreio de 12 UGT Humanos supersomas e Kinetic Analysis

A incubação típico consistiu em 50 ng de UGT, UDPGA 2 mM (UGT Reacção Solução A), 50 mM de Tris-HCl, MgCl 8 mM

2 e 0,025 mg /ml de alameticina (Reacção UGT Solução B) num volume de incubação final de 100 uL. Antes da adição do substrato, a mistura de incubação foi pré-aquecido e equilibrou-se durante 5 min a 37 ° C. As reacções foram iniciadas por adição da solução belinostat 10 uM em DMSO e incubou-se a 37 ° C durante 30 min; as reacções foram terminadas por adição de 200 uL de metanol arrefecido em gelo e agitação em vórtice. A mistura de incubação foi submetida a vórtice e centrifugadas (10060

g

) a 4 ° C durante 10 min, e os sobrenadantes foram analisados. microssomas de insetos sem cDNA UGT serviu como controle negativo. Os parâmetros cinéticos (

K

m e

V

max) da glucuronidação belinostat por supersomas UGT1A1 foram determinados utilizando concentrações de substrato de 10-750 mM. As incubações foram realizadas como descrito acima. Três experimentos independentes foram realizadas para análise cinética.

Estudo de Correlação com UGT1A1 Substratos, Gene UGT1A1 Expressão e UGT1A1 * 28 Polimorfismo

Em um estudo de correlação da glucuronidação de substratos belinostat e UGT1A1, glucuronidação belinostat foi medida como descrito acima usando 100 uM belinostat e HLM 50 ug; esta concentração de belinostat foi selecionado, pois está próximo ao Km de UGT1A1. A glucuronidação de bilirrubina, tiroxina e SN-38 nestas microssomas, medição da expressão do gene UGT1A1 e UGT1A1 para genotipagem * 28 foram previamente descritos [25] – [27].

Análise de Dados

belinostat-L velocidade de formação (

v

) foi calculada como cm, 30 min /tempo de incubação /concentração de CYP, em que CM, 30 min foi a concentração de metabólitos após 30 minutos de incubação. Parcelas de concentração de substrato, S (eixo X) versus

v

(eixo Y) foram então construídas. Km e Vmax foram calculados usando a equação de Michaelis-Menten (software GraphPad, Inc., San Diego, CA, EUA). (1)

Associação entre glucuronido belinostat substratos concentração e UGT1A1 foram realizados usando tanto de correlação de Pearson e (software GraphPad Prism, La Jolla, CA) testes de correlação de Spearman. Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados com base no modelo de análise não compartimental usando o software WinNonlin, versão 5.3 (Pharmsight, Sunnyvale, CA, EUA). exposição relativa de belinostat-G no plasma do paciente foi representada pela razão AUC concentração molar de belinostat-G ao longo belinostat. Uma análise de variância (ANOVA) foi utilizada para determinar a significância entre os genótipos com testes de Tukey post hoc para o ajuste para comparação entre os grupos individuais. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Farmacocinética e Metabolismo de belinostat no plasma humano

As concentrações de belinostat e belinostat-G em 17 pacientes. inscritos num estudo clínico fase I no carcinoma hepatocelular (HCC) foram quantificadas para a estimativa de parâmetros farmacocinéticos (Tabela 1). Belinostat seguido farmacocinética linear em doses entre 600 e 1400 mg /m

2, com maior variabilidade interindividual da depuração em doses mais elevadas. Os coeficientes de variação de depuração (CL) foram de 29,0% e 30,6% a 1200 e 1400 mg /m

2, respectivamente. Belinostat foi eliminado rapidamente após i.v. administração, devido à intensa fase II conjugação do glucuronido, M1 (Figura 1)

Cromatograma no dia 5 e dia 22 (A).; dia1 (B).

Cinco metabolitos de belinostat foram identificados através de comparação da absorção de ultravioleta (UV) de amostras de plasma a 268 nm antes e depois da dosagem. perfis de cromatogramas semelhantes foram detectados no dia 1 (Figura 1B) e 5 dias (Figura 1A). Os iões dos produtos de MS /MS destes cinco metabolitos monitorizados em modo positivo suportado a sua identificação estrutura química (Tabela 2). A glucoronidação foi a via mais importante do metabolismo belinostat; duas vias de biotransformação alternativas envolvidas metilação para belinostat metilo e redução do grupo hidroxâmico na sua amida correspondente belinostat. ácido belinostat e glicosídeo belinostat foram 2 outros metabolitos menores detectados. A via metabólica proposta de belinostat é indicado na Figura 2. As estruturas químicas destes metabolitos são propostos com base nas suas protonados picos de massa da molécula [M + H]

+, 2 vezes picos de massa da molécula [2M + H]

+ e perfil de fragmentação de massa gerada pela verificação do produto. Estas estruturas foram ainda confirmados pela análise dos iões de fragmentação de iões precursor, o qual revelou um ião comum produto (m /z 93, fragmento fenilamino) de belinostat e seus metabolitos cinco. Com base nas estruturas de metabolito, a porção Hidroxiamida é a estrutura chave para a potência de belinostat. A digitalização de m /z espectros a partir do plasma de pacientes com suporte de glucuronidação belinostat através da detecção de 495, 989, 493 representando o belinostat protonada L, protonada belinostat dupla L, e desprotonado belinostat L, respectivamente. A estrutura química da L-belinostat isolado a partir de plasma foi elucidada por espectrometria de massa. Uma série de espectros de massa de belinostat-G foram adquiridos a propor a estrutura química. Por exemplo, m /z 495 e m /z 989 foram identificados como os seus picos de massa molécula protonados [M + H]

+ e duas vezes picos de massa da molécula [2M + H]

+, respectivamente. Digitalizar no modo negativo detectado sua ion pai deprotonated correspondente como m /z 493 [M-H]

-. Um perfil de fragmentação massa similar em modo positivo foi encontrada, tanto para belinostat e belinostat-G. Com base no ião do produto comum (fragmento f enilamino), uma verificação de ião precursor de m /z 93 foi processado em belinostat e belinostat-G para derivar os seus iões parentais como m /z 319 [M + H]

+ para belinostat e m /z 495 [m + H]

+ para belinostat-L, respectivamente. Assumindo que esta era correcta, seria de esperar que as estruturas químicas dos seus metabolitos, para possuir espectros de UV semelhantes para esses metabolitos e o seu composto de origem, bem como devido à semelhança da sua estrutura molecular básica, e este foi suportada por UV análise espectral gerado pelo detector de matriz de diodo (DAD) mostrando comprimento de onda máximo semelhante a 268 nm para belinostat e os seus cinco metabolitos.

O principal metabolito foi identificado como belinostat-G que foi ainda confirmada através de reação de hidrólise enzimática. O belinostat-L isolado a partir de amostras de plasma dos pacientes foi submetido a

Escherichia coli-

derivado β-glucuronidase (6,8 mg /mL) a incubação durante 5 h, e a mistura reactiva resultante foi analisada por meio de LC-MS /MS. A análise farmacocinética quantitativa indicaram que a exposição belinostat-G foi 4 vezes mais elevada do que a de belinostat no plasma humano com base na razão da AUC concentração molar de belinostat-L /belinostat (Tabela 1). Assim, glucuronidação belinostat foi confirmada para ser a via metabólica dominante para belinostat.

Estabilidade da belinostat-G em ácida Ambiente

Para caracterizar ainda mais a glucuronidação da belinostat, foi testada a estabilidade ácida de belinostat -G. Belinostat-G e G-vorinostat, um controlo paralelo para belinostat-L, demonstraram ser estáveis ​​após 24 h de incubação a 37 ° C em várias soluções ácidas (pH 2.6- pH 6,5). A variação de concentrações medidas no início da experiência e após 24 h foi muito marginal ( 4%). Isto é consistente com a estrutura proposta O-conjugado de belinostat-G (M1) mostrado na Figura 2. No entanto, a degradação menor (7%) foi identificado somente quando o valor do pH foi reduzido para 2,6. Os resultados confirmaram belinostat é conjugado a glicurônicos na posição O, como O-glucoronidos mas não N-glucuronídeos de ácidos hidroxâmicos são estáveis ​​no ambiente ácido [28], [29]. Como vorinostat-G foi confirmada como sendo um glucuronido O-conjugado [30], que demonstram que o isolado belinostat-G é um metabolito O conjugado assim.

Determinação de

In Vitro

Efeitos citotoxicidade de belinostat e belinostat-L

a Figura 3A e 3B mostram os resultados de concentrações de aumento de dose de belinostat e belinostat-L conduzido em placas de 24 poços separadas após incubação durante 72 h. Como a concentração belinostat aumentou, o número de células viáveis ​​(violeta manchado) mostrou a diminuição da dose-dependente. Por outro lado, o aumento das concentrações de L-belinostat não pareceu afectar a viabilidade celular na gama de concentrações testadas. Como tal, em concentrações equimolares entre 0-10 uM, belinostat demonstra citotoxicidade significativa dependente da dose, enquanto belinostat-G não. Além disso, os resultados de ensaios de MTS foram também consistentes com a do ensaio de coloração (Figura 3c). acetilação das histonas H3 para a exposição belinostat demonstrou um tempo e aumento dependente da concentração (Figura 3d)

a:. incubação belinostat; b: belinostat-L incubação; (Modelos para concentrações adicionado (inferior) e os resultados das concentrações de doses cada vez maiores de 24 poços em células HepG2 (superior) C:. Resultados do STM para belinostat (IC

50 = 6,4 mM) e belinostat-G (não pode ser convergente) .. d: atividade acetilação belinostat em células HepG2 (western blot) a: acetil histona 3 aumentou com o incremento da dose após 5 horas de incubação; B: mudanças cinéticas de acetil histona 3 com incremento de tempo a 10 uM

In Vitro

Screening metabolismo de UGTs para a Formação belinostat-G e Enzyme Kinetics

UGT1A1 glucoronisado belinostat significativamente (Figura 4A), ao passo que não se observou metabolismo após incubação com UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 , UGT1A9, UGT1A10, UGT2B15 e UGT2B17. metabolismo menor (menos de 3%) foi detectado com UGT1A3, UGT1A8, UGT2B4 e UGT2B7. 73,6% e 89,4% de belinostat foi convertido belinostat-L após 2 h e 4 h de incubação com UGT1A1, respectivamente (Figura 4B). Enzyme parâmetros cinéticos para a glucuronidação do belinostat foram estimadas por ajuste dos dados agrupados dos UGT1A1 incubações realizadas em triplicado para a equação de Michaelis-Menten. Os valores aparentes de Km e Vmax para a formação glucoronido foram 99,6 uM e 353,1 pmol /min /mg de proteína, respectivamente (Figura 5). A folga intrínseca (Vmax /Km) para a formação de belinostat-G foi estimada em 3,5 mL /min mg proteína /. Nos microssomas de controlo de insectos, não foi observada formação belinostat-L.

Os valores aparentes de Km e Vmax para a formação glucoronido foram 99,6 uM e 353,1 pmol /min /mg de proteína, respectivamente.

correlação da glucuronidação da belinostat com UGT substratos

Em microssomas de fígado humano, a associação entre a glucuronidação da belinostat e substratos UGT foram testados usando paramétrico (correlação de Pearson) e não paramétricos (correlação de Spearman) testes. Belinostat-L formação fortemente correlacionada com a formação de bilirrubina glucurónido (Figura 6A) (Pearson r

2 = 0,53; Spearman r

2 = 0,61 p 0,0001) e outros substratos bem estabelecidos de UGT1A1 como tiroxina e SN38 (Pearson r

2 = 0,68; Spearman r

2 = 0,81 e Pearson r

2 = 0,82; Spearman r

2 = 0,62, respectivamente, todos p 0,001) (Figura 6B e 6C). concentrações belinostat-g após incubação com o HLM bem correlacionada com a expressão de ARNm UGT1A1 (Pearson, r

2 = 0,66, P 0,0001, Figura 7A). Tomados em conjunto, estes sugerem que a UGT1A1 é a isoforma UGT predominante na glucuronidação belinostat

A:. Bilirrubina-G; B: tiroxina-4-L /CPT-11; . C: SN38-G /CPT11

A: Correlação da formação belinostat glucuronido com expressão UGT1A1 em microssomas hepáticos humanos; B: formação de glucuronide belinostat por microssomas de fígado humano de acordo com o tipo selvagem, heterozigoto e homozigoto UGT1A1 * 28 genótipos

UGT1A1 Genótipo e glucuronidação da belinostat no fígado Microssomos Humana e Correlação com Gene UGT1A1 Expression

UGT1A1 é uma enzima polimórfica com variantes alélicas que influenciam a sua actividade enzimática. UGT1A1 * 28 é um polimorfismo frequente que reduz a atividade da glucuronidação. Por conseguinte, para determinar o efeito de UGT1A1 * 28 na formação de L-belinostat, medimos as concentrações belinostat-G após a incubação de belinostat com cada uma das 37 amostras anteriormente HLM genotipados para

UGT1A1 * 28

. Os pós-incubação concentrações belinostat-G 30 min (média ± SD) foram 15,39 ± 6,00, 11,35 ± 4,11 e 7,14 ± 3,28 nmol de UGT1A1 * 1 homozigoto, UGT1A1 * 28 heterozigotos e homozigotos microssomas, respectivamente. Uma análise ANOVA mostrou que foi detectada diferença significativa entre os grupos (p = 0,01). A análise post-hoc de Tukey sugeriu que apenas a diferença entre a UGT1A1 e UGT1A1 * 1 * 28 microssomas homozigóticos era estatisticamente significativa. Como mostrado na Figura 7B, UGT1A1 * 1 microssomas homozigotos tinha 2 vezes maior média das concentrações belinostat-G em comparação com UGT1A1 * 28 microssomas homozigotos após incubação (

p Art 0,001)

Discussão

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve a glucuronidação da belinostat. Nós demonstramos que belinostat sofre um extenso metabolismo através glucuronidação ocorrendo na porção hidroxamato, que conduz à inactivação da sua citotoxicidade. Isto é consistente entre os outros inibidores da HDAC de classe hidroxamato assim, a glucuronidação onde desempenha um papel significativo no seu metabolismo. O perfil metabólico após incubação com um painel de supersomas com superexpressão isoformas da UGT específicos, correlação com as taxas de glucuronização de substratos UGT1A1 conhecidos usando microssomas de fígado humano, e análise do perfil de espectrometria de massa de belinostat em uma coorte de pacientes com evidência de câncer de fígado, desde que glucuronidação belinostat

in vitro

e

in vivo

é mediado principalmente pela UGT1A1. Curiosamente, a isoforma da enzima que metaboliza principalmente vorinostat outro inibidor de HDAC com base hidroxâmico

In vivo

é UGT2B17, enquanto belinostat é metabolizado pela UGT1A1, que é uma isoforma mais abundante no fígado humano [31]. UGT1A1 está presente no tracto gastrointestinal, o que provavelmente reduziria a absorção oral de belinostat, e levar a biodisponibilidade reduzida [32]. Além disso, a alta eficiência da UGT1A1 para metabolizam belinostat provavelmente vai reduzir ainda mais a sua biodisponibilidade oral através de um extenso metabolismo de primeira passagem, o que representa um desafio para o desenvolvimento de belinostat oral.

Os inibidores de HDAC que estão em desenvolvimento clínico tem potencial para efeitos secundários graves. Alguns efeitos relacionados classe incluem trombocitopenia, longo intervalo QT no electrocardiograma, fadiga severa e os efeitos colaterais gastrointestinais, e estes parecem ser dependentes da dose. Belinostat tem sido associado com fadiga, diarreia e prolongamento do intervalo QT na fase I e II ensaios [11], [33]. Em vista de sua janela terapêutica estreita, é importante para determinar os fatores tais como farmacogenética de belinostat que representam a variabilidade interindividual da sua farmacocinética. Nós já mostrou que pacientes com alelos UGT2B17 excluídos têm menor vorinostat-glucuronido à relação de vorinostat área sob a curva e os efeitos colaterais maiores [20]. Por conseguinte, seria importante para entender a extensão da variabilidade interindividual da farmacocinética e farmacodinâmica belinostat atribuíveis a expressão polimórfica de UGT1A1. O nosso estudo em microssomas de fígado humano é o primeiro passo nesse sentido.

UGT1A1 * 28 é um polimorfismo genético na região promotora, onde uma repetição adicional TA está presente na caixa TATÁ que geralmente tem 6 repete TA, e resulta em expressão reduzida de UGT1A1 [34]. Em microssomas de fígado humano, a glucuronidação do SN-38, o metabolito activo de irinotecano, é menos eficiente em microssomas albergando UGT1A1 * 28 em relação à estirpe selvagem genótipo [25]. Concordante, os indivíduos com um ou mais UGT1A1 * 28 alelos experimentar maior risco de neutropenia do tratamento irinotecano com doses superiores a 250 mg /m

2 [35], [36]. Este polimorfismo é também mais comum nos caucasianos, asiáticos que, com uma frequência alélica de cerca de 30% em caucasianos e 10% em asiáticos [37]. Nossos dados mostram que a UGT1A1 * 28 está associado à redução da glucuronidação belinostat, o que sugere que os pacientes com esse genótipo pode, potencialmente, ter uma exposição superior ao belinostat ativo resultante de apuramento prejudicada de belinostat. Embora as conseqüências clínicas dessa maior exposição com a dose recomendada de belinostat são presentemente desconhecidos, são esperados efeitos tóxicos mais elevados para belinostat. Se isso for comprovado, genotipagem UGT1A1 antes da terapia belinostat, como está actualmente disponível para irinotecano, é uma maneira de individualizar a terapia.

Se UGT1A1 * 28 influencia a farmacocinética e mais crucialmente a farmacodinâmica do belinostat em pacientes continua a ser estudado; nossos dados suporta a necessidade de tais estudos futuros em pacientes.